暗室环境可抑制氨己烯酸的视网膜毒性

457中国临床神经科学 2009年第 17卷第 5期 论 著 Chin J Clin Neurosci 2009, 17 (5) , 457~462 暗室环境可抑制氨己烯酸的视网膜毒性 张 瑜, 王庆平, 叶 纹 (复旦大学附属华山医院眼科 200040) 关键词 氨己烯酸；光照；视网膜毒性 摘要 目的：观察新型抗癫 药氨己烯酸的视网膜毒性与光毒性的关系，探索氨己烯酸视网膜损伤的预防机制。方 法：选用 30只健康雄性BALB/c小鼠。正常治疗组(n=10)，置于正常饲养环境中(黑暗与光照交替 12 h)，给予氨己烯 酸 250 mg·kg-1·d-1腹腔注射；暗室治疗组(n=10)，24 h置于暗室环境中，药物治疗浓度同正常治疗组；对照组(n=10)，置 于正常饲养环境中，给予0.9% NaCl 0.1 mL·d-1，腹腔注射。1个月后处死小鼠取视网膜进行5种抗体(Anti-VGLUT、Anti- Bsaaoon、Anti-Goa、Anti-PKCa和Anti-calbindin)的免疫荧光染色。结果：5种抗体染色表明暗室治疗组小鼠的视杆 细胞突触、ON-双极细胞突触、水平细胞突触由视网膜外丛状层(OPL)向外核层(ONL)的退缩在暗室环境中可被抑制。 结论：氨己烯酸的小鼠视网膜毒性有光依赖性，去除光毒性的影响，小鼠视网膜第一与第二级神经元之间的病理性突 触改变可被完全抑制。 Neuronal Plasticity Induced by Vigabatrin Can Be Suppressed by Darkness in the Mouse Retina ZHANG Yu,WANG Qing-Ping,YE Wen Department of Ophthalmology, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China KEY WORDS vigabatrin; retina; toxicity ABSTRACT Aim: To detect the correlation between phototoxicity and vigabation-elicited retinal damage, and explore the potential management of vigabatrin toxicity on retina. Methods: 30 BALB/c male mice were separated to three groups. Ten mice received vigabatrin daily intraperitoneal injection were kept in normal day-night cycle situation as vigabatrin treatment group; another ten mice were kept in darkness during the whole process of vigabatrin intraperitoneal injection as vigabatrin darkness group; the residual ten animals which accepted vehicle solution injection were also kept in normal day-night cycle situation as the control group. The whole period of experiment also last thirty days, vigabatrin concentration and dose of injection were the same among them. The animals were sacrificed after 30 days and the retinas were taken out. Their immunostaining reactions with the five kinds of antibodies were observed and the results were repeated. Results: ① In vigabatrin darkness group, withdrawal of photoreceptor terminal were completely suppressed. ②VGB-elicited sprouting of bipolar cell dendrites disappeared in dark situation. ③ The horizontal