苦参碱和阿苯达唑联合治疗小鼠泡球蚴病的机制探讨

中国寄生虫学与寄生虫病杂志2006年10月第24卷第5期 ChinJParasitolParasitDisOct.2006,Vol.24,No.5 基金项目:甘肃省新药临床前研究重点实验室开放基金 (No:GSKFKT- 0408) 作者单位:1兰州大学基础医学院,兰州 730000; 2甘肃省中药新药临床前研究重点实验室,兰州 730000 * 通讯作者 机体感染泡球蚴后,免疫功能发生变化,细胞因 子 (cytokine,CK)作为一种免疫调节剂,在抗感染 免疫中,可促进免疫系统发挥抗感染作用,也可引起 免疫病理损伤。从泡状棘球蚴病 (alveolarechinococ (1LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China;2KeyLaboratoryforPre-clinicalResearchonChinese TraditionalMedicine,Lanzhou730000,China) 【Abstract】 Objective Toassesstheimmunestatusandmetabolicreactionofhepaticenzymesonmicewith alveolarechinococcosis(AE)aftertreatmentwithmatrine(Mat)andalbendazole(ABZ). Methods MicewithAE weretreatedwithsingledoseMat,ABZandcombinedMatandABZrespectivelyfor60days.TheserumlevelofIL-2,IL- 4,IL-6andTNF-αwasdetectedbeforeandaftertreatment.NO,LDcontentandLDH,NOS,iNOS,Na+-K+ATPase,Ca2+- Mg2+ ATPaseactivitiesinhepatictissuehomogenatefromthemiceweremeasuredbychromatometry. Results The levelofIL-4,IL-6andTNF-αdecreasedinthetreatedgroupsthaninfectedcontrol(P<0.05),andespeciallythatofIL-4 andTNF-αinthedrug-combinationgroup. WhilethelevelofIL-2increasedinthecombinationgroupthantheinfected control(P<0.05).ThecontentofNOandtheactivityofNOSandiNOSinhepatictissuedecreasedaftertreatmentthan control(P<0.05).iNOSinMatandcombinationgroupsdecreasedmoresignificantlythanthatofABZgroup(P<0.05).The LDHactivityalsodecreasedaftertreatment(P<0.05),however,thedecreaseofLDoccurredonlyinthecombinationgroup (P<0.05). TheactivityofNa+-K+ATPaseandCa2+-Mg2+ATPaseincreasedinthetreatedgroups (P<0.05) withmore considerableincreaseofCa2+-Mg2+ATPaseinMatandcombinationgroupsthantheABZgroup(P<0.05). Conclusion MatrinemaystrengthentheimmunityofthemiceandshowsaninhibitoryeffectonthegrowthofEchinococcus multilocularisinvitroandinvivo, whichisposssiblyrelatedtotheinterventionofcalciumionpassagesandreversionof themulti-drugresistance. 