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促红细胞生成素对心肌细胞氧化损伤的保护作用
宗刚军 ,吴刚勇 ,王 霄 ,夏 阳 ,张 丽 ,陈满清 ,陈景开
(解放军第 101医院心内科 ,江苏 无锡 214044)
摘要 目的 : 探讨重组人促红细胞生成素 ( rhEPO )对体外培养的乳鼠心肌细胞氧化损伤的保护作用及其机制。
方法 : 建立低浓度过氧化氢诱导原代培养的乳鼠心肌细胞氧化损伤的模型后 ,用 rhEPO 进行干预 ,以噻唑蓝
(MTT)比色法检测 rhEPO对细胞存活的影响。同时通过检测培养介质中乳酸脱氢酶 (LDH )活力、丙二醛 (MDA )
含量及心肌细胞内钠 -钾 ATP酶 (Na + 2K+ 2ATPase)、谷胱甘肽过氧化物酶 ( GSH2PX)活力的改变 ,评价 EPO对心肌
细胞的保护作用 ,并探讨其作用机制。结果 : 在低浓度过氧化氢的作用下 ,体外培养的心肌细胞的存活率降低
( P < 0105)。 rhEPO可明显改善心肌细胞的存活率 ( P < 0105) ,使培养介质中 LDH和 MDA的水平显著下降 ( P <
0105) ,细胞内 Na + 2K+ 2ATPase和 GSH2PX活力显著提高 ( P < 0101) ,同时细胞结构得到改善。结论 : rhEPO可对
抗过氧化氢致心肌细胞损伤 ,作用机制与其抑制脂质过氧化和提高细胞内钠钾泵活力的作用有关。
关键词 : 重组人促红细胞生成素 ;心肌细胞 ;氧化损伤 ;钠钾泵
中图分类号 : Q58 文献标识码 : A 文章编号 : 100927236 (2010) 022183203
作者简介 :宗刚军 ,主治医师 ,博士 Email: zonggj@163. com
Protective effect of erythropo ietin on ox ida tive in jury in cultured ra t car2
d iom yocytes
ZONG Gang2jun, WU Gang2yong, WANG X iao, X IA Yang, ZHANG L i, CHEN M an2qing, CHEN J ing2kai
(Department of Cardiology, PLA 101 Hosp ital, W uxi 210044, J iangsu, China)
Abstract A IM : To exp lore the p rotective effect and mechanism of recombinant human erythropoietin
( rhEPO) on cardiomyocytes against oxidative injury. M ETHOD S: An experimental model of oxidative
injury was established using cultured neonatal rat cardiomyocytes. The survival rate of cultured cardiomyo2
cytes incubated in the p resence or absence of rhEPO was exam ined using the MTT assay. Myocyte damages
were estimated by release of lactate dehydrogenase (LDH ) and cellular structure. Malondialdehyde
(MDA) contentwasmeasured as an index of lip id peroxidation. The activity of Na+ 2K+ 2adenosine triphos2
phatase (Na+ 2K+ 2ATPase) and glutathione peroxidase ( GSH2PX) was also assayed. RESUL TS: The
p resence of rhEPO imp roved the survival of cultured cardiomyocytes. EPO treatment significantly decreased
LDH leakage andMDA production and restored activities of Na+ 2K+ 2ATPase and GSH2PX. CONCLUSION:
Pretreatment with rhEPO p rotects cardiomyocytes from induced injury. The beneficial effect may be related
to its antioxidant p roperties and p rotection of Na+ 2K+ 2ATPase from oxidative injury.
