不同动物小肠肌间神经丛内NOS神经元分布的比较_cropped

不同动物小肠肌间神经丛内NOS神经元分布的比较_cropped ()第 32 卷 第 1 期 Vol . 32 No . 1 自然科学版陕西师范大学学报 ( )2004 年 3 月Mar . 2004 Jo ur nal of Shaanxi No r mal U niversity Nat ural Science Editio n () 文章编号 :167224291 20040120090205 不同动物小肠肌间神经丛内 NOS 神经元分布的比较 3 安成 ,徐 畅 , 杨雪娟 ()陕西师范大学 生命科学学院 , 陕西 西安 710062 摘 要 :采用 NAD P H2黄递酶组织化学法对草鱼 、牛蛙 、家鸡和大鼠小肠肌间神经丛内 NO S 阳性神 经元的分布进行了比较研究. 结果表明 ,NO S 阳性产物在草鱼肌间神经丛中未见分布 ,而在其它几 类动物中阳性反应明显. 但在不同动物 NO S 阳性神经元的形态 、分布 、密度及神经纤维的分布存在 差异. 在牛蛙 、家鸡和大鼠的小肠肌间神经丛中 ,NO S 阳性神经元的分布从分散到集中 ,形态呈现 由不规则形到规则形再到不规则形的复杂变化 ;神经节从无到有 ,神经网络由不发达趋于发达 ; 而 在每种动物中 ,NO S 阳性神经元的密度沿肠道由前向后基本呈上升趋势 ,这种节段性的差异牛蛙 极显著 ,家鸡和大鼠则不甚显著. 实验结果提示 ,随着动物的进化 ,一氧化氮能神经元在肠肌间神经 丛中的分布也更加复杂而有序 ,从而使胃肠道的调节更加精确. 关键词 :一氧化氮合酶 ; 组织化学 ; 小肠 ; 肌间神经丛 ; 进化 中图分类号 : Q495 文献标识码 : A Comparat ive study on distribut ion of n itric oxide syntha se in myenteric plexus of small intest ine f or diff erent an imal s XU Chang , AN Shu- cheng , YAN G Xue-juan ( ) College of Life Science , Shaanxi No r mal U niversity , Xi′an 710062 , Shaanxi , ChinaAbstract : In o rder to show t he p hylogenesis and developing p ro gresses of NO S po sitive neuro ns , t his ( ) st udy co mpares t he dist ributio n of nit ric o xide synt hase NO Sin t he myenteric plexus of t he grass ( ) ( ) ( ) carp Ctenop ha ry n godon i del l us , bullf rog R a n a catesbei a n a, fowl Gal l us gal l us dom est icus and Sp rague 2Dawley rat small intestine using NAD P H diap ho reses histochemical staining met ho d. The result s show t hat t here are not NO S po sitive p ro duct s in t he myenteric plexus of t he grass carp , w hereas t he po sitive reactio ns are o bvio us in t hat of ot her animals. The dist ributio n , shape and densit y of NO S po sitive neuro ns and t he dist ributio n of nerve fibers do not coincide in t he myenteric plexus of different kinds of animals. In t he myenteric plexus of f ro m t he bullf rog to fowl and rat , t he dist ributio n of NO S po sitive neuro ns is f ro m separatio n to cent ralizatio n ; and t he shape takes o n co