参丹健胰丸对糖尿病大鼠肾醛糖还原酶活性的影响

实验论著 参丹健胰丸对糖尿病大鼠肾醛糖还原酶活性的影响 方朝晖1 ,章小平1 ,鲍道林1 ,徐 　意1 ,罗 　乐2 ,周 　君2 (1. 安徽中医学院第一附属医院代谢内分泌科 ,安徽 合肥 230031 ; 2.中国科学技术大学生命科学院 ,安徽 合肥 230038) [摘要 ] 　目的 :评价参丹健胰丸对糖尿病大鼠肾醛糖还原酶 (aldose reductase ,AR) 活性的影响 ,探讨中药防治糖尿病肾脏病变 的意义。 : 用中药参丹健胰丸和醛糖还原酶抑制剂螺旋已内酰脲 (sorbinil) 对糖尿病 Wistar 大鼠模型进行治疗 ,并观察肾 组织 AR 活性、尿蛋白和 Na + 2K+ 2ATP酶活性的变化。结果 : 糖尿病鼠模型组其 AR 活性显著高于正常鼠组 ( P < 0. 01) ,使用 sorbinil、参丹健胰丸后 AR 活性明显下降 ( P < 0. 01) ,与正常对照组相比较无显著性差异 ( P > 0. 05) 。治疗 8 周末 ,两个治疗组 尿蛋白水平与 4 周末相当 ,但糖尿病模型组尿蛋白明显升高 ,远高于两个治疗组 ( P < 0. 01) ,治疗后两组间无明显差异 ( P > 0. 05) 。用 sorbinil 和参丹健胰丸治疗后 ,Na + 2K+ 2ATP酶活性显著升高 (与模型组相比 P < 0. 05) 。结论 : 参丹健胰丸可通过抑制 糖尿病大鼠肾脏组织 AR 活性而发挥其防治效用。 [关键词 ] 　糖尿病肾病 ; 参丹健胰丸 ; 醛糖还原酶 ; 钠 ,钾 ATP酶 ; 螺旋已内酰脲 [中图分类号 ] 　R587. 24 　　[文献标识码 ] 　A 　　[文章编号 ] 　167221977 (2004) 0220126203 Effects of Shendan Jianyi Capsule on aldose reductase activity of kidney in diabetic rats FANG Zhao2Hui1 , ZHANG Xiao2Ping1 , BAO Dao2Lin1 , XU Yi1 ,LUO Le2 ,ZHOU Jun2 (1. Department of Metabolism and Endocrinology , First Affiliated Hospital , Anhui College of Traditional Chinese Medicine , Hefei , Anhui Province 230031 , China ; 2. School of Life Science , University of Science and Technology of China , Hefei , Anhui Province 230038 , China) ABSTRACT　Objective :To evaluate the effects of Shendan Jianyi Capsule (SDJ YC) on aldose reductase (AR) activity of the kidney in dia2 betic rats and the significance of prevention and treatment of diabetic nephropathy with Chinese natural herbs. Methods : Diabetic Wistar rats were treated with SDJ YC and sorbinil respectively , and the AR activity in kidney , urine protein and the activity of Na+ 2K+ 2ATPase were test2 ed. Results : The AR activity in diabetic rats was decreased obviously after being treated with sorbinil or SDJ YC. The activity of Na+ 2K+ 2AT2 Pase in diabetic rats decreased obviously at the end of the eighth week , and increased after being treated with sorbinil and SDJ YC. There was no difference between two treated groups after the treatment. It demonstrated that the inhibition of AR activity could improve the activity of Na + 2K+ 2ATPase and SDJ YC had the same effect. Conclusions : SDJ YC exerts effects by inhibiting the activity of AR . KEY WORDS　diabetic kidney ; Shendan Jianyi Capsule ; aldose reductase ; Na+ 2K+ 2ATPase ;sorbinil J Chin Integr Med ,2004 ,2(1) :1262128 ①　 近年来的研究表明 ,多元醇通路的关键酶 ——— 醛糖还原酶 (aldose reductase ,AR) 在高血糖条件下被 激活 ,催化葡萄糖大量转化为不易透过细胞膜的山 梨醇 ,引起肾组织细胞渗透性损伤 ,是糖尿病肾脏病 变的重要发病机制之一。