【Keywords】Echinococcusmultilocularis;Matrine;Albendazole;Cytokine;Chromatometry SupportedbytheOpeningFundoftheKeyLaboratoryofPre-clinicalStudyforNewDrugs,GansuProvince(No:GSKFKT-0408) * Correspondingauthor 苦参碱和阿苯达唑联合治疗小鼠 泡球蚴病的机制探讨 【实验研究】 中图分类号:R383.3 文献标识码:A 文章编号:1000-7423(2006)-04-0366-04 张睿 1,景涛 2* 【摘要】 目的 探讨泡球蚴病小鼠经苦参碱 (matrine,Mat)阿苯达唑 (albendazole,ABZ)及两药 联用治疗后机体 的免疫应答状态和小鼠肝酶代谢的变化。 方法 泡球蚴病小鼠 (AE小鼠)经Mat、ABZ及其联合用药治疗60d后,检 测小鼠血清中白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及肝组织匀浆中NO、一氧化氮合酶 (NOS)、 诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)、乳酸 (LD)、乳酸脱氢酶 (LDH)、钠钾 ATP酶和钙镁 ATP酶的含量及活性。 结果 药 物治疗组血清中IL-4、IL-6和 TNF-α的含量较感染对照组降低 (P<0.05),IL-2的含量高于感染对照组 (P<0.05),其中 联合用药组IL-4和TNF-α下降较感染对照组明显 (P<0.05);各用药组肝组织LDH、NO、NOS和 iNOS均较感染对照组 明显下降 (P<0.05),iNOS在 Mat组及联合用药组下降幅度明显大于 ABZ组 (P<0.05),LD仅在联合用药组下降 (P<0.05);各用药组钠钾ATP酶和钙镁ATP酶较之对照组升高 (P<0.05),且Mat组及联合用药组钙镁ATP酶与ABZ组 差异有统计学意义 (P<0.05)。 结论 AE小鼠经治疗后,Th1型细胞因子分泌增加,Th2型细胞因子分泌减少,说明 Mat能提高小鼠机体的免疫力,并能显著改善小鼠肝功能,这可能与Mat作用钙离子通道和逆转耐药性有关。 【关键词】 泡球蚴病;苦参碱;阿苯达唑 ;细胞因子;比色法 AnApproachtotheMechanism ofMatrineandAlbendazoleAgainst EchinococcusmultilocularisInfectioninMice ZHANGRui1,JINGTao2* 366· · 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2006年10月第24卷第5期 ChinJParasitolParasitDisOct.2006,Vol.24,No.5 苦参碱组 Matgroup50mg/(kg·d) 阿苯达唑组 ABZgroup50mg/(kg·d) 苦参碱+阿苯达唑组 Mat+ABZ 25mg/(kg·d)+25mg/(kg·d) 感染对照组 Infectedcontrol 正常对照组 Blankcontrol 1 苦参碱和阿苯达唑治疗小鼠继发性泡球蚴病后血清IL-2、IL-4、IL-6及TNF-!的含量(x±s) Table1 Serum levelofIL-2,IL-4,IL-6andTNF-! inmice treatedwithMatandABZ(x±s) 组 别 小鼠只数 白细胞介素-2 白细胞介素-4 白细胞介素-6* 肿瘤坏死因子α Group No.mice IL-2(ng/ml) IL-4(ng/ml) IL-6*(pg/ml) TNF-α(ng/ml) 注:*该组数据为非参数材料。 Note:*Non-parameterdata. cosis,AE)患者和 AE小鼠的连续观察结果看,Th1 型细胞因子与抑制泡球蚴在宿主体内的缓慢生长有 关;Th2型细胞因子同泡球蚴在宿主体内快速生长及 病情进展有关[1]。动态观察淋巴细胞分泌的细胞因子, 可了解其在调节AE增殖中的作用[2]。