mplicated changes , being f ro m irregular to regular and again to irregular . There are not ganglia in t he bullf rog , but t hen t hey exist in t he fowl and rat . The net wo r k of neuro ns is f ro m simple to co mplex. The t rend of t he density of NO S po sitive neuro ns alo ng t he intestinal axis is increased and t his variance is ext remely significant in t he bullf rog but not in t he fowl and rat . It is suggested t hat wit h t he animals′evolutio n , t he dist ributio n of NOergic neuro ns in t he myenteric plexus beco mes co mplex and o rdered , so t hat t he adjust ment of gast rointestinal t ract is mo re p recise . Key words : nit ric o xide synt hase ; histochemist ry ; small intestine ; myenteric plexus ; evolutio n 收稿日期 :2003203208 () 作者简介 :徐畅 1979 —,女 ,浙江龙游人 ,陕西师范大学硕士研究生. 一氧化氮是一种极不稳定的自由基气体 ,在胃 处理. 肠道神经系统中作为一种抑制性的神经递质来调节 1 . 4 结果处理 1 , 2 ( ) 胃肠道功能. 一氧化氮合酶 NO S作为 NO 的 10 倍光镜下计数阳性神经元密度 ,每例标本随 标志酶 ,在体内催化 L2精氨酸生成 NO ,它已被证实 机统计 15 个计数格中及 10 个神经节中的神经元数 ( 是 一 种 NAD P H2黄 递 酶 NAD P H2diap ho rase , 目 ,结果用均值 ?标准差表示 . 用单因素方差对 3 ,4 ) ND P,ND P 组织化学法能较好地用于 NO S 的 同一动物小肠不同节段之间及不同动物小肠相应节 定位研究. 已有的研究表明 , NO S 广泛分布于脊椎 段之间阳性神经元数目差异的显著性进行比较. 动物胃肠道神经系统. 但目前的研究多数集中于实 2 结果 验动物 ,如大鼠 、豚鼠等 ,对于其它非哺乳类动物的 5 ,8 研究国内未见报道 ,国外的资料也较少. 为此 , ND P 阳性产物为蓝色沉淀 ,阳性神经元胞质深 本实验通过对鱼类 、两栖类 、鸟类和哺乳类的几种动 染 ,胞核不着色. 对照实验结果为阴性. 物的研究 , 比较其小肠肌间神经丛 NO S 的分布情 2 . 1 草鱼 况 ,以便了解 NO S 阳性神经元的种系发生及发展 草鱼的小肠肌间神经丛铺片标本未见阳性产 过程. 物 . 整个片子显出淡蓝色 ,而见不到阳性神经元及神 经纤维.1 材料和 2 . 2 牛蛙 1 . 1 动物 因两栖类小肠分段不明显 , 所以取小肠上 1/ 3 ) ( ( i del l us 700 , 段作为十二指肠 , 下 2/ 3 段作为回肠. NO S 阳性神 选取 草 鱼 Ctenop ha ry n godon ( ) ( ) ) 1000 g、牛蛙 R a n a catesbei a n a 170 , 280 g、家 经元散在分布于牛蛙的整个小肠肌间神经丛中 ,没 ( ) ( ) 鸡 Gal l us gal l us dom est icus 1 800 , 2 500 g 和 有形成明显的神经节. 阳性神经元发出神经纤维 ,其 (( ) Sp rague2Dawley 大鼠 180,220 g各 6 只作为研究 走向与纵肌一致 ,分支较少 ,神经网络不发达 图 1 , ) A. 高倍镜下观察可见神经元形态多样 ,多为星形 、 用动物 ,雌雄兼用. 除 SD 大鼠购自西安交通大学医 ( 无规则形 ,偶见卵圆形. 胞核较大 ,不着色 图 1 ,B 、 学院动物实验中心外 , 其余动物均购自市场. ) C. 阳性神经元大小悬殊 ,小肠上段细胞直径在 25 1 . 2 标本制作 μμ将动物处死后立即取下小肠段 ,草鱼和牛蛙的 ,90 m 之间 ,帄均直径为 46 . 