Key words: recombinant human erythropoietin; cardiomyocytes; oxidative injury; Na+ 2K+ 2ATPase
促红细胞生成素 ( erythropoietin, EPO )是一种刺
激骨髓造血的糖蛋白类激素 ,主要由肾脏皮质、髓质
交界处的球旁细胞合成。EPO用于治疗肾性贫血、
癌性贫血 、自身免疫性疾病伴发贫血、骨髓增生异
常综合征等。近年研究发现 , EPO具有多种非造血
生物学功能 ,其保护组织免遭损伤的作用正在成为
目前的研究热点之一 [ 1 ]。同时 ,研究发现 , EPO 的
受体表达于包括心肌细胞在内的体内多种组织上 ,
因而 EPO被认为可能是一种全身性的细胞保护因
子 [ 2 ]。本实验利用低浓度的过氧化氢诱导体外培
养的乳鼠心肌细胞氧化损伤模型 ,观察了重组人
EPO ( rhEPO)对过氧化氢所致心肌细胞损伤的保护
作用 ,并探讨了其作用的机制。
1 材料和方法
1. 1 材料 出生 2~3 d的 Sp rague2Dawley大鼠由
海军医学研究所动物中心提供 (许可证号 : 2002 -
044)。DMEM /F12 干粉型培养基 ( Gibco公司 ,美
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国 ) ,新生牛血清 (Hyclone公司 ,美国 ) , 1 ∶250胰蛋白
酶 (D ifco公司 ,美国 ) ,小鼠抗大鼠心肌α2action单抗
(Santa Crus公司 ,美国 ) , rhEPO (沈阳三生药业公
司 ) , 30 m l/L (W /W )过氧化氢 ( Sigma公司 ,美国 ) ,
乳酸脱氢酶 (LDH )、丙二醛 (MDA )、钠 2钾 2ATP酶
(Na+ 2K+ 2ATPase)和谷胱甘肽 -过氧化物酶 ( GSH2
PX)的检测试剂盒 (南京建成生物
研究所 )。
1. 2 方法
1. 2. 1 乳鼠心肌细胞的原代培养 参照 Simp son
等 [ 3 ]的方法。用 1125 g/L胰蛋白酶反复消化 SD乳
鼠的心室肌组织块至成单细胞悬液 ,以差速贴壁法
分离纯化 ,去除成纤维细胞等非心肌细胞。用含
200 m l/L新生牛血清的 DMEM /F12培养液调节细
胞的密度为 5 ×108 个 /L ,分别接种于 96孔培养板
以及 35 m l的培养皿中 ,置入 50 m l/L CO2 培养箱中
静置培养 24 h后 ,更换无血清培养液 ,继续培养
48 h。待细胞汇合出现整体搏动时 ,采用免疫组化
染色法进行鉴定。具体步骤如下 : ①PBS冲洗 ,多聚
甲醇固定 20 m in; ②30 m l/L H2 O2 阻断内源性过氧
化物酶 10 m in; ③50 m l/L胎牛血清阻断 10m in,滤
纸吸干 ; ④加 100μl小鼠抗大鼠肌动蛋白单抗 , 37℃,
60 m in; ⑤加入 100μl辣根过氧化物酶 (HRP)标记
的二抗 ; ⑥10 m in二氨基联苯胺 (DAB )显色 5 m in,
苏木素衬染 115 m in, 10 m l/L盐酸分化复染 ,吹干 ,
甘油明胶封片显微镜下观察。
1. 2. 2 心肌细胞氧化损伤模型的建立和实验分组
将接种于 96孔培养板上的 30孔心肌细胞 ,随机
分为 3组 ,每组 10孔 ;同时将接种在 30个 35 m l培
养皿中的心肌细胞随机分为 3组 ,每组 10个培养
皿。3个组分别为 : ①对照组 (不加任何处理因素 ) ;
②过氧化氢 ( H2 O2 )组 :加入终浓度为 011 mmol/L
的 H2 O2 ,建立心肌细胞氧化损伤模型 ; ③ rhEPO组