dendrites migration were also inhibited in vigabatrin darkness group. Conclusion: Darkness could eliminate the distinctive neuro-plasticity completely on albino mouse retina demonstrated vigabatrin-induced damage are correlated with phototoxicity. It indicated a potential way of prevention of vigabatrin injury in clinic. [文章编号] [作者简介] [通讯作者] 1008-0678(2009)05-0457-06 [中图分类号] R742.1 [文献标识码] A 张瑜,女( 1981-) ,汉族,住院医师,博士,主要从事眼底病、神经眼科疾病的研究。 王庆平,E-mail:wangqingping71@hotmail.com 458 中国临床神经科学 2009年第 17 卷第 5期 癫 (epilepsy)作为一种临床常见多发性疾病，在欧 洲国家发病率为4.3‰~7.8‰，其中部分患者需要终身使 用抗癫 药物[1]。癫 的发生机制与大脑内兴奋性递质 谷氨酸(glutamate)和抑制性递质 g-氨基丁酸(gamma- aminobutyric acid，GABA)的失衡有关。氨己烯酸 (vigabatrin)为新型抗癫 药物，其作用机制为竞争性不 可逆地与GABA转氨酶(GABA-transaminase)结合，抑制 GABA向谷氨酸转化，从而提高脑内GABA浓度而发挥 作用[2]。 随着氨己烯酸临床应用的日渐广泛，发现使用该药 物后有 10%~40%的患者出现双眼视野缺损，并进一步 造成不可逆的视力损伤，其他损伤还包括辩色觉[3~5]和对 比敏感度的下降[3, 4, 6, 7]。电生理检查异常的报道主要集 中在使用氨己烯酸后，患者的明视视网膜电图(ERG)b波 潜伏期延长，b波峰值下降，反应锥细胞功能的闪光ERG (30 Hz)异常[6,8,9]。组织病理学检查发现，氨己烯酸可造 成大鼠周边视网膜感光细胞层的不规则改变[10,11]。本课 组在已进行的实验研究中进一步发现，氨己烯酸可以 造成大鼠中心视网膜视锥细胞的损伤，并以胶质细胞反 应性增生为显著特征[11~13]。离体视网膜的体外研究表明， 氨己烯酸的视网膜毒性与光毒性有关[14]。非白化病动物 实验也证明，氨己烯酸的视网膜损伤特异性地存在于白 化病动物模型。本研究以氨己烯酸治疗小鼠视网膜神经 元突触改变为观察指标，研究氨己烯酸的视网膜毒性与 光毒性的关系，探索氨己烯酸视网膜损伤的可能预防机 制。 材料与方法 主要仪器和试剂 氨己烯酸粉剂(Sabril，sanofi- aventis，French，Europe)、冰冻切片机 (Crystat，Leica)、 Tissue OCT (Labonord, Villeneuve d’Ascq, France)、 Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO)、Bovine serum albumin(Eurobio, Les-Ulis, France), Anti-mouse cone arrestin(Luminaire junior, LUMIj), Anti-protein kinase C al- pha (PKCa)(Sigma), Anti-VGluT1(Chemicon), Anti- calbindin(Chemicon), Anti-Goa (Chemicon) Anti-bassoon (StrseeGen), DAPI(Molecular Probes, Eugene,OR), Goat anti-rabbit IgG or rabbit anti-mouse IgG conjugated to either Alexa TM594 or Alexa TM488(Molecular Probes, Eugene, OR), Fluorsave reagent (Calbiochem, San Diege, CA), Leica microscope(LEICA DM 5000B), Ropper scientific camera (Photometrics cool SNAP TM FX)。 实验动物 雄性BALB/c小鼠由 Janvier (Le Genest- St-Isle, France)实验动物中心处购买，6周龄，平均体重 20~25 g。标准动物饲养环境 SPF级，温度 27℃，湿度 40%，黑暗与光照交替12 h。