支原体快速培养诊断儿童肺炎支原体感染的临床研究

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）是能 独立生长的最小微生物，大小约为 200 nm。MP除引 起上呼吸道感染、支气管炎、肺炎等急性呼吸道感 染外，亦可引起机体多系统多脏器的损害［1］。 MP 感 染可发生于任何年龄，以儿童居多［2］。 MP 感染多缺 乏典型的临床症状和体征，临床常通过咽拭子聚合 酶链反应（PCR）法和血清 MP 被动凝集法检测，但 受病程和条件制约［3］，早期诊断较为困难。为了探讨 MP 快速培养在诊断肺炎支原体感染中的临床价值 和意义，本研究对南京医科大学附属常州第二人民 支原体快速培养诊断儿童肺炎支原体感染的临床研究 董燕芬，范 静，刘 乾，夏 蕾，马玲娣 （南京医科大学附属常州第二人民医院中心实验室，江苏 常州 213003） ［摘 要］ 目的：探讨肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）快速培养法在诊断儿童 MP 感染中的临床价值，并分析其影响 因素。 ：MP 快速培养鉴定患儿咽试子标本，被动凝集法检测血清 MP 抗体（MP-Ab），分析 MP 感染的相关临床因素。 结果： MP 快速培养与 MP-Ab 检测诊断 MP 感染的阳性率基本一致， 差异无统计学意义 （P＝0．556）。 女性儿童 MP 培养的阳性率 （46．26％）略高于男性（42．16％）。 3～5岁幼儿的 MP培养阳性率（54．05％）明显高于其他各组（P ＜ 0．001）。 冬、春季 MP培养阳性率分 别为 48．05％和 49．03％，显著高于夏秋两季（26．26％和 36．97％，P ＜ 0．001）。MP感染患儿体温增高、咳嗽、咳痰等症状与 MP培养结果 无明显相关性，血液常规分析中性粒细胞比值显著上升，与其他呼吸道感染相似，尚不能作为诊断 MP感染的独立指证。 结论：MP 感染冬春易发，儿童易感。 MP感染缺乏特异的临床症状和体征，MP快速培养对早期快速诊断儿童 MP感染具有重要临床价值和意 义。 ［关键词］ 肺炎支原体； 快速液体培养； 早期诊断； 抗体检测 ［中图分类号］ R446．5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1007-4368（2010）10-1481-05 Clinical study on MP rapid culture for diagonosis of mycoplasma pneumoniae infection DONG Yan-fen，FAN Jing，LIU Qian，XIA Lei，MA Ling-di （Laboratory Center，Changzhou Second Hospital Affiliated to NJMU，Changzhou 213000，China） ［Abstract］ Objective：To evaluate the clinical value of rapid culture of Mycoplasma pneumoniae （MP） in diagnosis of MP for children and explore the potential influence factors related to the MP rapid culture． Methods：The rapid MP culture method was used for throat swabs of acute respiratory infection，and passive agglutination assay was used to detect serum MP antibody（Ab）． Meanwhile the multi- ple related factors which can influence the MP infection were analyzed． Results：Female children patients’ positive rate of MP culti- vation was 46．26％，higher than male children’s （42．16％）． The positive rate of rapid MP cultivation for children with 3～5 years old were 54．05％，highest among all groups with different years old （P ＜ 0．