哇巴因诱导血液肿瘤细胞增殖的信号通路研究

哇巴因诱导血液肿瘤细胞增殖的信号通路研究 (430022 　武汉) 　华中科技大学同济医学院附属协和医院儿科 　白 　燕 　金润铭 　费洪宝 　　【摘要】　目的 　揭示哇巴因诱导急性淋巴细胞白血病细胞株 J urkat 增殖的信号传导途径。方法 　采用 M TT、Western Blot 等方法 ,观察哇巴因及不同激酶抑制剂对 J urkat 细胞生长的影响 ,同时检测酪氨酸活化水平和丝裂原活化蛋白激酶 MA P K( ER K1/ 2)的磷酸化程度。结果 　哇巴因促使 J urkat 细胞膜酪氨酸磷酸化水平增高 ,并激活 ER K1/ 2。激酶抑制剂 PD98059 ,PP2 , HerbimycinA 和 PP3 均可阻断哇巴因诱导 ER K1/ 2 的活化并抑制哇巴因诱导 J urkat 细胞的增殖。结论 　哇 巴因激活钠泵的信号传导功能 ,引起细胞膜酪氨酸磷酸化水平增高 ,MA P K( ER K1/ 2) 信号途径级联样活化 ,从而导致 J urkat 的增殖反应。Src 激酶和 EGFR 参与了钠泵介导的信号传导。 【关键词】　哇巴因 　钠泵 　信号通路 　　The study of signal pathway in proliferation of Hematology2oncology cells induced by ouabain. B ai Yan , J in R unming , Fei Hongbao. Union Hos pital , Tong j i Medical Col lege , H uaz hong Universit y of Science and Technolog y , W uhan 430022 【Abstract】　Objective 　To explore the signal pathway in proliferation of J urkat cells induced by Ouabain. Methods 　We measured the J urkat cells growth incubated with ouabain and/ or differerent kinase2inhibited reagent s for certain time by M TT test . Meanwhile ,we examed the amount of int racellular phosphorylated ER K1/ 2 as well as the degree of tyrosine phosphoryla2 tion of cell membrane after above treatment by Western Blot . Results 　Ouabain could increase the degree of int racellular phos2 phorylated ER K1/ 2 as well as tyrosine phosphorylation of membrane . And the study further indicated that the function of indu2 cing proliferation of J urkat cells as well as upregulation of phosphorylated ER K1/ 2 could be both blocked by inhibitors such as PD98059 , Herbimycin A ,PP2 and PP3 . Conclusion 　Ouabain activated the signal t ransduction of Na , K2A TPase ,thus increased the tyrosine phosphorylation of cell membrane and int racellular phosphorylated ER K1/ 2 ,and resulted in J urkat cells p rolifera2 tion. The Src kinase and EGFR may take part in the Na , K2A TPase signal t ransduction. 【Key words】　Oabain 　Na , K2A TPase 　Signal pathway 　　虽然有效的化疗使急性淋巴细胞白血病 (ALL)患儿的完全缓解率及长期生存率大大提高 , 但白血病复发及微小残留病灶问题仍未得到有效解 决。