诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、 鉴定和初步应用.doc

诺如病毒达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、 鉴定和初步应用.doc 诺如病毒表达衣壳蛋白单克隆抗体的制备、 鉴定和初步应用 【摘要】 目的: 建立能稳定分泌抗诺如病毒(Norovirus)N蛋白的单克隆抗体(mAb)细胞株, 制备抗诺如病毒核衣壳蛋白的mAb, 为诺如病毒的早期快速检测及致病机制的研究提供实验材料。: 用E.coli表达的G?组广州株NVgz01(DQ369797)Norovirus N蛋白免疫BALB/c小鼠, 通过PEG使小鼠脾细胞和Sp2/0细胞融合, 使用HAT选择性培养基培养融合细胞, 用间接ELISA和Western blot测定mAb的效价、 免疫球蛋白亚型和mAb的特异性, 并将各mAb之间进行配对。结果: 通过细胞融合和克隆化, 共筛选出4株分泌抗Norovirus N蛋白抗体的杂交瘤细胞株N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9。间接ELISA和Western blot检测结果表明, 这4株mAb都可以与E.coli表达的G?组广州株Norovirus N蛋白产生特异性反应, 并且能与天然粪便标本中的G?组Norovirus产生特异性反应。配对结果显示N2C3和N7C2之间配对, 对表达蛋白和天然病毒都具有较强的检测灵敏度。结论: 获得了诺如病毒G?组特异性mAb, 为制备免疫诊断试剂盒及致病机制的研究奠定了基础。 【关键词】 Norovirus NVgz01 核衣壳蛋白 单克隆抗体 诺如病毒作为流行性肠胃炎的主要病因之一, 无论在发展中国家还是发达国家, 从儿童到成年人都可以受到诺如病毒感染, 并可造成爆发流行, 成为影响人类健康的不可忽视的问, 近年来逐渐引起了研究者的重视。美国CDC经过评估认为, 每年在美国发生的食源性疾病有2 300万宗是由诺瓦克及诺瓦克样病毒引起的,1,; 在欧洲, 数据显示1995,2000年间, 有超过85,的食源性病毒肠胃炎爆发案例由诺瓦克及诺瓦克样病毒引起,2,。由于人类诺如病毒分为G?和G?两组,3, 4,, 根据北京,5,、 太原,6,和武汉,7,三地的血清学调查结果, 初步认为G?组病毒为我国主要流行组。由于诺如病毒无法在体外感染细胞及动物模型来进行培养分离鉴定, 目前对诺如病毒的诊断方法主要是免疫电镜法(IEM)、 放射免疫法(RIA)、 ELISA法、 RealTime PCR法等,8,, 其中, 夹心ELISA方法, 即使用单克隆抗体(mAb)捕获患者粪便标本中的病毒抗原来进行检测的方法, 由于交叉反应性小, 特异性较强且敏感度较高, 成为目前研制诺如病毒检测试剂所主要采用的方法。本研究中我们以E.coli表达的G?组广州株Norovirus N蛋白作为免疫原, 免疫BALB/c小鼠并制备mAb, 为研制诺如病毒检测试剂盒奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 诺如病毒粪便标本为使用DakoCytomation公司的IDEIA Norovirus 抗原检测试剂盒检测为阳性的标本。6周龄的雌性BALB/c小鼠, 购自中山大学实验动物中心。Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系为本实验室保存。诺如病毒核衣壳蛋白表达重组质粒 pET28a(，) Noro NP由本实验室制备及保存, 诺如病毒N蛋白基因的克隆、 表达和鉴定方法见文献报道,9,。PEG MW3350购自Sigma公司, HAT、 HT 和RPMI1640购自Gibco公司, 新生牛血清购自杭州四季青公司, 羊抗鼠IgG购自BOSTER公司。其他试剂均为国产纯。 1.2 方法 1.2.1 免疫小鼠 用pET28a(，) Noro NP重组表达载体表达诺如病毒G?组广州株的全长衣壳蛋白, 收集产物经Ni2，亲和层析柱纯化, 以此纯化后蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠, 每次免疫剂量为70 μg/只, 免疫途径为腹腔免疫, 每间隔2周免疫1次, 累计免疫3次, 初次免疫使用弗氏完全佐剂, 后两次免疫使用弗氏不完全佐剂; 第3次免疫完成10 d后小鼠尾部取血检测免疫效果, 血清效价达到104后可脾内注射进行加强免疫, 3 d后取脾融合。 1.2.2 细胞融合 取免疫后小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按常规融合方法融合。 