001）． The results of rapid MP cultivation was different a- mong 4 seasons． The positive rates of rapid MP cultivation in winter and spring were 48．05％ and 49．03％ ，respectively，obviously higher than those in summer and autumn （26．26％ and 36．97％，respectively）（P ＜ 0．001）． Moreover，the positive rate of rapid culture for MP was in line with the results of serum MP-Ab detection （P＝0．556）． No evidence was found between the common clinical symptoms such as fever，cough，expectoration and infection of MP． The increasing percentage of blood neutrophile granulocyte was similar to the respiratory infection resulting from the other pathogenic microorganisms，suggesting this can not be viewed as an independent index for diagnosis of MP inflection． Conclusion：MP inflection is common in winter and spring． Children and old people is easily in- fected． Children with 3～5 years old is susceptible to MP infection． The patients with MP infection is lack of special clinical symp- toms． The rapid MP cultivation method plays a significant role in early rapid diagnosis of MP infection． ［Key words］ Mycoplasma pneumoniae； rapid culture； early diagnosis； antibody detection ［Acta Univ Med Nanjing， 2010， 30（10）: 1481-1484，1490］ 第 30 卷第 10 期 2010 年 10 月 南京医科大学学报（自然科学版） ACTA UNIVERSITATIS MEDICINALIS NANJING（Natural Science） 1481· · 第 30 卷第 10 期 2010 年 10 月南 京 医 科 大 学 学 报 1 MP 培养与 MP-Ab 检测阳性率分析 Tab 1 Analysis of the MP culture and MP-Ab positive rate MP 快速培养 MP-Ab 检测 阳性例数（n） 阳性率（％） P 55 49 27．50 24．50 0．556 医院儿科收治的 2 011 例疑似 MP 急性呼吸道感染 患儿进行了 MP快速液体培养， 以了解不同年龄及 性别患儿 MP 感染的发生情况及相关的影响因素， 并将其结果与血清 MP 被动凝集检测法进行了比 较，现将结果报告如下。 1 资料与方法 1．1 资料 2008年 5月～2009 年 4 月就诊的疑似 MP 急性 呼吸道感染患儿 2 011 例， 其中入院收治患儿 383 例，门诊就诊患儿 1 628 例。 患儿按年龄分为 4 组： 婴儿期（≤1 岁）139 例，幼儿期（1～2 岁）294 例，学 龄前（3～5岁）803例，学龄期（6～12岁）775例。 所有 患儿均于就诊当日由儿科护士无菌采集咽试子标 本，同一患儿只取首次采样结果进行分析。 1．2 方法 1．2．1 MP快速液体培养 MP 快速鉴定培养基购自陕西百盛园生物技术 科技公司。 操作严格按试剂说明进行：以无菌生理 盐水浸湿棉拭子，在就诊患儿口咽喉部（最好是扁 桃体发炎部位）捻转数次后，取出并迅速置于已打 开盖的 MP快速鉴定培养基小瓶中， 在瓶内搅动数 次后，去除咽拭子瓶外多余部分，盖上瓶塞，将培养 瓶置于 37℃孵箱中，培养 24 h后观察结果。 结果判 断：24 h 后瓶内培养基颜色由原来的红色澄清变成 黄色澄清判为阳性，培养基颜色保持不变或变浑浊 判为阴性。 