分笼喂养，自由摄食摄水。 氨己烯酸注射液的配制[13] 氨己烯酸粉剂按照 100 mg·mL-1溶解于 0.9%NaCl，调整 pH值为 7.4，储存于 4 ℃冰箱中，每 3日配制 1次。 小鼠分组及给药方法 30只小鼠分为①氨己烯酸治 疗组(n=10)：置于正常饲养环境中，黑暗与光照交替12 h， 给予氨己烯酸 250 mg·kg-1·d-1腹腔注射，持续 30 d。 ②暗室治疗组(n=10)：24 h置于暗室环境中，接受药物 治疗浓度与持续时间同氨已烯酸治疗组。③正常对照组 (n=10)：置于正常饲养环境中，给予0.9% NaCl 0.1 mL·d-1 腹腔注射。 冰冻组织切片的制作 于第31天处死实验小鼠，显 微镜下摘除眼球并仔细去除角膜及晶体，得到眼杯。眼 杯放置于 4%多聚甲醛溶液(溶解于 0.01 mol·L-1磷酸缓 冲液)，4℃冰箱过夜。磷酸缓冲液洗涤，眼杯放置于10% 蔗糖溶液浸润至饱和沉底，依次再放置于 20%和 30% 蔗糖溶液浸润至饱和。组织包埋剂OCT包埋眼杯后置 于-80℃冰箱过夜。冰冻切片机进行连续组织切片，切 片方向为从前至后与视神经平行，选取切片范围为视神 经直径内，厚度8~10 mm，切片黏附于明胶处理过的载 玻片上，常温下过夜，做好标记放置-20℃冰箱中保存。 5种视网膜抗体的免疫荧光 1.Anti-protein kinase C alpha染色[13]：冰冻切片解冻， PBS-0.1%Tween连续漂洗切片 3次，PBS-0.1%Triton浸 染切片 5 min，PBS连续清洗切片 3次。PBS-1%BSA- 0.05%Tween浸泡切片，37℃温箱中封闭 1 h。去除封闭 液，加入一抗Anti-protein kinase C alpha (PKCa，1:2 000)， 4℃冰箱过夜，去除一抗，PBS连续清洗3次，加入二抗 (rabbit anti-mouse IgG，1:200)，切片避光常温下着染1 h， PBS清洗，加入荧光封闭剂，4℃冰箱避光保存。 2. Anti-VGluT1染色[13]：冰冻切片解冻，PBS-0.1% Tween连续漂洗切片 3次，PBS-0.1%Triton浸染切片 5 min，PBS连续清洗切片3次。PBS-1%BSA-0.05%Tween 浸泡切片，37℃温箱中封闭 1 h。去除封闭液，加入一 抗Anti-VGluT1(1:2 000)，4℃冰箱过夜，去除一抗，PBS 连续清洗 3次，加入二抗(Goat anti-rabbit IgG，1:200)， 切片避光常温下着染 1 h，PBS清洗，加入荧光封闭剂， 4℃冰箱避光保存。 3. Anti-calbindin染色[13]：冰冻切片解冻，PBS-0.1% Tween连续漂洗切片 3次，PBS-0.1%Triton浸染切片 5 min，PBS连续清洗切片3次。PBS-1%BSA-0.05%Tween 459中国临床神经科学 2009年第 17卷第 5期 浸泡切片，37℃温箱中封闭 1 h。去除封闭液，加入一 抗Anti-calbindin (1:500)，4℃冰箱过夜，去除一抗，PBS 连续清洗 3次，加入二抗(Goat anti-rabbit IgG，1:200)， 切片避光常温下着染 1 h，PBS清洗，加入荧光封闭剂， 4℃冰箱避光保存。 4. Anti-Goa染色[13]：冰冻切片解冻，PBS-0.1% Tween连续漂洗切片 3次，PBS-0.1%Triton浸染切片 5 min，PBS连续清洗切片3次。PBS-1%BSA-0.05%Tween 浸泡切片，37℃温箱中封闭 1 h。去除封闭液，加入一 抗Anti-Goa(1:2 000)，4℃冰箱过夜。去除一抗，PBS连 续清洗 3次，加入二抗(rabbit anti-mouse IgG，1:200)， 切片避光常温下着染 1 h，PBS清洗，加入荧光封闭剂， 4℃冰箱避光保存。 5. Anti-bassoon染色[13]：冰冻切片解冻，PBS-0.1% Tween连续漂洗切片 3次，PBS-0.1%Triton浸染切片 5 min，PBS连续清洗切片3次。PBS-1%BSA-0.05%Tween 浸泡切片，37℃温箱中封闭 1 h。去除封闭液，加入一 抗Anti-bassoon (1:100)，4℃冰箱过夜。去除一抗，PBS 连续清洗 3次，加入二抗(Goat anti-rabbit IgG，1:200)， 切片避光常温下着染 1 h，PBS清洗，加入荧光封闭剂， 4℃冰箱避光保存。 免疫荧光染色切片在免疫荧光显微镜下进行观察， 相关结果进行摄片保存。 