1.2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化 融合后细胞用含HAT的RPMI1640培养液进行筛选, 10 d后待杂交瘤细胞生长至视野的1/3大小时, 取100 μL细胞上清用ELISA方法对抗体进行检测。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行多次克隆化, 待所有单克隆细胞培养液中抗体阳性率为100%时, 将生长状态良好并抗体ELISA值高的单克隆细胞扩大培养。 1.2.4 腹水的制备及效价测定 将6周龄以上的BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL/只弗氏不完全佐剂, 诱导1周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞, 7,10 d后可产生腹水。收集腹水离心除去细胞碎片。用重组蛋白(5 mg/L)作为抗原包板, 腹水从10-2起10倍稀释至10-7作为一抗(连续梯度稀释), 羊抗鼠IgG作为二抗, 用间接ELISA方法对腹水效价进行测定。 1.2.5 mAb免疫球蛋白亚类鉴定 采用PIERCE公司的Monoclonal Antibody Isotyping Kit(HRP/ABTS)对mAb的亚类进行鉴定, 按试剂盒说明进行。 1.2.6 mAb特异性检测 用Western blot方法测定mAb对G?组广州株诺如病毒衣壳蛋白, 及对天然G?组诺如病毒粪便标本的 特异性反应情况。 1.2.7 mAb配对试验和初步应用 将效价较强的N2C3、 N7C2、 N4B1 3株mAb用硫酸铵 辛酸法纯化,10,, 并分别将这3株抗体用辣根过氧化物酶(HRP)标记。将纯化过的抗体分别用5 mg/L浓度包被酶标板作为一抗, 诺如病毒衣壳蛋白作为抗原, 标上HRP酶的3株抗体分别作为二抗, 使用ELISA夹心法对mAb进行配对试验。配对完成后挑选灵敏度相对较高而本底相对较低的配对方式, 与PCR方法(本实验室建立)检验为诺如病毒G?组阳性的水样腹泻患者粪便标本进行反应。 2 结果 2.1 分泌抗诺如病毒衣壳蛋白mAb的杂交瘤细胞株的建立 用pET28a(，) Noro NP重组表达载体表达诺如病毒G?组广州株的全长衣壳蛋白免疫小鼠, 取小鼠血清测效价, 在满意滴度下将小鼠进行脾内加强免疫, 3 d后取脾细胞与Sp2/0细胞进行融合。10 d后用纯化的NVNP 5 mg/L包被酶标板, 杂交瘤细胞上清作为一抗, 羊抗鼠IgG作为二抗检测抗体, 并同时用pET28a(，)载体表达的轮状病毒蛋白作为阴性对照, 以排除与大肠杆菌BL21细胞成分和pET28a(，)载体成份反应的假阳性抗体。对抗体分泌能力强的培养孔用有限稀释法进行2次克隆化, 共筛选出4株能稳定分泌抗诺如病毒核衣壳蛋白抗体的细胞株, 分别为N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9。 2.2 腹水效价的测定 收集腹水, 用间接ELISA方法测定, 结果N2C3和N7C2 2株抗体最强, 腹水稀释至10-6P/N值为0.4; N4B1株抗体较弱, 腹水稀释至10-4P/N值为0.5; N8A9株抗体最弱, 腹水稀释至10-3P/N值为0.3(阴性对照P/N值为0.08)。 2.3 mAb免疫球蛋白亚类鉴定 用PIERCE公司试剂盒对mAbIg的类型和亚类进行特异性鉴定, 结果2株mAb鉴定为IgG2a(N2C3和 N4B1), 2株mAb鉴定为IgM(N7C2和 N8A9), 4株mAb轻链均为к链。 2.4 mAb特异性检测 4株mAb分别与表达重组蛋白和诺如粪便标本进行Western blot检测, 表达重组蛋白上由于带有表达载体上的T7和(His6)标签, 因而Mr比天然诺如病毒核衣壳蛋白(Mr为56×103,58×103)多了3×103左右。Western blot结果见图1, mAb不仅可以同表达重组蛋白进行特异性反应, 并且可以同天然诺如病毒核衣壳蛋白进行特异性反应。其中N2C3和N7C2的反应性较强, N8A9和N4BI对粪便标本的反应性较弱。 图1 mAb的Western blot分析(略) Fig 1 Western blot analysis of expression products in E.coli and native NV stool sample with four mAbs A: N2C3; B: N8A9; C: N7C2; D: N4B1. 1: Native norovirus stool sample; 2: Expressed recombinant protein of Norovirus NVgz01.2.5 mAb 配对试验和初步应用 2.5.1 配对 N2C3、 N7C2、 N4B1 3株抗体每株都与自身及其他2株抗体用夹心法进行配对试验, 将表达蛋白稀释至0.16、 0.084、 0.056和0.042 mg/L作为样本进行检测。