1．2．2 血清 MP被动凝集法检测 MP抗体（MP-Ab） 被动凝集法 SERODIA-MYCOⅡ MP-Ab 诊断试 剂盒购自日本富士瑞必欧株式会社。 检测原理：人 工合成的 MP（Mac 株）细胞膜致敏的明胶颗粒可与 人血清中存在的 MP-Ab（IgA＋IgM＋IgG）发生肉眼可 见的凝集反应，通过观察其凝集反应的发生，对患 儿血清中的 MP-Ab 进行半定量分析。 无菌抽取患 儿 2 ml全血， 离心后去除红细胞及其他有形成分， 在微量反应板上按倍比稀释法依次加入血清、血清 稀释液和明胶颗粒，室温静置 3 h 后，通过平板观测 器与标准凝集图像进行对比，读取结果。 结果判定： 样品与未致敏粒子（阴性对照）（1∶20 稀释）的反应 判为阴性（－），与致敏粒子（1∶40 稀释）反应判为阳 性（＋），以出现阳性反应时未致敏粒子的最终稀释 倍数作为 MP-Ab 抗体的滴度；此外，不论样品与未 致敏粒子呈现何种反应图像，只要样品与致敏粒子 （1∶40稀释）无反应即可判为阴性。 1．2．3 MP快速液体培养与 MP-Ab 血清学检测结果 比较 对其中临床上已确诊为急性呼吸道感染，疑似 MP 感染收治入院的 200 名患儿留取咽拭子标本进 行 MP快速培养，同时常规留取患儿血液标本，被动 凝集法检测血清中 MP-Ab 滴度，对两种方法获得的 检测结果进行比较， 以评价两种检测方法用于 MP 感染实验室诊断的吻合性和临床符合率。 1．2．4 不同性别、年龄、季节 MP培养结果分析 统计 2 011 名不同性别及年龄组患儿中 MP 快 速培养的阳性率，研究 MP 感染的发生和分布状况， 分析年龄或性别与 MP 感染的关系； 同时将样本按 采集时间做如下分组 ：春 （3～5 月份 ），夏 （6～8 月 份），秋（9～11 月份），冬（12～2 月份），分析不同季节 采样 MP 培养的阳性率， 了解 MP 感染发生率与季 节的关系。 1．2．5 MP 感染临床症状与 MP 培养结果的多因素 相关分析 收集其中 194 例疑似 MP 感染入院呼吸道感染 患儿的临床病例资料，调查了患儿感染后的一般情况 及临床基本症状体征（包括咳嗽、咳痰、体温等），同时 留取患儿血液标本行血液常规分析，进一步分析其临 床症状、体征、实验室检查结果与 MP感染的关系。 1．3 数据处理 SPSS13．0 软件进行数据的统计学分析，单因素 分类计数资料行卡方检验，P ＜ 0．05 有统计学意义； 多因素相关分析采用 Logstic法进行。 2 结 果 2．1 MP培养与 MP-Ab检测结果比较 检测了 200 例患儿， 其中 55 例 MP 培养阳性 （27．50％），49 例 MP-Ab 检测阳性（24．50％），两种方 法所得到的 MP 阳性率无显著差异 （表 1）。 此外， 200 例患儿中 128 例患儿两种方法得到的结果较为 一致，其中 16 例 MP 培养和 MP-Ab 检测均为阳性， 112 例均为阴性；72 例患儿结果 MP 培养和 MP-Ab 检测的结果差异较大，但总体分析两种方法所得到 的检测结果一致性不佳（表 2）。 1482· · 表 2 MP 培养与 MP-Ab 检测结果比较 Tab 2 Comparis of the results of MP culture and MP-Ab test （n＝200） MP 快速培养（＋） MP 快速培养（－） MP-Ab（＋） MP-Ab（－） Kappa-Value 16 33 39 112 0．066 2．2 不同性别、年龄及季节 MP培养结果分析 结果如表 3 所示，2 011 例受检患儿中，884 例 MP 快速培养阳性，MP 培养阳性率为 43．96％，其中 女性患儿 MP 培养阳性率 （46．26％） 略高于男性 （42．16％），但统计学分析显示两者无显著差异（P＝ 0．066）。 不同年龄组患儿中，婴儿组（≤1 岁）MP 培 养阳性率最低，为 16．55％，学龄前儿童（3～5 岁）阳 性率最高，为 54．05％，1～2 岁与 6～12 岁患儿 MP 培 养阳性率分别为 42．52％与 43．74％， 提示不同年龄 患儿中 MP感染的发生情况明显不同。 对来自不同 季节 MP 培养结果的分析发现， 不同季节 MP 培养 的阳性率显著不同（P ＜ 0．001），其中春季采样结果 中 MP 培养的阳性率最高（49．03％），冬季、秋季次 之 ， 分别为 48．05％和 36．97％ ， 夏季最低 ，为 26．26％。 实际工作中也发现，夏季送检的标本量仅 为春季送检标本的 1 ／ 4 左右，提示春季作为呼吸道 感染的高发季节可能同时也是 MP 感染的高发季节 （表 4）。 2．