加入 6 U /m l rhEPO孵育 30 m in后 [ 4 ] ,再加入终浓
度为 011 mmol/L 的 H2 O2。各组继续在 37℃、
50 m l/L CO2 培养箱中静置培养 16 h终止培养 ,收
集心肌细胞及培养上清液用于实验。
1. 2. 3 细胞存活率的噻唑蓝 (MTT)比色法检测
将 96孔培养板上的 3组经不同处理的心肌细胞 ,分
别吸出上清液 ,再加入 5 g/L的 MTT 20μl,继续培
养 4 h后 ,弃去上清液。加入二甲基亚枫 (DMSO )
150μl,吸出上清液 , 10 m in后 ,用酶标仪于波长
490 nm下测定吸光度 (A )值。以 A值反映细胞的存
活率 , A值越大 ,存活率越高。
1. 2. 4 LDH、MDA、Na+ 2K+ 2ATPase及谷胱甘肽过
氧化物酶 ( GSH2PX)的检测 取接种在培养皿中的
3组心肌细胞的上清液 ,采用 2, 42二硝基苯肼显色
法 ,测定培养介质中 LDH (U /L , 1 U = 16167 nkat)的
含量 ,以评价 H2O2 对心肌细胞膜损伤的程度。采
用硫代巴比妥酸法 ,测定脂质过氧化反应的终产物 2
MDA ( nmol/L )的含量。心肌细胞内 Na+ 2K+ 2AT2
Pase的活力 ,采取反复冻融法破碎细胞后 ,用定磷
法测定。
以每小时每毫克组织蛋白中的 ATP
酶分解 ATP产生 1μmol/L无机磷的量为 1个 ATP
酶活力单位 (U /L )。GSH2PX活力单位的定义为 :
每毫克蛋白质、每分钟扣除非酶反应的作用 ,使反应
体系中 GSH的浓度降低 1μmol/L者为 1个酶活力
单位 (U /L )。蛋白定量采用考马斯亮蓝法。GSH2
PX活力的测定按试剂盒的#说明
#进行操作。
1. 3 统计学处理 检测结果均以 x ±s表示。各组
间比较采用双因素方差
和 q检验 , P≤0105者
表明差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 心肌细胞形态的倒置相差显微镜观察 倒置
相差显微镜下 ,可见刚分离的心肌细胞呈球形 ;培养
4 h细胞开始贴壁生长 ,呈圆形 ,后变为梭形 ,细胞
贴壁生长并伸出伪足 ,变为三角形、多边形等。培养
48 h细胞基本贴壁 ,细胞逐渐成簇或单层 ,呈放射
状排列的同心圆状 ,搏动呈同步性 (图 1)。差速贴
壁法分离纯化方法培养的心肌细胞 ,经抗肌动蛋白
单克隆抗体免疫组化染色检测鉴定 ,可见细胞核周
呈棕黄色染色 ,细胞核为衬染的蓝色 (图 2)。
图 1 生长 48 h的心肌细胞的倒置相差显微镜观察 ( ×100)
图 2 心肌细胞的免疫组化染色法鉴定 ( ×400)
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2. 2 LDH、MDA、Na+ 2K+ 2ATPase及 GSH2PX检测
与对照组比较 , H2O2 组培养液中 LDH的活力显
著升高 ( P < 0101) ,表现为 LDH的漏出显著减少。
H2O2 组培养细胞上清液中 MDA的含量较对照组有
明显升高 ( P < 0101)。 rhEPO组 MDA与对照组比较 ,
含量无明显差异 ;但明显低于 H2O2 组 ( P < 0105) ,
见表 1。H2O2 组心肌细胞中 Na+ 2K+ 2ATPase 和
GSH2PX的活力与对照组比较 ,明显降低 ( P < 0101) ,
表明 rhEPO 干预后 ,可使 H2 O2 抑制 Na+ 2K+ 2AT2
Pase、GSH2PX的作用显著减轻 ( P < 0101) ,见表 1。
表 1 rhEPO 对 LDH、MDA 及 Na + 2K+ 2ATPase, GSH2PX的