使用醛糖还原酶抑制剂 (aldose reductase inhibitors ,ARIs) 防治糖尿病肾脏病 可作为一种治疗手段[1 ] 。我们研究了中药参丹健胰 丸和醛糖还原酶抑制剂螺旋已内酰脲 ( sorbinil) 对糖 尿病 Wistar 大鼠模型肾组织 AR 活性、尿蛋白和 Na +2K+2ATP 酶活性变化的影响 ,报道如下。 1 　材料与方法 1. 1 　实验仪器与试剂 　UV2240 分光光度计 (日本岛 津公司) ; SCR222BB 高速离心机 (日本日立公司) ; J GM21200EX电了显微镜 (日本日立公司) ; FG2100AT 图象处理分析仪 (美国 Imaging Technology 公司) ;NADPH、NADH(分析纯 ,Sigma 公司) ;DL2甘油醛 (分析纯 ,意大利 Roth 公司) ;ATP2Na2、孔雀绿、哇巴因(Sigma 产品) ;sorbinil (美国 Pfizer 公司) 。1. 2 　实验动物及分组 　32 只雄性 Wistar 大鼠随机分出 8 只为正常对照组 (以下称正常组) ;另 24 只用四氧嘧啶 ( 100 mg/ kg) 诱发糖尿病 , 血糖值 >11. 0 mmol/ L ,随机分为糖尿病模型组、sorbinil 治疗组、参 丹 健 胰 丸 治 疗 组。 sorbinil 用 法 为10 mg·kg - 1·d - 1 ;参丹健胰丸由太子参 20 g、生黄芪15 g、制黄精12 g、丹皮 12 g、丹参 15 g、生黄连12 g等 ·621· 中西医结合学报 2004 年 3 月第 2 卷第 2 期　J Chin Integr Med , Mar 2004 ,Vol . 2 ,No. 2 ① [基金项目 ] 　安徽省优秀青年科研基金资助项目 (No. jl00081) [作者简介 ] 　方朝晖 (19672) ,男 ,博士 ,副主任医师. Correspondence to : FANG Zhao2Hui , MD , Associate Professor. E2mail : fangzhaohui @medmail . com. cn 中药组成 (安徽中医学院第一附属医院临床制剂中 心生产) ,每日灌服研粉溶液 10 ml/ kg ,每毫升溶液 中含生药 0. 3 g。 1. 3 　实验方法 　实验开始第 4、8 周各测定血糖和 尿蛋白 1 次 ,第 16 周时将大鼠断头处死 ,取肾脏剔 除附着物 ,捣碎取匀浆 ,供测定AR 活性用。肾脏AR 活性测定参照 Maragoudakis 等[2 ]的方法 ,略作变动 : 即 NADPH在 340 nm 处吸收光值下降 10 U 来表 示酶活性。本研究使用两种反应体系 ,第一种反应 体系包括 67 mmol/ L、pH6. 2 的 Na +2K+ 磷酸缓冲液 , 10 mmol/ L 的DL2甘油醛 ,5 mmol/ L 的 22巯基乙醇 ,0. 1 mmol/ L 的 NADPH 和酶适量 ;实验杯包括全部试剂 , 对照杯以双蒸水代替底物 DL2甘油醛。第二种反应体 系以 0. 1 mmol/ L 的 NADH 代替 NADPH ,其余试剂同 第一种反应体系。测定组织匀浆酶活性 ,同时测定蛋 白含量 ,一单位酶活性规定为1 min产生1μmol NADP + (或 NAD + )的酶量 ,各组织酶活性用比活性进行比较 , 比活性 =酶单位/ mg 蛋白。 1. 4 　Na +2K+2ATP 酶活性测定[3 ] 　取少量肾皮质和 髓质 , 称 重 后 用 组 织 匀 浆 缓 冲 液 ( 含 蔗 糖 0. 2 mmol/ L、Tris2HCl 0. 02 mmol/ L、pH 7. 40) ,组织重 量与组织匀浆缓冲液比为 1∶40 ,在玻璃匀浆器中制 备匀浆 ,直接用粗制肾组织匀浆加于酶反应管中 (总 量 1. 0 ml) ,反应液中各化合物浓度为 :NaCl 100、Mg2 Cl2 2. 5、KCl 10、EDTA 2. 0、ATPNa21. 0 mmol/ L或哇巴 因 0. 2 mmol/ L ,37 ℃水浴中反应30 min ,速加无机磷显 色剂 2. 5 ml (含 0. 02 % 孔雀绿、0. 55 % 钼酸铵和 0. 1 % TWEEN220) ,再加 24 %柠檬酸钠 0. 2 ml ,室温反应 30 min ,用波长 660 nm 比色测光密度 ,计算无机盐含 量 ,Na +2K+2ATP 酶活性单位以每小时每克组织蛋白 (g - 1 pro) 产生的无机磷 ( Pi) 含量 (mmol) 来表示 ,即 mmol Pi·g - 1 pro·h - 1。