结 果 暗室环境对小鼠视网膜视杆细胞突触的影响 Ⅰ型 囊泡膜谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporter 1， VGLUT1)是感光细胞突触囊泡的一种蛋白质，Anti- VGLUT1染色显示，氨己烯酸治疗组小鼠的视杆细胞突 触末端由视网膜外丛状层(out plexiform layer，OPL)向 外核层(outer nuclear layer，ONL)退缩(图 1B)，而暗室 治疗组小鼠视网膜的突触末端仍集中着染在外丛状层(图 1C)。表明暗室环境可抑制小鼠视网膜视杆细胞突触向 外核层的退缩。 巴松管(bassoon)是一种相对分子质量为 420 000的 蛋白质，位于局部的突触前神经末梢，被认为在组织突 触囊泡循环发挥重要的结构和功能作用。Anti-bassoon 着染在感光细胞突触带，显示为点状着染。在正常对照 组小鼠视网膜的视杆细胞突触末端集中在外丛状层(图 2A)，而氨己烯酸治疗组的视杆细胞突触末端由外丛状 层向外核层退缩(图2B)。在暗室环境下饲养的小鼠，虽 然接受同样剂量的氨己烯酸治疗，但是感光细胞突触末 端仍然集中着染在外丛状层(图 1C，图 2C)。 暗室环境对小鼠视网膜双极细胞突触的影响 Goa 是鸟嘌呤核酸结合调节蛋白a亚基，主要分布于中枢神 经系统。视网膜中Anti-Goa为ON-双极细胞的特异蛋白 免疫染色剂(图3A~C, G~I，绿色着染)，包括ON-视锥双 极细胞和ON-视杆双极细胞。在正常对照组小鼠视网膜， ON-双极细胞的胞体着染在内核层，突触末端局限在外 丛状层着染(图3A，G)，而在氨己烯酸治疗组的小鼠视网 膜，ON-双极细胞的胞体虽然在内核层无改变，但其突触 末端由外丛状层向外核层伸展(图2B，E)。暗室环境抑制 小鼠视网膜双极细胞突触由外丛状层向外核层的伸展蛋 白激酶C(protein kinase C alpha-a，PKCa)特异性着染在 ON-视杆双极细胞(图 3 D~I，红色着染)，在正常对照组 图 1 小鼠视网膜Anti-VGluT1染色(× 200) Fig 1 Immunostaining of Anti-VGluT1 in mice retina(× 200) 注： Notes：Withdrawal of photoreceptor synapses in the ONL and inhibited by darkness. A：control group；B：vigabatrin treatment group； C：vigabatrin+ darkness group；OPL：out plexiform layer； ONL：outer nuclear layer；INL：inner nuclear layer 图 2 小鼠视网膜Anti-bassoon染色(× 200) Fig 2 Immunostaining of Anti-bassoon in mice retina(× 200) Withdrawal of photoreceptor synapses in the ONL and inhibited by darkness.A：control group；B：vigabatrin treatment group； C：vigabatrin+ darkness group；OPL：out plexiform layer； ONL：outer nuclear layer；INL：inner nuclear layer 注： Notes： 暗室环境可抑制小鼠视网膜视杆细胞突触向外核层退缩：氨 己烯酸治疗组可观察到视杆细胞突触向外核层退缩，而暗室 治疗组可抑制这一现象。A：正常对照组；B：氨己烯酸治疗 组；C：暗室治疗组；O PL：视网膜外丛状层；O N L：外核层； I N L：内核层 暗室环境抑制小鼠视网膜视杆细胞突触向外核层退缩：氨己 烯酸治疗组可观察到视杆细胞突触向外核层退缩，而暗室环 境治疗组可抑制这一现象。A：正常对照组；B：氨己烯酸治 疗组；C：暗室治疗组；O P L：视网膜外丛状层；O N L：外核 层；I N L：内核层 460 中国临床神经科学 2009年第 17 卷第 5期 图 3 小鼠视网膜Anti-Goa和 anti- PKCa染色(× 200) Fig 3 Double immunostaining of Anti-Goa and anti- PKCa in mice retina(× 200) 图 4 小鼠视网膜Anti-calbindin染色(× 200) Fig 4 Immunostaining of Anti-calbindin in mice retina(× 200) 注： Notes：Rod and cone ON bipolar cell sprouting and suppressed by darkness. A,D,G：control