实验二 急性毒性试验

石河子大学续页 （内容与进程） 实习二 经口急性毒性试验 一、原理和实验目的 急性毒性是指机体(人或实验动物)一次(或24小时内多次)接触外来化合物之后所引起的中毒效应，甚至引起死亡。了解一次或24小时内多次给予受试化学物后，动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死刑量(LD50)。 但须指出化合物使实验动物发生中毒效应的快慢和剧烈的程度，可因所接触的化合物的质与量不同而异。有的化合物在实验动物接触致死剂量的几分钟之内，就可发生中毒症状，甚至死亡。而有的化合物则在几天后才显现中毒症状和死亡，即迟发死亡。此外，实验动物接触化合物的方式或途径不同，“一次”的含义也有所不同。凡经口接触和各种方式的注射接触，“一次”是指在瞬间将受试化合物输入实验动物的体内。而经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次”是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化合物的过程，所以“一次”含有时间因素。 化学毒物经口染毒的是卫生毒理学中重要的基本技术之一，经口急性毒性试验是研究化学物毒性效应的基本试验。通过该实验学习化学物毒性试验的实验原则和掌握经口灌胃技术。 实验目的： 1.求出受试化合物对一种或几种实验动物的致死剂量(通常以LD50为主要参数)，以初步估计该化合物对人类毒害的危险性。 2.阐明受试化合物急性毒性的剂量－反应关系与中毒特征。 3.利用急性毒性试验方法研究化合物在机体内的生物转运和生物转化过程及其动力学变化，也可用于研究急救治疗措施。 二、内 容 1.健康实验动物的选择和性别鉴定。 2.实验动物称重、编号和随机分组方法。 3.受试化学物溶液的配制。 4.小鼠和大鼠灌胃操作技术。 5.毒性症状的观察和LD50计算。 石河子大学教案续页 （内容与进程） 三、试剂和材料 (一)实验动物健康成年小鼠或大鼠若干只。 (二)器材 注射器(O.25，1，2，5ml)、吸管(0.1，0.2，0.5，1，2，10m1)、容量瓶(10，25，50ml、烧杯(10，25，50ml)、滴管、灌胃针(大鼠、小鼠适用)、电子天平(感应量1／10000g)、动物体重秤、外科剪刀、镊子。 (三)试剂 受试化合物(由指导教师自定)，苦味酸酒精饱和液或其它染色剂 四、操作步骤 （一）健康动物的选择(见实习一)提问。 （二）性别鉴定(见实习一)提问。 （三）动物编号与分组 1.称重 大、小鼠秤的感应量需在0.1g以下。根据实验的不同要求．选择定数量的大、小鼠，体重要求在同一组内、同性别动物体重差异应小于平均体重的 10％，不同组间同性别动物体重均值差异应小于5%。急性毒性实验一般使用体重为18—25g的小鼠或／和150—240g大鼠。 2.编号(见实习一)提问。 3.随机分组(见实习一)提问。 (四)受试物的配制 1.受试化学物的量取 固体化学物采用称量法，液体化学物可用称量法或吸量法。 (1)称量法：将受试化合物放入已知重量的容器内称量。加溶剂溶解或稀释．倾入刻度容器(如容量瓶)内，混匀，再加溶剂至刻度。算出浓度mg/ml)备用。 (2)吸量法：依设计剂量计算出应吸取液态受试物的容积，加入容量瓶中，用溶剂加至刻度。计算为： 石河子大学教案续页 （内容与进程） 式中：X—应吸取受试物的容积(m1)； A—设计要求的受试物浓度(mg/ml)； v—容量瓶容积(m1)； d—受试化学物比密。 2. 受试化学物的稀释 (1)等浓度稀释法：将受试化学物配成一种浓度，此时各剂量组的实验动物将 给予不同体积的受试化学物。例如受试物配成1000mg／10m1的溶液，五个剂量组 的剂量分别为100、200、400、800、1600mg/ml，则各剂量组动物将依次给予 1.0ml/kg、2.0ml/kg直至最高剂量组的16ml/kg。 (2)等容量稀释法：按照事先设计的剂量分别稀释配制为几种不同浓度的受试物溶液，而各个剂量组的动物均给予相同单位体重体积的受试化学物。