每次作标准曲线 ,各反应管均 作复管。 1. 5 　统计学方法 　计量资料值以 x ±s 表示 ,各配 伍组样本均数比较采用方差分析。 2 　结 　果 2. 1 　体重、血糖变化 　治疗开始糖尿病鼠体重与正 常鼠相当 ,治疗 8 周结束时 ,糖尿病各组的体重明显 低于正常组 ,用 2 种药物治疗血糖无变化 ,糖尿病各 组间体重无明显差异。 2. 2 　肾脏 AR 活性 　分别以还原型辅酶 Ⅱ (NADPH) 和还原型辅酶 Ⅰ(NADH) 测定肾脏的 AR 活性 ,结果见表 1。糖尿病鼠模型组其 AR 活性显著 高于正常组 ( P < 0. 01) ,使用 sorbinil、参丹健胰丸后 AR 活性明显下降 ,与模型组相比 , P 值均 < 0. 01 ;虽 然各治疗组 AR 活性仍高于正常组 ,但与正常组相 比较无显著性差异 ( P > 0. 05) 。 表 1 　各组肾脏的 AR活性变化比较 Tab 1 　Comparison of activity of aldose reductase in kidney of 4 groups ( x ±s) Group n Activity of aldose reductase NADPH(0. 1 mmol/ L) NADH(0. 1 mmol/ L) Normal group 8 2. 12 ±0. 82 0. 40 ±0. 19 Model group 8 10. 20 ±3. 86 3 3 3. 61 ±1. 56 Sorbinil group 8 3. 27 ±0. 88 △△ 1. 26 ±0. 27 △△ SDJ YC group 8 3. 23 ±0. 79 △△ 0. 96 ±0. 14 △△ 　3 3 P < 0. 01 , vs normal group ; △△P < 0. 01 , vs model group 2. 3 　尿蛋白含量的变化 　随病程进展 ,糖尿病鼠各 组尿蛋白均有上升趋势 ,用 sorbinil、参丹健胰丸治疗 后尿蛋白基本维持不变。治疗 8 周末 ,两个治疗组 尿蛋白水平与 4 周末相当 ,但模型组尿蛋白明显升 高 ,远高于两个治疗组水平 ( P < 0. 01) ,两治疗组治 疗后组间无明显差异 ( P > 0. 05) ,见表 2。 表 2 　各组尿蛋白变化比较 Tab 2 　Comparison of changes of urine protein of 4 groups ( x ±s ,mg/ L) Group n Urine protein 4th week 8th week Normal group 8 1 623 ±1 215 1 709 ±956 　 Model group 8　2 500 ±2 310 3 3 　2 810 ±2 330 3 3 Sorbinil group 8 2 520 ±2 480 　2 360 ±2 120 △△ SDJ Y group 8 2 570 ±1 930 　2 170 ±1 920 △△ 　3 3 P < 0. 01 , vs normal group ; △△P < 0. 01 , vs model group 2. 4 　对糖尿病大鼠肾组织 Na +2K+2ATP 酶活性的 影响　注射四氧嘧啶 8 周后 ,模型组与正常组比较 , Na +2K+2ATP 酶活性显著降低 ( P < 0. 05) , 而用 sorbinil 和参丹健胰丸治疗后 ,Na +2K+2ATP 酶活性 显著升高 ,两治疗组间无显著性差异 ( P > 0. 05) ,结 果见表 3。 表 3 　各组动物 Na + 2K+ 2ATP酶活性比较 Tab 3 　Comparison of activity of Na + 2K+ 2ATPase of 4 groups ( x ±s , mmol Pi·g - 1 pro·h - 1) Group n Activity of Na +2K+2ATPase Normal group 8 0. 58 ±0. 12 Model group 8 0. 36 ±0. 17 3 Sorbinil group 8 0. 48 ±0. 16 △ SDJ Y group 8 0. 47 ±0. 18 △ 　3 P < 0. 05 , vs normal group ; △P < 0. 05 , vs model group ·721·中西医结合学报 2004 年 3 月第 2 卷第 2 期　J Chin Integr Med , Mar 2004 ,Vol . 2 ,No. 2 3 　讨 　论 研究 ,在糖尿病高血糖条件下 ,多元醇通路 被激活 ,使醛糖还原酶活性增高 ,山梨醇在细胞内大 量积聚 ,引起肌醇减少、Na +2K+2ATP 酶活性降低等 一系列变化。最终导致了细胞功能的受损和结构的 破坏[4 ] 。故糖代谢多元醇通路的关键限速酶 AR 在 高血糖条件下的激活 ,是多种糖尿病慢性并发症包 括糖尿病肾脏病变的重要发病机制之一 ,醛糖还原 酶抑制剂能减少组织内山梨醇的蓄积 ,现已用于防 治糖尿病肾病等糖尿病并发症。