group；B,E,H：vigabatrin treatment group；C, F,I：vigabatrin+ darkness group；OPL：out plexiform layer； ONL：outer nuclear layer；INL：inner nuclear layer Horizontal cell sprouting and suppressed by darkness.A：control group；B：vigabatrin treatment group；C：vigabatrin+ dark- ness group；OPL：out plexiform layer；ONL：outer nuclear layer；INL：inner nuclear layer 注： Notes: 暗室环境抑制小鼠视网膜双极细胞突触由外丛状层向外核层 的伸展(Anti-Goa 染色、anti-PKCa 染色)。A,D,G：正常对照组； B,E,H：氨己烯酸治疗组；C,F, I：暗室治疗组；O PL：视网膜外 丛状层；O N L：外核层；I N L：内核层 暗室环境抑制水平细胞突触向外核层的伸展 抗钙结 合蛋白(Anti-Calbindin)是视网膜水平细胞的特异性染色剂。 正常对照组的水平细胞胞体及突触集中分布在外丛状层 (图4A，绿色着染)，在氨已烯酸治疗的小鼠视网膜上，水 平细胞的胞体虽然没有发生位置的改变，但是其突触也向 外核层发生了延展(图4B)，但暗室环境下，水平细胞突触 向外核层的伸展也被完全消除(图4C)。 暗室环境抑制鼠视网膜水平细胞突触由外丛状层向外核层的 伸展(Anti -ca lbindin)。A：正常对照组；B：氨己烯酸治疗组； C：暗室治疗组；OPL：视网膜外丛状层；ONL：外核层；INL： 内核层 暗室环境抑制ON-双极细胞和水平细胞突触共同向 外核层的伸展 Anti-Goa可着染在ON-视锥双极细胞 和ON-视杆双极细胞(图5A~C，G~I绿色着染)。在正常 对照组小鼠视网膜，ON-双极细胞的胞体着染在内核 层，突触末端局限在外丛状层着染(图 5A，G)，而在氨 己烯酸治疗的小鼠视网膜，ON-双极细胞的胞体虽然在 内核层无改变，但其突触末端由外丛状层向外核层伸展 (图 5B，H)。 抗钙结合蛋白(Anti-Calbindin)可着染水平细胞和无长 突细胞(图5D~I，红色着染)。结果显示正常对照组的水 平细胞胞体及突触分布在外丛状层(图 5D，G)，在经过 氨己烯酸治疗的小鼠视网膜上，水平细胞的胞体虽然没 有发生位置的改变，但是其突触也向外核层发生了延展 (图 5E，H)。 双重免疫染色结果显示，水平细胞突触和双极细胞 突触在氨己烯酸治疗组小鼠视网膜上，ON-双极细胞突 触和水平细胞突触共同外丛状层向外核层伸展(图5H)。 但在暗室饲养条件下，氨己烯酸治疗小鼠的双极细胞染 色(图4C)和水平细胞染色(图5F)表现为正常对照组小鼠 视网膜的形态，即突触末端着染局限在外丛状层，双重 免疫染色结果也表明，ON-双极细胞和水平细胞突触向 外核层的伸展被完全抑制(图 5 I)。 暗室环境抑制视杆细胞突触退缩和双极细胞突触伸 展 VGLUT1着染于感光细胞突触囊泡(图5A~C，G~I， 红色着染)，染色显示，氨己烯酸治疗小鼠的视杆细胞 突触末端由外丛状层向外核层退缩(图6B，H)，而正常 对照组小鼠视网膜的突触末端仍集中着染在外丛状层 (图 6A，G)。 小鼠视网膜，ON-视杆双极细胞的胞体着染在内核层，突 触末端局限在外丛状层着染(图3D，G)，而在氨己烯酸治 疗的小鼠视网膜，ON-双极细胞的胞体虽然在内核层无 改变，但其突触末端由外丛状层向外核层伸展(图3E，H)。 双重免疫染色结果显示视杆双极细胞和ON-视锥双 极细胞分别发生了突触末端由外丛状层向外核层的伸展 (图3G)。而在暗室环境条件下，氨己烯酸治疗组小鼠视 网膜双极细胞突触的伸展被完全抑制，Anti-Goa染色和 anti- PKCa染色都表现出和正常对照组一样的形态，即 双极细胞突触末端着染仍局限在外丛状层(图3C，F，I)。 461中国临床神经科学 2009年第 17卷第 5期 图 5 小鼠视网膜Anti-Goa和 anti-calbindin双重免疫染色(× 200) Fig 5 Double immunostaining of Anti-Goa and anti-calbindin in mice retina(× 200) ON bipolar cells with horizontal cells sprouting and suppressed by darkness.A,D,G：control group；B,E,H：vigabatrin treatment group；C,F,I：vigabatrin+ darkness group；OPL：out plexiform layer；ONL：outer nuclear layer；INL：inner nuclear layer 注： Notes: 图 6 小鼠视网膜Anti- VGLUT1和 anti-Goa双重免疫染色 (× 200) Fig 6 Double immunostaining of Anti- VGLUT1 and anti-Goa in mice retina(× 200) 烯酸治疗组小鼠的视杆细胞突触末端由外丛状层向外核 层退缩(图 7B，H)。 