影响 ( n = 10, x ±s)
组别 LDH(U /L)
MDA
( nmol/L)
Na + 2K + 2ATPase
(U /L)
GSH2PX
(U /L)
对照组 13. 36 ±3. 63 0. 82 ±0. 15 2. 98 ±0. 90 16. 92 ±4. 60
H2O2组 35. 79 ±6. 73b 1. 62 ±0. 54b 1. 55 ±0. 39b 10. 35 ±3. 67b
rhEPO组 20. 70 ±5. 12d 1. 02 ±0. 19c 2. 36 ±0. 61d 14. 96 ±4. 53d
与对照组比较 , b P < 0101;与 H2O2 组比较 , c P < 0105, d P < 0101。
2. 3 细胞存活率的 MTT比色法检测 与对照组
(0162 ±0111)比较 , H2 O2 组的吸光度 A值 ( 0138 ±
0104)明显的降低 ( P < 0105) ; rhEPO组 MTT的吸
光度 A 值 ( 0153 ±0122)与 H2O2 组比较 ,明显的升
高 ,差异有统计学意义 ( P < 0105) ;而与对照组比较
差异无统计学意义 ,见图 3。
图 3 3组细胞吸光率
3 讨论
本实验中 ,我们用低浓度 (011 mmol/L)的 H2 O2
模拟心肌细胞的氧化应激状态 ,因此浓度更接近于
体内缺血 /再灌注时活性氧产生的浓度 ,故所造成损
伤过程类似于体内活性氧所致心肌细胞损伤的病理
过程 [ 5 ] ,即以心肌细胞的凋亡样改变为主。本实验
结果显示 , rhEPO干预后 ,可显著减少由于 H2 O2 所
致 LDH漏出量的增加 ,说明 rhEPO可使心肌细胞免
遭 H2 O2 的损伤 ,有助于维持心肌细胞膜的稳定性
和完整性。同时 , rhEPO能显著降低 MDA的含量 ,
并使细胞内 GSH2PX的活力显著升高 ,说明 rhEPO
可抑制由 H2 O2 诱导的脂质过氧化 ,提高内源性抗
氧化酶的活力 ,并
rhEPO对心肌的保护作用与
其抗氧化作用有关。
细胞内 Na+ 浓度的升高可激活质膜上 Na+ /
Ca2 +的交换蛋白 ,加速 Ca2 +向胞浆内转运 ,促进细
胞内 Ca2 +超载 ,使细胞损伤进一步加重 [ 6 ]。研究表
明 ,活性氧可通过对 Na+ 2K+ 2ATPase本身的直接损
伤以及对 Na+ 2K+ 2ATPase所处微环境的改变 ,导致
Na+ 2K+ 2ATPase的活力下降。应用多种自由基清
除剂 (如 SOD和过氧化氢酶等 )可减轻再灌注对心
肌中 Na+ 2K+ 2ATPase的抑制作用 [ 7 ]。本实验表明 ,
rhEPO可减轻 H2O2 对心肌细胞中 Na+ 2K+ 2ATPase
活力的抑制作用。由于 rhEPO可显著降低 MDA的
水平 ,由此提示 , rhEPO可通过抑制脂质过氧化 ,阻
止活性氧对细胞膜的损伤 ,保护 Na+ 2K+ 2ATPase所
处微环境的正常结构和功能 ,并防止由 MDA诱导
的蛋白交联所致 Na+ 2K+ 2ATPase结构的直接破坏 ,
维持 Na+ 2K+ 2ATPase的活力。
总之 , rhEPO可通过抑制脂质过氧化提高内源
性抗氧化酶的活力 ,阻止活性氧对细胞膜的损伤 ,同
时可提高细胞内钠钾泵的活力 ,抑制心肌细胞凋亡
的发生 ,从而实现对心肌细胞的保护作用。
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江西医药 , 2008, 43 (7) : 662 - 663.
(收稿日期 : 2009202215; 接受日期 : 2009207230)
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