哇巴因是一种新近发现的肾上腺皮质激素 ,与 低肾素高血压的发病有密切关系。有研究明哇巴 因能调节多种细胞的生长[ 1 ] 。我院率先验证了哇巴 因对 J urkat 生长同样有调控作用[ 2 ] 。1998 年 Xie 开拓性地提出大鼠心肌细胞钠泵具有信号传导作 用[ 3 ] 。我院此前的研究也发现哇巴因激活了 J urkat 细胞膜钠泵信号传导功能 ,本文将进一步揭示钠泵 的信号传导通路 ,为从信号传导途径入手 ,解决小儿 白血病的复发及微小残留病灶问题寻找新的突破 口。 材料与方法 一、试剂 　四甲基偶氮唑蓝、哇巴因 (oua) ;抑制 剂 HA、PD98059、PP2 、PP3、酪氨酸磷酸化抗体、P2 ER K单克隆抗体、ER K 多克隆抗体、HRP 偶联羊 抗小鼠二抗、HRP 偶联羊抗兔二抗、What man 3MM 滤纸、Nylon 膜及 ECL 底物增强发光试剂盒 由美国俄亥俄医学院谢子建教授馈赠。 二、细胞培养 　J urkat 细胞于含 10 %胎牛血清 的 RPMI1640 培养基中常规培养 ,培养条件为 5 % CO2 ,37 ℃,饱和湿度。所有实验细胞均取自于对数 生长期 ,台盼蓝拒染率均在 95 %以上。 三、M T T 法测细胞增殖率 　将密度为 5 ×104 / ml 的 J urkat 细胞 ,接种于无菌 96 孔板 ,每孔 200 μl。细胞分为 6 组 :第 1 组 (对照组) 不加药 ,第 2 组 加入哇巴因 ;第 3 组先加入 PD98059 (浓度为 20 μmol/ l)孵育 1 小时后加哇巴因 ;第 4 组先加入 HA (终浓度为 3 . 5μmol/ l) 孵育半小时后加入哇巴因 ; 第 5 组先加入 PP2 (终浓度为 10μmol/ l)孵育 15 分 钟后加哇巴因 ;第 6 组先加入 PP3 (终浓度为 10 μmol/ l)孵育 15 分钟后加哇巴因。所加哇巴因的浓 度均为 1 nmol/ L 。每组设三个复孔 ,分别培养 24、 48 小时后 ,每孔加入 M T T (5 mg/ ml) 20μl ,继续孵 育 4 小时 ,离心去上清 ,加入二甲亚枫 150μl 终止 反应 ,振荡 10 分钟后 ,在酶标仪上读取 490nm 波长 处的吸光度 ( A ) 值。增殖率计算 :增殖率 ( %) = ( A 实验组/ A 对照组21 ) ×100 % ·544·华中医学杂志 2005 年第 29 卷第 6 期 © 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 四、Western Blot 法测定细胞酪氨酸磷酸化水 平 　细胞准备同上。将细胞分 4 组 ,第 1 组 (对照 组)不加药 ,余 3 组加入哇巴因的浓度为 1 nmol/ L , 分别孵育 5、10、20 分钟后离心收集细胞。细胞裂解 及余步骤同前。所加一抗为酪氨酸磷酸化抗体 ,所 加二抗为 HRP 偶联羊抗小鼠二抗。 五、Western Blot 法测定加入不同抑制剂后的 细胞 ER K1/ 2 磷酸化水平 　细胞准备同上。分组 如下 :第 1 组 (对照组) 不加药 ,第 2 组加入哇巴因 ; 第三组 :加入 PD98059 (终浓度 20 μmol/ L ) ;第四 组 :先加入 PD98059 (终浓度为 20 μmol/ L ) 孵育 1 小时后加哇巴因 ;第 5 组 :加入 HA (终浓度 3 . 5 μmol/ L) ;第 6 组 :先加入 HA (终浓度为 3 . 5μmol/ L)孵育半小时后加入哇巴因 ;第 7 组 :加入 PP2 (终 浓度为 10μmol/ L) ;第 8 组 :先加入 PP2 (终浓度 10 μmol/ L) 孵育 15 分钟后加哇巴因 ;第 9 组 :加入 PP3 (终浓度 10μmol/ L) ;第 10 组 :先加入 PP3 (终 浓度为 10μmol/ L) 孵育 15 分钟后加哇巴因 ,所加 哇巴因的浓度均为 1 nmol/ L ,加入哇巴因 10 分钟 后离心收集细胞。细胞裂解及余步骤同前。 六、数据分析 　用 SPSS6 . 0 对结果进行方差齐 性检验及 t 检验。 结 　　果 一、M T T 法测细胞增殖率 　结果见附表 ,可见 1 nmol/ L 哇巴因对 J urkat 细胞有明显促增殖作用 ( P < 0 . 01) ,而加入各种抑制剂后均不同程度抑制 了哇巴因的诱导增殖作用 ( P < 0 . 01) 。 