35 m ; 下段细胞直 ((μμ) ) 小肠又分为上段 约占 1/ 3和下段 约占 2/ 3,将家 径在 18,47 m 之间 ,帄均值为 38 . 55 m. 且小肠 () 鸡和大鼠的小肠分为十二指肠 、空肠和回肠 . 用生理 上段和下段的神经元密度有极显著的差异 表 1. 盐水冲洗后结扎肠段两端 ,向肠腔内注入0 . 1 mol/ L 2 . 3 家鸡 () PB S p H 为 7 . 3配制的 4 %的多聚甲醛溶液 , 适当 在家鸡的十二指肠 、空肠和回肠肌间神经丛中 , 可见明显的神经节. NO S 阳性神经元多分布于神经 ) (扩充肠管 ,再置于上述固定液中固定 2 h 4 ?. 然后 节内 ,亦有少数散在神经节外 ,神经节中同时有阴性 () 取出肠管用 0 . 1 mol/ L PB S p H 为 7 . 3冲洗两次 , 神经元的存在. 在小肠各段 NO S 阳性神经元 、神经 ( ) 每次 10 min , 并放入 PB S 中过夜 4 ?. 最后将肠 ( ) 节和神经网络的形态及神经元分布密度 表 1无明 管沿肠系膜附着处剪开 ,再剪成 1 cm 的小段 ,用镊 显差异. 神经元多为圆形和卵圆形 ,有突起与其他阳 () 性神经元相接触 图 1 , F,体积较小 ,十二指肠的神 尖轻轻撕去粘膜层和环肌层 ,便制成肌间神经丛铺 μμ经元直径在 10,34 m 之间 ,帄均值为 24 . 47 m , 片标本 ,将其置于 PB S 中待染.μμ在空肠其直径为 17 , 50 m , 帄均 30 . 20 m , 而在 1 . 3 组织化学染色μμ回肠神经元的直径为 15 , 36 m , 帄均 24 . 35 m. 9 参照 Kier man的 ND P 组织化学法配制作用 () 神经节面积较大 ,多为星形 、无规则形 图 1 , E. 神经 ( 液 :0 . 5 mg/ mL 氯化硝基四氮唑蓝 NB T ,上海前进 () 纤维分支多 ,形成的神经网络网格较大 图 1 ,D. ) ( 化学试剂厂,0 . 3 % Trito n X —100 华美生物工程 2 . 4 大鼠 ) ( ) 公 司 , 1 mg/ mL NAD P H Sigma , 用 0 . 1 mol/ L 小肠肌间神经丛由神经节 、节间束及一些含有 () PB S p H 为 7 . 3配制. 将铺片标本放入作用液中于( ) 膨体的阳性神经纤维纵横交织组成 图 1 , G、H. 神 37 ?孵育 0 . 5,1 h ,用 PB S 漂洗以终止其反应 . 裱 经节多为长宽带形 ,大小不等 ,它与纵肌相垂直 ,呈 片 、逐级酒精脱水 、二甲苯透明 、封片 , 在光镜下观 察 . 对 照 实 验 在 作 用 液 中 不 加 NAD P H , 作 同 样 () 92 第 32 卷 陕西师范大学学报 自然科学版 μμ帄行排列趋势. 神经节内含有 NO S 阳性和阴性细 ,39 m ,帄均为 21 . 60 m ; 在空肠其直径为 13 , μμ胞 ,各神经节中 NO S 阳性神经元数目不等 , 在 4 ,46 m ,帄均值为 22 . 48m ;回肠中神经元的直径为 μμ23 之间. 回肠单位面积 NO S 阳性神经元的个数与 12,45 m ,帄均值为 27 . 11 m.空肠间差异显著 ,其他节段间差异不显著. 而就每个 在牛蛙 、家鸡和大鼠这三种动物中 , NO S 阳性 () 神经节中阳性神经元的个数来看 ,回肠与空肠间的 神经元的密度存在差别 表 1. 就单位面积 NO S 阳 () 差异显著 表 1. 节间束与纵肌帄行 ,其中有含膨体 性神经元的个数来说 ,牛蛙的小肠上段与家鸡和大的阳性纤维 ,可见单个阳性神经元位于节间束中. 高 鼠的十二指肠及其下段与家鸡和大鼠的回肠之间差 倍镜下可见神经元胞体形态多样 ,有卵圆形 、梭形 、 异极显著 ,家鸡和大鼠的相应节段差异不显著. 而对 不规则形 ,细胞有许多短而不规则的突起 ,在节内与 每个神经节中阳性神经元的个数来说 ,家鸡的十二 ( ) 其他神经元胞体或突起相互突触 图 1 , I. 细胞大 指肠与大鼠有极显著的差异 ,其空肠与大鼠的差异 小在同一节段也相差数倍 ,在十二指肠其直径在 10 也显著 ,但回肠间的差异表现不显著. 表 1 牛蛙 、家鸡 、大鼠小肠肌间神经丛 NOS 阳性神经元的分布密度 Ta b. 1 Density of NOS positive neurons in myenteric plexus of bullf rog , f o wl and rat small intestine 牛 蛙 家 鸡 大 鼠 区 域 小肠上段 小肠下段 十二指肠 空肠 回肠 十二指肠 空肠 回肠 阳性神经 33 . 48 ? 