据此,本研究观 察苦参碱 (matine,Mat)用药后AE小鼠部分Th1型 细胞因子和Th2型细胞因子的变化,以了解治疗后小 鼠机体的免疫状况及病程转归。 材料与方法 1 材料 1.1 实验动物 健康雌性昆明小鼠 100只,体重 (20±2)g,鼠龄25～30d(购自兰州大学基础医学院 实验动物繁育中心)。 1.2 药品及试剂 Mat购自中国宁夏博尔泰力药业股 份有限公司,阿苯达唑 (albendazole,ABZ)购自中 国浙江万马制药有限公司,白细胞介素-2(IL-2)和 IL-2试剂盒购自中国人民解放军总医院科技开发中 心,IL-6试剂盒购自中国北京北方生物技术研究所, 肿瘤坏死因子-! (TNF-!)试剂盒购自中国北京邦定 生物医学公司,考马斯亮蓝蛋白试剂盒、NO试剂盒、 一氧化氮合酶 (NOS)试剂盒、诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)试剂盒、乳酸 (LD)试剂盒、乳酸脱氢酶 (LDH)试剂盒、钠钾ATP酶试剂盒、钙镁ATP酶试 剂盒均购自中国南京建成生物研究所。 2 方法 2.1 动物模型的建立 将传代泡球蚴模型小鼠快速处 死,无菌操作,取出腹腔中泡球蚴组织,无菌生理盐 水冲洗3次,剪碎过筛后配成25%浓度的混悬液 (每 毫升含青霉素和链霉素各 800U),0.5%伊红染色见 泡球蚴原头蚴2～4个/视野,结构清晰,细胞形态基 本正常,可用于动物接种。用 12号针头在实验小鼠 右下腹穿刺腹腔接种泡球蚴组织混悬液0.5ml,共接 种80只,随机分成4组,即 Mat组、ABZ组、Mat+ ABZ治疗组 (联合组)和感染对照组,每组 20只于 感染后30d开始药物治疗。同期设20只健康小鼠为 正常对照组。 2.2 药物治疗 将药物用生理盐水配成混悬液,ABZ 组:ABZ50mg/(kg·d);Mat组:Mat50mg/(kg·d); 联合用药组:ABZ25mg/(kg·d)+Mat25mg/(kg·d); 用小鼠灌胃针每天空腹灌胃 1次,连续给药 2个月, 于末次给药后4h剖检。 2.3 小鼠血清 IL-2、IL-4、IL-6和 TNF-! 含量测定 小鼠眼球钝性脱眶采血,离心取血清,应用放射免疫 法测定血清中 IL-2、IL-4、IL-6和 TNF-a含量,操作 按试剂盒说明进行。 2.4 小鼠肝组织匀浆NO、LD含量和 LDH等肝酶活 性的测定 取部分小鼠肝组织,匀浆,采用比色法依 试剂盒说明书进行测定。 2.5 统计学分析 参数资料经 SPSS10.0软件做方差 分析,多组间均数的比较采用多重比较检验方法 (Bonferroni)。 结 果 1 小鼠血清IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α的含量 各用药组血清 IL-4、IL-6和 TNF-α的含量较 对照组有明显降低(P<0.05),且联合用药组的 IL-4 与单药组相比降低明显 (P<0.05),与正常对照组相 近(P>0.05),而两单药组间差异无统计学意义(P>0.05); IL-2血清含量各用药组较对照组明显升高(P<0.05) (表1)。 10 2.94±0.08 3.26±0.27 117.86±6.71 0.88±0.09 10 2.92±0.06 3.23±0.26 116.89±6.03 0.92±0.08 10 3.28±0.08 2.18±0.25 110.09±5.07 0.57±0.05 10 2.35±0.07 7.95±0.29 139.18±6.18 1.16±0.14 10 3.47±0.12 1.91±0.26 98.95±4.07 0.41±0.08 367· · 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2006年10月第24卷第5期 ChinJParasitolParasitDisOct.2006,Vol.24,No.5 10 0.45±0.09 0.56±0.08 1.09±0.07 10 1.47±0.08 1.44±0.08 0.66±0.05 10 0.79±0.02 0.89±0.08 0.71±0.05 10 0.84±0.09 0.63±0.09 