附表 　M TT 法检测结果 ( % ,Šx ±s) 组别 n 24 小时 48 小时 不加药对照组 30 18 . 5 ±2 . 3 70 . 4 ±1 . 2 oua 30 30 . 2 ±1 . 5 * 101 . 3 ±3 . 5 * PD980959 + oua 30 13 . 1 ±0 . 8 3 43 . 1 ±2 . 7 3 HA + oua 30 12 . 0 ±1 . 3 3 41 . 2 ±2 . 4 3 PP2 + oua 30 15 . 5 ±1 . 4 * 40 . 3 ±2 . 1 * PP3 + oua 30 16 . 2 ±2 . 1 * 51 . 4 ±1 . 7 * 与不加药组比较 3 P < 0 . 01 　　二、Western Blot 法检测细胞酪氨酸磷酸化程 度 　结果显示 J urkat 细胞酪氨酸磷酸化水平在加 入哇巴因 5 分钟时即明显增加。如图 1 所示。 三、Western Blot 法检测不同抑制剂对哇巴因 作用的影响 　如图 2 、3 所示 ,1 nmol/ L 哇巴因作用 J urkat细胞1 0分钟 ,明显激活MA P K ( ER K1 / 2 ) , 图 1 　1 nmol/ L 哇巴因作用不同时间胞膜酪氨酸磷酸化程度 图 2 　加入不同抑制剂后对哇巴因激活胞内 ERK1/ 2 的影响 上图为磷酸化 ER K1/ 2 的表达 ,下图为总 ER K1/ 2 的表达 图 3 　不同抑制剂对哇巴因激活胞内 ER K1/ 2 的影响 上为磷酸化 ER K1/ 2 的表达 ,下为总 ER K1/ 2 的表达 而 Herbimycin A、PD98059、PP2 、PP3 均不同程度 抑制了哇巴因对 MA P K( ER K1/ 2)的激活。 讨 　　论 钠泵逆浓度梯度转运细胞膜内外钠钾离子的功 能为大家熟知。哇巴因是新近发现的肾上腺皮质激 素 ,本研究以急性淋巴细胞白血病细胞株 J urkat 为 研究材料 ,发现哇巴因与钠泵结合后细胞内 MA P K 信号途径被激活 ,同时诱导 J urkat 细胞增殖 ,在血 液肿瘤细胞上进一步证实了钠泵具有信号传导功能 这一理论。 丝裂原活化蛋白激酶 MA P K 途径是典型的细 胞生长调控信号通路 ,与细胞增殖、分化、凋亡等有 密切关系。胞外信号激活 MA P K 通路后 , ER K1/ 2 被磷酸化激活 ,活化的 ER K1/ 2 转移至细胞核内 , 诱导转录因子表达并启动下游基因的转录 ,直接效 应是使细胞增殖。Xie 发现 ,哇巴因部分抑制钠钾 泵后 ,引起大鼠心肌细胞内 MA P K( ER K1/ 2) 信号 传导途径的级联样激活[ 3 ] 。本实验预先加入 M E K1 抑制剂 PD98059 ,能完全抑制哇巴因引起的细胞内 ER K1/ 2 的磷酸化 ,同时抑制了哇巴因诱导 J urkat 增殖的作用 (附表、图 2) ,而 M E K1 是 ER K1/ 2 的上 ·644· Central China Medical Journal ,2005 ,Vol. 29 ,No. 6 © 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 游激酶 ,直接磷酸化 ER K1/ 2 使其活化 ,显然 ,哇巴 因诱导 J urkat 细胞增殖 ,主要是通过激活 ER K1/ 2 信号途径而发挥作用。 钠泵是典型的离子通道蛋白 ,不需要特异配体 的激活而维持着钠钾离子的交换。Aslihan[ 4 ] 用 1 nmol/ L 哇巴因刺激狗血管内皮细胞 ,仍检测到细胞 内 ER K1/ 2 途径的活化 ,而在此浓度下 ,哇巴因几 乎不影响钠泵的离子通道功能 ;另外 , Liu 降低大鼠 心肌细胞内 K+ 的浓度 ,以造成钠泵功能受抑后胞 内离子浓度的变化 ,并未检测到 ER K1/ 2 的磷酸化 增强 ,充分说明钠泵的信号传导功能不是钠钾离子 浓度变化介导的。本实验结果显示 ,加入哇巴因 5 分钟后 ,多个胞膜蛋白磷酸化条带增强 (图 1) ,说明 哇巴因与钠泵结合后引起了其它胞膜蛋白的活化。 Michael 用免疫共沉淀法 ,发现大鼠心肌细胞钠泵 激活后的免疫复合物中有 Src 激酶及表皮生长因子 受体 ,从而认为哇巴因结合钠泵后 ,通过 Src 激酶交 替活化了表皮生长因子受体 ,而后者激活 MA P K ( ER K1/ 2)的信号级联的作用已众所周知。