Anti-PKCa着染在ON-视杆双极细胞(图 7D~I，红 色着染)。在正常对照组视网膜，ON-视杆双极细胞胞体 着染在内核层，突触末端局限在外丛状层着染(图 7D， G)，而在氨己烯酸组治疗小鼠视网膜，ON-双极细胞胞 体虽然在内核层无改变，但其突触末端由外丛状层向外 核层伸展(图 7E，H)。 双重免疫染色结果显示，在视杆细胞突触由外丛 状层向外核层的退缩过程中，ON- 双极细胞的突触 同时发生由外丛状层向外核层的伸展(图 7H)。暗室 饲养环境抑制了这种神经元突触形态学的改变，表现 出与正常对照组视网膜一样的免疫荧光染色形态(图 7C，F，I)。 Photoreceptor synaptic with bipolar cell sprouting and suppressed by darkness. A,D,G：control group；B,E,H：vigabatrin treat- ment group；C,F,I：vigabatrin+ darkness group；OPL：out plexi- form layer；ONL：outer nuclear layer；INL：inner nuclear layer 注： Notes: 暗室环境抑制小鼠视网膜水平细胞突触由外丛状层向外核层 的伸展。A,D,G：正常对照组；B,E,H：氨己烯酸治疗组；C,F, I：暗室治疗组；OPL：视网膜外丛状层；ONL：外核层；INL： 内核层 暗室环境抑制小鼠视网膜水平细胞突触由外丛状层向外核层 的伸展。A,D,G：正常对照组；B,E,H：氨己烯酸治疗组；C,F,I： 暗室治疗组；O PL：视网膜外丛状层；O N L：外核层；IN L：内 核层 Anti-Goa着染在ON-视锥双极细胞和ON-视杆双极 细胞(图 6D~I，绿色着染)。在正常对照组小鼠视网膜， ON-双极细胞胞体着染在内核层，突触末端局限在外丛 状层着染(图 6D，G)，而在氨己烯酸治疗组的小鼠视网 膜，ON-双极细胞胞体虽然在内核层无改变，但其突触 末端由外丛状层向外核层伸展(图 6E，H)。 双重免疫染色结果显示，在视杆细胞突触由外丛状 层向外核层的退缩过程中，ON-双极细胞的突触同时发 生由外丛状层向外核层的伸展(图6H)。暗室饲养环境抑 制了这种神经元突触形态学改变，表现出与正常对照组 小鼠视网膜一样的免疫荧光染色形态(图 6C，F，I)。 暗室环境抑制视杆细胞突触退缩和双极细胞突触伸 展 Anti-bassoon着染在感光细胞突触带，显示为点状 着染(图7A~C，G~I，绿色着染)。在正常对照组视网膜， 视杆细胞突触末端集中在外丛状层(图 7A，G)，而氨己 462 中国临床神经科学 2009年第 17 卷第 5期 讨 论 我们在前期实验中发现在氨己烯酸致小鼠视网膜损 伤模型中，最突出和最一致的表现是视杆细胞突触末稍 由外丛状层向外核层的退缩，同时伴有第二级神经元突 触，包括ON-双极细胞和水平细胞突触由外丛状层向外 核层的伸展[13]。这种神经元突触的改变非常明显，可作 为氨己烯酸致小鼠视网膜损伤的检测标志。 本实验把小鼠分为 3组，除设立正常生理盐水对照 组外，把一组接受氨己烯酸腹腔注射的小鼠置于正常光 照 /黑暗交替饲养环境中，另一组接受同样药物剂量治 疗的小鼠置于暗室环境中。结果表明，在暗室饲养环境 下的小鼠视网膜神经元突触的可塑性改变完全被抑制， 表现出与正常对照组小鼠视网膜完全一样的正常形态。 结果表明，氨己烯酸导致的小鼠视网膜损伤与光毒性有 图 7 小鼠视网膜Anti-bassoon和 anti-PKCa双重免疫染色 (× 200) Fig 7 Double immunostaining of Anti-bassoon and anti-PKCa in mice retina(× 200) 关，正常光照环境可以触发氨己烯酸在小鼠的视网膜损 伤，暗室环境可以完全抑制氨己烯酸导致的小鼠视网膜 病变。 氨己烯酸造成视网膜损伤的确切机制存在不同的假 说。首先，视网膜锥细胞表达GABAA和GABAC受体 [15]， GABA在视网膜内浓度的增高可以激活上述两种离子受 体造成细胞持续去极化，从而产生神经元毒性[16]。