1.01±0.04 10 1.35±0.05 1.22±0.06 0.68±0.05 组 别 小鼠只数 一氧化氮NO 一氧化氮合酶NOS 诱导型一氧化氮合酶iNOS Group No.mice (μmol/gprot) (U/mgprot) (U/mgprot) 表3 小鼠肝组织匀浆中NO、NOS和iNOS的含量和活性检测结果(x±s) Table3 ActivityofNOS,iNOSandNOinhepatictissuehomogenateofmice(x±s) 苦参碱组 Matgroup50mg/(kg·d) 阿苯达唑组 ABZgroup50mg/(kg·d) 苦参碱+阿苯达唑组 Mat+ABZ 25mg/(kg·d)+25mg/(kg·d) 感染对照组 Infectedcontrol 正常对照组 Blankcontrol 组别 小鼠只数 钠钾ATP酶 钙镁ATP酶 乳酸LD 乳酸脱氢酶 Group No.mice Na+-K+ATPase (Ca2+-Mg2+ATPase) (mmol/gprot) LDH*(U/gprot) (μmolPi/mgprot.h) (μmolPi/mgprot.h) 表2 小鼠肝组织匀浆中LD、LDH、Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶的含量和活性检测结果(x±s) Table2 ActivityofLDH,Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPaseandLDinhepatictissuehomogenateofmice(x±s) 2 小鼠肝组织匀浆中 NO、NOS等酶含量和酶活性 测定 各组LDH、NO、NOS和iNOS含量和活性均较感 染对照组有不同程度的下降 (P<0.05),LD仅在联合 用药组明显下降 (P<0.05);各用药组间Na+-K+ATP酶 和Ca2+-Mg2+ATP酶较对照组升高 (P<0.05),ABZ组 Ca2+-Mg2+ATP酶活性较Mat组、联合组及正常对照组 降低,差异有统计学意义 (P<0.05),Mat组、联合用药 组与正常对照组比较无统计学意义(P>0.05)(表2、3)。 讨 论 Th细胞分为Th1和Th2细胞,正常机体Th1/Th2 类细胞因子处于平衡状态,而在寄生虫感染的情况 下,Th1和Th2细胞产生的细胞因子在疾病变化中起 拮抗作用,Th1细胞反应与抗感染免疫有关,Th2细 胞反应则与寄生虫易感性有关[1,3]。宿主感染泡状棘球 蚴后,细胞免疫功能常发生改变,表现为宿主外周血单 个核细胞 (peripheralbloodmononuclearcell,PBMC) 增殖功能低下[4],细胞免疫功能出现异常[5],泡状棘 球蚴病的病程进展与病灶周围的肉芽肿细胞构成、T 淋巴细胞亚群的比例有关[6]。王松等[7]研究发现,小 鼠腹腔感染棘球蚴原头节后,由 B细胞将抗原呈递 Th2细胞处于相对优势,而巨噬细胞将抗原呈递 Th1 细胞处于相对弱势,此时表现出Th2的免疫反应是主 要的。本试验中感染对照组小鼠血清中 IL-4和 IL-6 的含量较正常对照组明显升高 (P<0.05),IL-2的含量 较正常对照组降低 (P<0.05),说明泡球蚴感染引发 的Th1向Th2漂移可能使小鼠机体呈现出Th1向Th2 转化趋势,表现为以Th2细胞为主的优势应答,使泡 球蚴能够逃逸免疫系统的攻击而继续生长。AE小鼠 经药物治疗后,血清中 IL-4和 IL-6的含量较感染对 照组降低 (P<0.05),而 IL-2的含量均呈现不同程度 的上升,尤其是联合用药组的趋势更为显著 (P< 0.05)。Rigano等[8]发现经ABZ治疗的患者,Th1细胞 20059.46±1070.63 20488.25±1809.23 18629.17±4259.27 38285.72±2747.91 17009.07±4448.46 注:*数据进行了Y=lgX转换。 Note:*DataconvertedbyY=lgX. 