笔者虽 然还没有直接的证据证明 J urkat 细胞膜钠泵交替 活化表皮生长因子受体 ,但是结果显示非特异性酪 氨酸激酶抑制剂 HA 、Src 激酶抑制剂 PP2 及 EG2 FR 抑制剂 PP3 能明显抑制哇巴因诱导的胞内 ER K1/ 2 的激活及 J urkat 细胞的增殖 (表 1、图 2、图 3) ,肯定了 Src 激酶与表皮生长因子受体参与 J ur2 kat 细胞膜钠泵的信号传导的作用 ,这在淋巴肿瘤 细胞上的发现尚属首次。 参 考 文 献 1 Shih2chieh Chueh , J ih2hwa Guh , J un Chen et al. Dual effect s of ouabain on the regulation of proleferation and apoptosis in human prostatic smooth muscle cells. J Urol2 ogy ,2001 ,166 (1) :347 2 　金润铭 ,白 　燕 ,熊安秀. MA P K信号通路参与哇巴因诱 导 J urkat 细胞的增殖 . 中国实验血液学杂志 , 2005 , 13 (1) :126 3 　Peter K ,Jie L ,L uigi G et al. Multiple Signal Transduction Pathways Link Na + / K+ 2A TPase to Growth2related Gene in Cardiac Myocyte. J Bio Chem , 1998 , 273 ( 24 ) : 15249 4 　Aydemir2Koksoy A ,AbramouitzJ ,Allen Jc et al. Ouabain2 induced Signaling and Vascular Smooth Muscle Cell Pro2 liferation. J Bio Chem ,2001 , 276 (49) :46605 收稿日期 :2005 . 8 . 25 . 喉罩用于脊髓空洞症的麻醉体会 (434000 　荆州) 　湖北省荆州市第一人民医院麻醉科 　柳德洪 　王际忠 　夏 　瑞 　黄礼宇 　　喉罩是介于气管插管与面罩之间的通气工具 ,作为一种 新型的通气方法 ,现已广泛应用于临床。笔者近期使用喉罩 对 1 例脊髓空洞症病人施行麻醉 ,现将麻醉处理及体会 如下。 临 床 资 料 一、病例 　女 ,39 岁 ,身高 1 . 60 米 ,体重 52 kg ,患子宫肌 瘤 ,拟行子宫次全切除术 ,既往有脊髓空洞症病史 15 年。体 检 :左侧颈、上肢、上胸段痛温觉消失 ,左腹部较右侧痛觉迟 钝。双下肢运动感觉正常。颈部前后活动受限 ,脊柱强直。 MRI提示 :颈段至胸 9 段脊髓空洞。X线检查 :环枕畸形 ,两 肺野清晰。心电图 :窦性心律 ,正常心电图。 二、麻醉方法 　术前肌注安定 10 mg ,阿托品 0 . 5 mg。 麻醉诱导 :静脉分次给地塞米松 10 mg ,咪达唑伦0 . 1 mg/ kg ,芬太尼 3μg/ kg ,丙泊酚 2 mg/ kg 后插入 3 号喉罩 ,静脉 推注维库溴铵0 . 12 mg/ kg。麻醉维持 :吸入 O2 及1 . 5 %～ 2 . 0 %安氟醚 ,间断静注维库溴铵0 . 06 mg/ kg ,芬太尼 1 . 5 μg/ kg。监测 SpO2 、ECG、NiBp、ETco2 ,手术时间 2 小时 ,术 毕自然清醒拔管。术后 1 周随访脊髓空洞症无变化。 讨 　　论 脊髓空洞症系中枢神经系统疾病 ,此类病人存在不同程 度的生理缺陷和身体变异 ,给麻醉操作及管理提出特别要 求 ,通过此病人笔者体会如下 : 一、脊髓空洞症大多伴有脊柱畸形如脊柱侧弯、后突畸 形、隐性脊柱裂等。选择连硬外麻醉穿刺困难 ,效果不确切 , 易引起并发症。此种病症是一种缓慢进行性脊髓变性疾病 , 其症状及范围易随时间的推移而加重 ,病人易产生对脊髓麻 醉的误解 ,因此选择全麻较好。 二、此类病例大多伴有不同程度的环枕畸形 ,应防止头 颈过度后仰而诱发脑疝致呼吸停止 ,若头颈部过度扭曲 ,可 引起呼吸停止或四肢突然瘫痪。此类病人常有神经元性瘫 痪 ,不宜使用去极化肌松药。置入喉罩时 ,不需使用肌松药 , 不必托下颌 ,不必颈部后仰而使颈椎移位。 三、喉罩不进入气管 ,避免了气管插管、麻醉过浅及拔管 时对气管的刺激 ,引发呼吸紊乱、呛咳 ,脑压增高促发脑疝。 术毕病人自然清醒 ,无强烈的不适感 ,抽出喉罩内气体后病 人能自己吐出喉罩 ,病人复苏安全、平稳、自然。 收稿日期 :2005 . 5 . 16 . ·744·华中医学杂志 2005 年第 29 卷第 6 期 © 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net