58 . 48 ? 34 . 66 ? 22 . 21 ? 21 . 27 ? 29 . 54 ? ? ? 21 . 66 26 . 39 2 3 3 ,b b3元个数/ mm4 . 58 14 . 52 4 . 68 4 . 94 6 . 84 3 . 84 5 . 87 8 . 80 阳性神经元 12 . 77 ? 10 . 20 ? 9 . 13 ? 11 . 77 ?12 . 27 ?11 . 63 ?个数/ 神经节 — — 3ab0 . 95 1 . 87 0 . 50 1 . 89 1 . 00 0 . 78 表中数据为均值 ?标准差 . 3 差异显著 , P < 0 . 05 ; 3 3 差异极显著 , P < 0 . 01 ,表示同种动物不同节段之间的差 ( ( ) ) 异性 n = 6. a . 差异显著 , P < 0 . 05 ,b. 差异极显著 , P < 0 . 01 表示不同动物的同一节段之间的差异性 n = 6. 络不发达 ,神经元之间的连接及其对效应器细胞的 3 讨论 调节就需要较多的神经元 ,才能完成其调节功能. 家 该实验用 ND P 组织化学法研究了草鱼 、牛蛙 、 鸡的小肠肌间神经丛中 ,每个神经节所含阳性神经 家鸡和大鼠小肠肌间神经丛中 NO S 的分布. 结果显 元数目高于大鼠 ,但单位面积神经元的数目 ,二者差 示 ,在草鱼的肌间神经丛中未见 NO S 阳性神经元及 异并不大. 这是因为家鸡的神经节较大 ,含阳性神经 10 11 神经纤维的分布 ,这与 Li Z S和 Olsso n等人关 元数目多. 但神经节的密度却较小 ,说明 NO S 神经 于硬骨鱼的报道不一致 . 他们发现在一些硬骨鱼和 元在不同动物会通过不同的方式排列 ,达到相应数 11 软骨鱼 ,如鳟鱼 、鳕和角鲨鱼,NO S 阳性细胞较普 量才能满足一定生理功能的需要. 从神经元的形态 遍地存在于肠肌间神经丛 ,而在黏膜下神经丛较少. 来看 ,从星形 、不规则形逐渐发展为圆形 、卵圆形再 这两种结果的差异可能是由于种属差异性所致. 但 到不规则形增多 ,认为是由于纤维联系的不规则到 至少可以说明在鱼类消化道肌间神经丛 NO S 阳性 规则 ,随着纤维数量及分支增多 ,网络的复杂化使神 神经元还不是普遍存在的 . 经元的形态再度出现不规则现象. 实验结果还显示 ,在牛蛙 、家鸡和大鼠的肠肌间NO 作为一种肠道神经递质是从哪种动物开始11 神经丛 NO S 阳性反应明显 . NO S 阳性神经元的密 出现的 ,根据 Olsso n 等的报道在圆口类动物没有 度沿肠道基本呈上升趋势 ,这种不同节段之间的差 发现 NO S 阳性神经元 ,而在一些硬骨鱼和软骨鱼则 异性牛蛙极显著 ,但家鸡和大鼠则不显著. 比较三种 已经出现. 该研究认为 NO 可能只在鱼类的某些种 动物肠的相应节段 ,发现 NO S 阳性神经元密度牛蛙 中开始出现 ,在两栖类 、爬行类 、鸟类和哺乳类逐渐 6 ,8 的最大 ,家鸡和大鼠则明显下降. 从肌间神经丛网络 发展 ,这也与已有报道一致. 而且随着动物的进 来看 ,神经元从分散到集中 ,神经节从无到有 ,神经 化 ,肠道神经系统趋于复杂 , NO 能神经元在肠神经 纤维分支及联系增多 ,所形成的神经网络越来越规 丛中的分布也更加复杂而有序 ,从而使胃肠道功能 则 ,也越来越复杂. 在较低等的两栖类肠道 NO S 阳 的调节更加精细 、准确. 肠道中 NO 的出现还与动物 12 性神经元密度较大 ,可能是神经纤维分支少 ,神经网 的发育时期有关 ,Maake发现蝾螈在帅体第 6 期 图 1 NOS 阳性神经元的光镜图 Fig. 1 Figures of NOS positive neurons in l ight microscope A 、D 、G. 分别表示牛蛙 、家鸡 、大鼠小肠肌间神经丛 NOS 阳性神经元及神经纤维形成的网络结构 , ×100 ; B . 牛蛙 NOS 阳性神经元散在分布 , ×260 ; E、H. 分别表示家鸡 、大鼠神经节内 NOS 阳性神经元分布 , ×260 ; C 、 F 、I. 分别表示牛蛙 、家鸡 、大鼠 NOS 阳性神经元形态及纤维联系 , ×1 000 () 94 第 32 卷 陕西师范大学学报 自然科学版 ( ) Bufo marinus J . Arch Histol C ytol , 1992 , 55 4 : 333 时才开始出现少量的 NO S 免疫阳性纤维 . 亦有报 ,350 . 