但这 种改变与氨己烯酸的治疗作用密切关联，如降低氨己 烯酸的药物治疗浓度，理论上可以减少GABA堆积并降 低其造成的视网膜损伤，但也势必减少GABA在大脑内 的药物浓度，从而削弱其抗癫 作用。其次，有学者认 为氨己烯酸可以改变视网膜内牛磺酸含量，而牛磺酸 是激活视网膜内GABA受体的重要氨基酸，同时牛磺酸 也是维持感光细胞活性的必需物质。但随后的研究又 发现视网膜内牛磺酸的浓度并没有因使用氨己烯酸而 发生变化。 氨己烯酸造成的视网膜损伤只特异性地表现在白化 病动物模型上[10]，我们在给非白化病大鼠进行长达 105 d的氨己烯酸50 mg·d-1腹腔注射后，也未在视网膜上检 测出明显的病变(结果未附上)。正常视网膜色素的存在 可以触发机体的瞳孔对光反射，减少视网膜感光细胞 接受的光照剂量，而白化病动物由于视网膜色素的缺 乏，无法正常形成上述保护机制，从而使得其视网膜不 得不接受与非白化病动物相比>90倍的光照强度[17]。其 次，由于白化病动物视网膜色素上皮缺乏黑色素，而黑 色素在维持视网膜正常功能、吞噬脱落的细胞外节以及 抵抗各种理化因素和药物的损伤中起重要作用。因此， Izumi等[14](2004)提出，光照可能是造成氨己烯酸导致视 网膜损伤的重要因素，把离体视网膜培养于氨己烯酸溶 液中，活体动物在给予一次大剂量氨己烯酸注射后置于 强光下(6 000~20 000 lux)照射 20~24 h，观察氨己烯酸 对视网膜的损伤，结果只在离体视网膜上观察到感光细 胞层的损伤。本实验证明，在给予小鼠治疗剂量的氨己 烯酸长期注射后出现的视网膜神经元突触改变，在去除 光照影响后被完全抑制；正常日照光线即可触发氨己烯 酸在白化病小鼠的视网膜病变。 本研究结果表明，氨己烯酸引起的视网膜病变与光 毒性有关。氨己烯酸的半衰期在成人为 5~8 h，在儿童 则半衰期更短[32]。临床如能利用这一现象，睡前一次给 予氨己烯酸治疗剂量而不是常规的早晚给药，或许能避 免光照触发的氨己烯酸视网膜损害；如果无法通过睡前 一次给药达到有效治疗效果，那么日间给药后应该叮嘱 患者尽量呆在室内较暗的环境中，如必须室外活动，也 注： Notes：Photoreceptor synaptic with bipolar cell sprouting and suppressed by darkness. A,D,G：control group；B,E,H：vigabatrin treat- ment group；C,F,I：vigabatrin+ darkness group；OPL：out plexi- form layer；ONL：outer nuclear layer；INL：inner nuclear layer 暗室环境抑制小鼠视网膜视杆细胞和双极细胞突触由外丛状 层向外核层的伸展。A, D , G：正常对照组；B, E, H：氨己烯酸治 疗组；C ,F , I：暗室治疗组；O PL：视网膜外丛状层；O N L：外 核层；I N L：内核层 463中国临床神经科学 2009年第 17卷第 5期 应采取佩戴墨镜等简单来避免光线直射。对于接受 氨己烯酸治疗的患儿及家庭来说，在药物治疗阶段必须 对光线引起氨己烯酸视网膜损伤引起足够的重视。通过 上述简单的预防方法，氨己烯酸引起的视网膜损害或许 可以有效地被避免或减少。 本实验结论是建立在对白化病BALB/c小鼠模型研究 的基础上，无论是氨己烯酸引起的神经元突触改变，还 是暗室环境抑制药物引起的视网膜损伤，所有的小鼠都 表现出良好的结果一致性。但在临床接受氨己烯酸治疗 的患者中，只有10%~40%的患者出现双眼视野缺损[18~21]。 造成这种差异的原因，除了人类和小鼠进化程度不同以 及生理结构的差异外，还因为所有临床资料都来自于正 常人群而非白化病人群。在正常人群中，视网膜内包括 黑色素在内的一些结构及正常免疫系统和修复机制可以 抵抗理化因素和药物的毒性作用，这也可以部分解释氨 己烯酸未能在非白化病小鼠引出视网膜损伤的原因。 综上所述，氨己烯酸导致的小鼠视网膜损伤与光毒 性有关，正常光照环境可以触发氨己烯酸在小鼠的视网 膜损伤，暗室环境可以完全抑制氨己烯酸导致的小鼠视 网膜病变。该发现如果能在临床应用中得到证实，将消 除氨己烯酸治疗导致癫 病例的眼部损伤，从而造福患 者。 参考文献 Pugliatti M, Beghi E, Forsgren L, et al. Estimating the cost of epilepsy in Europe: a review with economic modeling[J]. 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