3 临床相关因素与 MP培养的多因素分析 对 194 例患儿临床资料进行分析发现，女性患 儿的 MP培养阳性率略高于男性， 但二者总体间无 显著性差异，这与大样本分析（2 011 例）的结果一 致。 血常规分析显示患儿的白细胞总数及淋巴细胞 百分率无明显改变， 中性粒细胞百分率明显增高。 此外，患儿多有发烧，咳嗽、咳痰等症状，但与 MP 感 染无明确的相关性（P ＞ 0．05，表 5），提示 MP 感染 缺乏较为特异或典型的临床指征， 仅凭 MP 感染后 的临床表现尚无法对 MP 感染做出早期诊断， 需要 依赖 MP 快速培养等实验室辅助检查对 MP 感染进 行早期有效的诊断。 表 5 临床相关因素与 MP 培养的 Logstic 回归分析 Tab 5 Analysis of the clinical relevant factors and MP culture with Logstic regression 性别 药物治疗 咳嗽 咳痰 发热 白细胞总数 中性粒细胞百分比 淋巴细胞百分比 诊断 0．139 0．224 －0．354 －0．074 0．854 －0．063 1．444 －0．627 0．443 相关因素 B S．E． Wald P OR 95％CI B：回归系数；S．E．：标准误。 0．383 0．265 0．321 0．429 0．438 0．050 0．680 0．745 0．238 0．132 0．717 1．212 0．030 3．802 1．638 4．502 0．709 3．462 0．716 0．397 0．271 0．862 0．051 0．201 0．034 0．400 0．063 1．150 1．251 0．702 0．928 2．349 0．939 4．237 0．534 1．557 0．543～02．436 0．745～02．101 0．374～01．318 0．401～02．151 0．996～05．541 0．852～01．034 1．116～16．077 0．124～02．298 0．977～02．481 3 讨 论 目前临床常用的 MP 感染诊断方法主要有 MP 培养、 血清学 MP抗体检测和 MP核酸检测等。 MP 分离培养是支原体鉴定的金标准， 可真实反映 MP 感染的存在，但因 MP 培养要求较高，生长缓慢，费 表 3 不同性别及年龄 MP 培养结果分析 Tab 3 Analysis of the culture results of MP among different gender and age 性别 年龄 男 女 ≤1 岁 1～2 岁 3～5 岁 6～12 岁 分组 患儿 χ2 P-Value *：与 3～5 岁组相比。 1 129 882 139 294 803 775 476 408 23 125 434 339 42．16 46．26 16．55 42．52 54．05 43．74 3．37 66．71 11．45 16．76 ＜ 0．066 ＜ 0．001* ＜ 0．001* ＜ 0．001* MP 培养 阳性（n） 阳性率 （％） 患儿 （n） 表 4 不同季节的 MP 培养结果分析 Tab 4 Analysis of the MP culture results in different sea- sons 春（3～5 月份） 夏（6～8 月份） 秋（9～11 月份） 冬（12～2 月份） 季节 患儿 χ2 P-Value 775 198 422 616 380 52 156 296 49．03 26．26 36．97 48．05 45．83 ＜ 0．001 MP 培养 阳性（n） 阳性率 （％） 患儿 （n） 董燕芬等：支原体快速培养诊断儿童肺炎支原体感染的临床研究 第 30 卷第 10 期 2010 年 10 月 1483· · 第 30 卷第 10 期 2010 年 10 月南 京 医 科 大 学 学 报 （下转第 1490页） 时较长，临床难以作为常规项目开展 ［4－5］。 血清学方 法检测 MP-Ab 具有快速、敏感和特异的优点，并可 用于血清 MP 特异性抗体的定量 ［6］，但由于机体感 染 MP后 5～7天才产生特异性抗体［7］，受窗口期或患 者自身免疫功能的影响， 临床易出现假阴性结果［6］。 PCR 技术与荧光偏振技术结合可早期诊断 MP 感 染 ［8］，且不受患者免疫功能的影响，但技术和设备要 求高，目前尚无法在临床普及。 此外间接免疫荧光 法检测咽分泌物中的肺炎支原体抗原，可半定量动 态评估 MP患儿治疗情况，但操作繁琐，目前已较少 应用［9］。 MP 快速鉴定培养基是一种人工合成专用于肺 炎支原体快速培养鉴定的液体培养介质。 