如上例的情况，将受试物分别配成100mg/10ml、200mg/10ml.....1600mg/10ml等5个浓度的溶液，各剂量组动物给予受试物的体积均为10ml/kg. （五）剂量分组 (一) 急性试验剂量分组 探讨外来化合物急性毒性应首先测定其半数致死剂量或浓度(LD50或LC50)。对一个未知毒性的外来化合物求其LD50(LC50)，应先做预试验。做预试验方法很多，这里仅介绍其中一种。 1.预试验：首先了解受试化合物的化学结构和其理化性质，确定其所属已知化合物或其衍生物的种类，有何特殊基团及其分子量、熔点、沸点、比重、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等，依此查阅文献，找出与受试化合物化学结构与理化性质近似的化合物的毒性资料，并以其LD50(LC50)值作为受试化合物的预其毒性中值；但应注意，一定是相同动物种系和相同接触途径。以此预期毒性中值为待测化合物的中间剂量组，再上下各推一到两个剂量组做预试验。每个剂量组间的组距可以大些，有利于找出受试化合物的致死剂量范围。 初起组距可用剂量间的4倍差，即以log4(log4＝0.6)来划分各组剂量。 求外来化合物LD50时设置几个剂量组较为合适，应依预试验结果而定。一般设置5(7个剂量组即可，它即符合统计计算要求又可节省人力和财力。每个剂量组的动物数，小鼠不少于10只、大鼠6(8只、家兔4(6只，若设计采用霍恩氏法计算LD50时，动物数可减少。每组动物应雌雄各半；如化合物毒性有性别差异， 石河子大学教案续页 （内容与进程） 则应分别求雌、雄性动物各自的LD50(LC50)。 2.正式试验：经预试验造出受试化合物的致死剂量范围，（即死亡率10%—90%的剂量范围）在以下式求出正式试验的剂量组距（i）值。 或 —表示相邻的两个剂量组，计量对数之差或相邻两组剂量比值的对数值； n—为设计的剂量组数； 求得i值后以最低剂量组的剂量值加上一个I即使第二个剂量组的对数计量，依次推至最高剂量组，查各自反对数及得出各组剂量的真实值。 (六)灌胃操作 1.灌胃量的计算： ⑴.确定灌胃剂量：mg/kg； ⑵.确定灌胃体积：ml/kg； ⑶.确定灌胃浓度：⑴/⑵= mg/ml ⑷.计算每鼠灌胃量（ml）= ⑵×动物体重 2.小鼠、大鼠及豚鼠灌胃法 将钝头的16号注射针(适用于小鼠)或20—24 号腰穿针(适用于大鼠、膘鼠)(注意事先可用焊锡在针尖周围焊一回头．使其不 易损伤动物的消化道)安装在适当容积的注射器上，吸取所需的受试物溶液，左手抓住动物双耳后至背部的皮肤(小鼠仅抓住耳后、颈部的皮肤，用无名指、小手指和大鱼际肌将其尾根部压紧)，将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者。注意使动物的上消化道固定成一直线。右手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑入食管。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即可深入至胃部。如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免操作穿破食管，甚至误入气管，导致动物立即死亡。 进针深度一般是小鼠2.5～4cm，大鼠或脉鼠4～6cm 。为了验明是否已正确地插入胃部，可轻轻回抽注射器，如元气泡抽出，表明已插人胃中；如有大量气泡，则提示误插气管，应抽出重插。随后将受试物溶液注入。灌胃容量小鼠通常为0.2～1ml，大鼠1～4m1，脉鼠l～5ml。 3.注意事项 为了使受试物能完全吸收，灌胃染毒时要求动物保持空腹状态．这是因为化学毒物进入胃内易与食糜作用而降低毒性，而且胃内容物也不利 石河子大学教案续页 （内容与进程） 于受试物溶液的灌入，因此染毒前应禁食6～10小时，但要注意时间不能过长。否则动物长时间饥饿会影响肝脏，影响实验结果。灌胃后至少2～3小时后才能喂食．油剂比水溶液要求限制喂食的时间更长些。 