组别 Group 小鼠只数 No.mice 乳酸LD 乳酸脱氢酶 * (mmol/gprot) LDH*(U/gprot) 苦参碱组 Matgroup50mg/(kg·d) 阿苯达唑组 ABZgroup50mg/(kg·d) 苦参碱+阿苯达唑组 Mat+ABZ 25mg/(kg·d)+25mg/(kg·d) 感染对照组 Infectedcontrol 正常对照组 Blankcontrol 10 1.43±0.09 0.65±0.07 0.37±0.07 10 1.50±0.08 0.54±0.04 0.52±0.09 10 1.27±0.05 0.44±0.08 0.11±0.02 10 2.04±0.08 0.71±0.07 1.01±0.06 10 1.07±0.07 0.43±0.08 - 368· · 中国寄生虫学与寄生虫病杂志2006年10月第24卷第5期 ChinJParasitolParasitDisOct.2006,Vol.24,No.5 类型 (INF-γ升高,IL-4和 IL-10降低)比 Th2细胞 类型 (INF-γ降低,IL-4和IL-10升高)具有优势时, 治疗效果明显。其作用机制可能为①Mat可引起细胞 内钙水平持续性升高,使细胞膜通道关闭,淋巴细胞 不能被激活而使其活力下降[9];②Mat用药后 T细胞 总数维持正常,CD+4Th1型细胞数量增加,CD+4 Th2型细胞数量下降[10],表明Mat可活化Th1型细胞, 逆转由Th1向Th2漂移时可能造成的免疫抑制状态; ③Mat治疗后 IL-6含量降低,可以下调 sIL-2受体活 性[10],一定水平的 IL-2可缓解 PEG2、TGF-β等抑制 性细胞因子的释放,造成免疫细胞无反应性的泡球蚴 局部免疫抑制状态,从而发挥抗泡球蚴作用。 Nicotera等[11]研究发现来源于 iNOS的高剂量的 NO,与机体感染、炎性反应和自身免疫等过程有关, 主要参与机体的病理生理过程。TNF-& 是较早发现的 iNOS激活剂,具有活化巨噬细胞作用,诱导iNOS的 表达。本实验感染对照组小鼠血清中TNF-α的含量与 肝组织iNOS活性变化趋势一致,均较正常对照组明 显升高 (P<0.05),而小鼠肝组织中NO、TNF-& 含量 和 NOS、iNOS的活性各用药组均较感染对照组下降 (P<0.05),iNOS在Mat组及联合用药组下降幅度明显 大于ABZ组 (P<0.05),提示Mat治疗后泡球蚴对肝 脏的免疫损伤有所减轻,与文献报道[9,12]的 Mat具有 免疫调节作用、保肝作用、抗寄生虫作用、逆转和减 低化疗药物的耐药性与毒副作用及促进宿主的抗感染 免疫反应等积极作用相符。用 Mat治疗 AE小鼠后, 不仅其全身病理变化减轻,同时发现肝组织中Na+-K+ ATP酶及Ca2+-Mg2+ATP酶活性较感染对照组升高(P< 0.05),而ABZ组Ca2+-Mg2+ATP酶活性测定数据较感 染对照组有统计学意义 (P<0.05),但低于Mat组和联 合用药组 (P<0.05);Mat组和联合用药组的LD含量 及 LDH活性较之感染对照组均呈现明显降低(P< 0.05),而 ABZ组 LD值与感染对照组相近,明显高 于 Mat组 (P<0.05)。提示 Mat对肝细胞功能具有保 护作用,ABZ则无。表明小鼠感染泡球蚴病时,使用 Mat治疗可减轻线粒体膜、内质网膜、细胞膜上Ca2+- Mg2+ATP酶的钙调负担,减少能量损失,提高 Ca2+- Mg2+ATP酶的活性,从而有效地保护了肝组织结构和 功能。 本实验初步证实Mat对小鼠继发性泡球蚴病有一 定的治疗作用 [13],Mat可能通过某种途径调控Th1和 Th2细胞分化状态的转换,有效改善小鼠的免疫状况, 使泡球蚴感染所造成的 Th1/Th2平衡失调有所逆转。 在泡球蚴感染免疫中,T细胞亚群之间、细胞因子之 间以及T细胞亚群与细胞因子之间既相互作用又相互 制约。随着宿主与泡球蚴之间的关系及感染宿主的免 疫反应类型的进一步阐明,必将推动对泡球蚴病免疫 机制的研究,为泡球蚴病的新药筛选及临床利用细胞因 子及其受体拮抗剂、纠正免疫功能失调提供理论依据。 参 考 文 献 [1]RiganoR,ProfumoE.Serumcytokinedetectionintheclinicalfollow upofpatientswithcysticechinococcosis[J]. 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