已报道有醛糖还原 酶抑制剂作用的中药有丹参、黄芩苷、黄连素、甘草、 黄芪、葛根素、水飞蓟宾、槲皮素等[5 ] 。 以磷酸盐缓冲液、DL2甘油醛、NADPH 和 AR 组 成的酶反应体系 ,是目前最常应用测定 AR 活性的 酶学方法[2 ] 。现实验多采用 NADH 替代 NADPH 测 定 AR 活性 ,是为了避免组织醛糖还原酶对测定结 果的影响[6 ] 。 本项研究利用四氧嘧啶诱发大鼠糖尿病肾病 , 观察了被公认为高效的螺旋已内酰脲类 ARIs 的 sorbinil (一般研究均用它作为评估其他 ARIs 作用的 参照物)和具有益气养阴、活血化瘀功效的纯天然中 药制剂参丹健胰丸对糖尿病大鼠肾醛糖还原酶活性 的影响 ,以评估中药防治糖尿病肾脏病变的意义。 结果发现糖尿病鼠肾脏 AR 活性明显高于正常鼠 , 使用 sorbinil 治疗后 AR 活性明显下降 ,且中药参丹健 胰丸对糖尿病鼠的肾脏 AR 活性亦有显著抑制作用。 各组大鼠肾组织 Na +2K+2ATP 酶活性的观测结 果表明 ,造模 8 周后 ,糖尿病大鼠肾组织 Na +2K+2 ATP 酶活性显著降低 ,而用 sorbinil 和参丹健胰丸治 疗后均可提高 Na +2K+2ATP 酶活性 ,两治疗组间差 异不显著。说明醛糖还原酶抑制剂可以改善 Na +2 K+2ATP 酶活性 ,而中药参丹健胰丸有与之相似的作 用。 [参考文献 ] 1 　Narayanan S. Aldose reductase and its inhibition in the control of diabetic complications[J ] . Ann Clin Lab Sci , 1993 ,23 (2) :1482158. 2 　Maragoudakis ME , Wasvary J , Hankin H , et al . Human placenta aldose reductase. Forms sensitive and insensitive to inhibition by alrestatin[J ] . Mol Pharmacol , 1984 ,25 (3) :4252430. 3 　Lanzetta PA , Alvarez LJ , Reinach PS , et al . An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate[J ] . Anal Biochem , 1979 , 100 (1) :95297. 4 　Cohen MP , Klepser H , Cua E. Effect of diabetes and Sorbinil treatment on phospholipid metabolism in rat glomeruli [J ] . Biochim Biophys Acta , 1986 ,876 (2) :2262232. 5 　张家庆 ,周云平. 部分中药或其成分对大鼠晶体醛糖还原酶的抑 制作用[J ] . 中国中药杂志 ,1989 ,14 (9) :5572559. 6 　刘长山 ,董砚虎 ,逢力男 ,等. 中药黄芩甙与黄连素对糖尿病鼠醛 糖还原酶活性作用的观察[J ] . 中国糖尿病杂志 , 1996 ,4 (3) :1632 166. [收稿日期 ] 　2003203213 　[本文编辑 ] 　周庆辉 第七次全国中西医结合四诊研究学术研讨会征文通知 为促进中西医结合诊断医学的学术水平不断发展和提高 ,中国中西医结合会四诊研究专业委员会定于 2004 年 8 月上旬在新疆乌鲁木齐市召开第七次全国中西医结合四诊研究学术研讨会。现将会议征文事宜 通知如下。 1. 征文内容 　(1)以临床应用为主的各种中西医诊病方法的临床与实验研究 ; (2) 计算机与中医各种诊 法结合的实验研究与临床研究 ; (3)舌诊、脉诊、经络、腹诊、耳诊、面诊、手诊、眼诊、足穴反射区等诊法的临床 应用 ,及基础研究、实验研究 ; (4)与四诊研究有关的全息生物学的诊断、治疗、点、区、带的研究 ; (5) 人体生物 特征、生物工程技术研究与应用经验 ; (6)应用四诊技术指导临床中药应用的辨证论治经验 ; (7) 在基层医疗 机构应用相应诊断方法诊病治病的经验。 2. 征文要求 　(1)应体现先进性、科学性 ,具有一定学术水平及临床应用价值。(2) 论文应打印 ,注 明作者单位及通迅地址、邮政编码 ,并加盖单位公章。(3)请寄全文及摘要 (600～800 字)各 1 份 (无摘要不予 受理) 。征文截止日期 2004 年 5 月 30 日 ,入选征文将编印学术论文专集 (如在杂志上刊登 ,另行通知作者) 。 请自留底稿 ,怒不退稿。(4) 论文请寄哈尔滨市解放军第 211 医院舌象研究室王淑英或李乃民收。邮政编 码 :150080 ;电话 :0451257752479 ;手机 :13904637053。 中国中西医结合学会 2003 年 10 月 28 日 ·821· 中西医结合学报 2004 年 3 月第 2 卷第 2 期　J Chin Integr Med , Mar 2004 ,Vol . 2 ,No. 2