相同剂量的受试物，若以不同浓度给药，死亡情况会有所不同。体积太小、太浓可能发生局部刺激或其他损伤；体积太大可能会引起胃部机械性损伤，影响正常生理功能。常用的方法是将受试物体积固定，根据实验设计的剂量将受试物配制成不同浓度的溶液进行灌胃。通常灌胃体积以体重的1%～2%计算，最多不超过3%，即每100g体重溜胃l～2m1，最多不超过3ml。根据实际经验得出的各种实验动物灌胃量的极限是：小鼠O.5～1ml，大鼠4～5m1。 (七)中毒症状观察和LD50计算 1.中毒症状 染毒后注意观察中毒的发生、发展过程的规律以及中毒特点和毒作用的靶器官，观察要点见表l，做好实验记录。观察期间每3天称重一次。急性毒性试验可不做病理组织学检查，但对死亡动物应做大体病理学观察，存活动物实验结束时可做大体解剖学观察，肉眼观察到病变时应取材做病理组织学检查．以便为下阶段毒性试验剂量选择提供参考依据。 2.LD50计算 根据受试物的种类由指导教师事先确定采用何种方法(改进寇氏法、霍恩法等)进行计算，并在试验前设计剂量分组和每组动物数。选择适宜的方法(详见第六章)求出LD50及95%的可信限范围。如毒性反应存在性别差异．应分别求出不同性别动物的LD50值。 石河子大学教案续页 （内容与进程） 表1 急性毒性试验原始记录 受试物称： 提供单位： 染毒剂量： Mg/kg 染毒途径： 动物种属品系： 动物来源： 合格证号： 室温： 相对湿度： 组别： 染毒剂量： 动物 性 体 重 染毒 症状及出现时间 死亡 体重记录（g） (mg/kg) 编号 别 （g） 时间 时间 实验记录者： 记录日期： 年 月 日 第 页 五、结果评定 根据实验动物中毒症状、死亡时间、LD50及急性毒作用带，按受试物种类，分别参照相应的化学物质经口急性毒性分级标准进行评定，判断该受试物的毒性大小及毒性特征(评价标准见第六章)。 1.计算方法：改进寇氏法 该法是利用计量对数与死亡率呈S型曲线而设计的方法，又称Karber法或平均致死量法。该法计算简便，准确率高，是较为常用的方法。本法要求每个染毒剂量组的动物数要相同，各计量组组距成等比级数，死亡率呈正态分布，最低计量组死亡率〈 20%，最高计量组死亡率 〉80%。 计算公式如下： 式中： ——lgLD50; ——相邻两剂量组之对数剂量差值； ——最大剂量对数值； 石河子大学教案续页 （内容与进程） q——存活率（q=1-p）； ——各剂量组死亡率总和； n——为每组动物数。 2. 举例：小鼠经口给于某种化合物染毒，剂量和死亡动物数结果见表2。 表2 某化学物质小鼠经口染毒死亡情况 组别 剂量 动物数 死亡数 死亡率 存活率 p.q mg/kg 对数 （只） （只） （p） （q） 1 15 1.1761 10 0 0 1 0 2 18 1.2561 10 2 0.2 0.8 0.16 3 21.7 1.3361 10 5 0.5 0.5 0.25 4 26.1 1.4161 10 7 0.7 0.3 0.21 5 31.3 1.4961 10 9 0.9 0.1 0.09 　 　 =0.08 　 　 =2.3 　 　 按式算得：lgLD50=1.4961-0.08（2.3-0.5）=1.3521 =0.08× =0.0213 lgLD50及其95%可信限为1.3521 1.96×0.0213=1.3521 0.0417 所以，lgLD50及其95%可信区间范围为22.50mg/kg;（20.44～24.76/mg/kg）。 PAGE 5 第 页 _1143395957.unknown _1143397382.unknown _1143398242.unknown _1143398683.unknown _1143398281.unknown _1143397923.unknown _1143396114.unknown _1143396156.unknown _1143392108.unknown _1143395915.unknown _1143395928.unknown _1143395887.unknown _1143392056.unknown