P/N值结果见表1。结果显示N2C3和N7C2可以进行自身配对, N2C3和N7C2之间可以互相配对, N4B1不能进行自身配对, 并且与其他两株配对效价都不高。 表1 N2C3、 N7C2和N4B1 mAb在夹心ELISA中的结果(略) Tab 1 Sandwich ELISA results for N2C3, N7C2 and N4B1 2.5.2 初步应用 根据配对结果, 选择阳性值较高且本地值较低的N2C3，N7C2 E配对方式。将53份PCR检测为诺如病毒阳性的粪便标本取上清, 用PBS稀释10倍作为样本进行检测。结果显示, 35份标本ELISA检测为阳性(P/N值为 0.408,3.045之间, 阴性对照为0.170), 相对阳性率为66,。 3 讨论 诺如病毒最早发现于1972年, 由Kapikian等,11,借助免疫电镜技术(IEM)观察到一种病毒颗粒, 并根据发病地区将此病毒命名为 Norwalk virus(NV)。此后, 越来越多的诺瓦克样病毒在世界各地被发现, 这些分离得到的病原都以其流行地区或发病特征等命名。1993年Jiang等,12,通过分析诺瓦克病毒的cDNA克隆的核酸序列发现其属于杯状病毒属(calicivirus), 后根据病毒RNA聚合酶区或衣壳蛋白区核苷酸和氨基酸序列的同源性比较, 将人类杯状病毒(HuCV)分为3个基因组(genogroup):?组(代表株NV)、 ?组(代表株SMA)和?组(代表株Sapporo)。现将这3组病毒统称为诺如病毒(Norovirus)。诺如病毒在我国最早发现于1995年,13,, 后于我国多个城市和地区均有发现。根据文献报道, 当前G?组病毒为中国主要流行的诺如病毒,14,。 诺如病毒是单股正链RNA病毒, 其基因组长度为7,7.5 kb, 包括3个ORF, 其中ORF2编码一个Mr为58,65×103的病毒核衣壳蛋白,15,。由于诺如病毒在感染患者粪便中排毒量少, 排毒时间短, 且无法在体外感染细胞及动物模型来进行培养分离鉴定,16,, 因此为了对诺如病毒进行进一步的研究, 制备mAb, 或研制疫苗等, 都只能依靠表达系统来完成。自20世纪80年代通过杆状病毒表达系统确定了ORF2为病毒核衣壳蛋白编码序列后, 对诺 如病毒的免疫学研究工作主要都通过表达ORF2来进行。 诺如病毒广州株NVgz01(DQ369797)为本实验室测出的本地流行株, 经同源性分析属于诺如病毒G?组,17,, 符合我国人杯状病毒的流行趋势。过往研究者在研究ORF2时多采用杆状病毒载体系统来表达, 且表达的核衣壳蛋白可以自行组装成病毒样颗粒, 但杆状病毒表达系统相较于E.coli表达系统而言费时费力。E.coli表达系统操作简便, 重组蛋白产量高, 并且可以使用配套纯化方法对重组蛋白进行高度纯化。Tomoko等,18,的研究证实, 用E.coli表达系统也可以表达出用于免疫研究的病毒核衣壳蛋白, 并且证实重组蛋白具有良好的抗原性, 因而本实验也采用E.coli表达系统表达诺如病毒核衣壳蛋白。利用Ni2，亲和层析柱对重组N蛋白进行纯化, 纯化后表达蛋白纯度占总蛋白的95,以上, 用此纯化后的重组蛋白作为抗原免疫小鼠, 然后制备mAb。为了保证制备mAb的特异性, 我们使用表达轮状病毒VP6的pET28a(，) VP6 BL21的细胞裂解液作为阴性对照, 确保了所获得的杂交瘤细胞分泌的抗体均是针对诺如病毒重组N蛋白的。经过多次克隆化, 共获得了4株稳定分泌抗衣壳蛋白抗体的杂交瘤细胞株, 并对mAb Ig的类型和亚类进行特异性鉴定, 结果2株mAb鉴定为IgG2a(N2C3和N4B1), 2株mAb鉴定为IgM(N7C2和N8A9), 4株mAb轻链均为к链。虽然本实验使用的二抗是羊抗鼠IgG, 但其能筛选出IgM的原因可能是此二抗识别的表位是位于IgG和IgM所共有的恒定区上, 因而在ELISA过程中此二抗也有可能识别出IgM。根据ELISA和Western blot检测结果分析, N2C3、 N7C2、 N4B1和N8A9均与表达衣壳蛋白有良好的反应性和特异性, 并且都与患者粪便标本中的天然诺如病毒具有反应性和特异性, 其中N2C3和N7C2 2株的反应性和特异性都较强。根据N2C3和N7C2的配对结果, 以重组表达蛋白作为样本进行检测时, 样本浓度稀释至0.042 mg/L时P/N值仍能达到1.139,1.452, 证明N2C3和N7C2 2株抗体之间的配对检测具有较强的灵敏性和特异性。在此配对结果基础上, 对53份PCR检测为Norovirus G?组阳性的腹泻患者粪便标本进行检测, 共检出35份阳性结果, 阳性率为66,。出现PCR结果和ELISA结果不完全相符的原因可能是由于PCR方法的假阳性率比较高, 或是配对的两株单抗在病毒组内表现株型特异性, 这两种可能性都有待进一步研究证实。 【