培养基中 有根据 MP生长繁殖要求合理配置的营养成分以及 生长因子等促进 MP 快速生长； 另有特殊的抑菌物 质，可在一定时间内有效抑制标本中细菌和其他微 生物的生长。 通过 MP 生长过程中产生代谢物使培 养基颜色发生改变来判断 MP 的有无，培养 24 h 后 就可判断结果，具有方便、快捷、特异的优势。 采样 后立即放入培养瓶中，也解决了支原体对热和干燥 敏感的问题。 谢世营等 ［10］曾用荧光定量 PCR 法对 MP快速培养法的结果进行验证，发现 MP 快速培养 阳性的标本荧光定量 PCR 检测结果 100％为阳性， MP 培养为阴性的标本 PCR 定量结果 96％为阴性， 他们的研究认为 MP 快速培养法诊断 MP 感染的特 异性和准确性都与荧光定量 PCR 法相近，且简单易 操作，适宜临床早期诊断 MP感染。 本研究同时对 200 例患者的咽拭子和血清样 本分别进行 MP 快速培养和血清 MP-Ab 检测，发现 两者的结果一致性不佳。 考虑二者检测 MP 感染的 原理不同，因此临床适用的检查时间及病程也有所 不同。MP-Ab一般在 MP感染后 1周左右出现，随着 MP 感染进程， 抗体滴度逐渐增高，10 天方可检出 MP-Ab，1 个月左右达高峰；MP 快速培养不需等待 机体产生抗体，故急性感染早期（1～3 天）即可得到 阳性结果。我们认为，临床一旦怀疑 MP感染发生时 宜尽早进行 MP 培养，帮助尽快确诊 MP 感染，感染 发生后 5～7 天可进行血清 MP-Ab 的动态检测，因 MP-Ab 滴度越高，患儿临床症状越严重，发热持续 时间也更长［11］，因此血清 MP-Ab 的检测结果有助于 临床病程监测，指导治疗。 本研究结果还显示， 尽管女性患儿的 MP 培养 阳性率略高于男性，但总体差异不显著。 对不同年 龄段患儿 MP 培养的阳性率的分析显示，3～5 岁的 学龄前儿童罹患 MP 感染的几率明显高于其他年龄 组，0～1岁婴儿 MP感染机率最低。 但也有文献［12］报 道 MP是 1岁以下婴儿肺炎的重要病原体， 这有可 能是不同研究群体造成的差异。 1～3 岁婴幼儿感染 MP 的机率尽管比其他年龄患儿低， 但因该年龄段 患儿免疫系统发育不完善， 对疾病的抵抗力较差， MP 感染后易导致严重的并发症，故需格外重视 ［13］。 气候及温度因素对 MP 感染的发生有较大影响，春 季为 MP感染的高发季节，冬季次之，夏季最少。 我 们认为季节交替时节气候、温度的变化较大，人群 抵抗力下降可能是重要因素。 此外，夏季气候炎热， 紫外线较强，呼吸道细菌或病毒繁殖被抑制，也不 易患病。 也有人认为夏末秋初为我国中小学及幼儿 园的开学时间，儿童重新聚集到学校、幼儿园，易造 成小范围 MP 感染爆发可能也是导致 MP 培养率较 高的原因之一［14］。 儿童 MP 感染早期缺乏特异的临床症状和体 征，仅表现为发热、咽痛、咳嗽等一般呼吸道感染症 状［15］，很难与一般病毒引起的呼吸道感染区别，治疗 不及时，可进一步引起哮喘、肺炎，甚至还可侵犯心、 脑、肝、肾等肺外器官，导致多种并发症的发生 ［15－16］， 因此及时、有效的 MP感染实验室诊断十分必要。我 们的研究结果显示，除患者体温升高及中性粒细胞 比值显著增高外，咳嗽、咳痰、白细胞总数及淋巴细 胞比值均与 MP感染无明显相关，这与文献报道 MP 感染缺乏典型的临床表现与体征相一致［17］。 综上所述，MP 快速培养是一种有效的早期诊 断 MP 感染的方法，其结果与 MP-Ab 血清学检查吻 合性较好，且临床干扰因素少，周期短，特异性好， 尤其适合临床疑似 MP 急性呼吸道感染患儿的早期 筛查。 ［参考文献］ ［1］ 顾亚明，张冬玲，马业耕 ． 肺炎支原体肺外损伤 101 例 特征分析 ［J］． 南京医科大学学报 （自然科学版 ）， 2007，27（3）；278－279 ［2］ Principi N，Esposito S． Mycoplasma pneumoniae and C- hlamydia pneumoniae cause lower respiratory tract dis- ease in paediatric patients ［J］． Curt Opin Infect Dis， 2002，15（3）：295－300 ［3］ 赵 阅，孙红妹． 肺炎支原体实验诊断技术现状及发展 ［J］． 国际呼吸杂志，2009，29（5）：304－308 ［4］ 孙红妹 ． 肺炎支原体感染的实验室诊断［J］． 实用儿科 临床杂志，2007，22（4）：245－248 1484· · 第 30 卷第 10 期 2010 年 10 月南 京 医 科 大 学 学 报 ［5］ Ravin 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