道 ,在大鼠 NO S 阳性神经元偶见于胚胎 13 d 的肠 6 Li Z S , Youn g H M , Furness J B . Nit ric o xide synt hase in 13 壁上 ,之后逐渐增大 、增多 ,排列由无序到规律. neuro ns of t he gast rointestinal t ract of an avian species , 我们通过几种动物的比较 ,对 NO S 神经元在种( ) Cot u r ni x cot u r ni x J . J Anat , 1994 , 184 2 : 261 系演化过程中的发生和发展问题进行了初步探讨 , ,272 . 但 NO S 神经元的分布在不同物种间存在较大差异 , 7 Olsso n C , Holm gren S. Nit ric o xide in t he fish gut J . 因此要对 NO S 神经元的发生 、发展过程有一个明确 ( ) 的认识 ,还需要对更多的物种进行研究 . NO 作为一 Co mp Biochem Physiol A Physiol , 1997 , 118 4 : 959 ,964 . 种新发现的特殊递质 ,对其在动物进化过程中的发 生和作用进行比较生理学研究应是一项十分有意义 8 Olsso n C , Gibbins I. Nit ric o xide s ynt hase in t he gast rointestinal t ract of t he est uarine crocodile , Crocodyl us 的工作. porous J . Cell Tissue Res , 1999 , 296 : 433 ,437 . 9 Kierman J A. Histolo gical and histochemical met hods : Theory and p ractice M . Oxford : Oxford Per gement 参考文献 : Press , 1990 . 274,275 . 1 Bult H , Boeckxstaens G E , Pelckmans P A , et al . Nit ric 10 Li Z S , Furness J B . Nit ric o xide s ynt hase in t he enteric o xide as an inhibitory no n2adrenergic no n2cholinergic nervous system of t he rainbow t rout , S al m o gai r d neri J . ( ) neurot ransmit ter J . Nat ure , 1990 , 345 6273 : () Arch Histol Cytol , 1993 , 56 2: 185,193 . 346,347 . 11 Olsso n C , Karila P. Coexistence of NAD P H 2diap horase 2 Shut tlewort h C W , Mur p hy R , Furness J B . Evidence t hat and vasoactive intestinal polypep tide in t he enteric nervous nit ric o xide participates in no n2adrenergic inhibitory ( ) system of t he Atlantic cod Gad us m orh usand t he spiny t ransmissio n to intestinal muscle in t he guinea2pig J . ( ) dogfish S qu al us acant hi asJ . Cell Tissue Res , 1995 , () Neurosci L et t , 1991 , 130 1: 77,80 .280 : 297,305 . 3 Ho pe B T , Michael G J , Knigge K M , et al . Neuro nal 12 Maake C , Kauf mann C , Reinecke M . Onto geny of NAD P H diap horase is a nit ric o xide synt hase J . Proc Natl neuro hormo nal pep tides , seroto nin , and nit ric o xide () Acad Sci , 1991 , 88 7: 2 811,2 814 . synt hase in t he gast rointestinal neuroendocrine system of 4 Dawso n T M , Bredt D S , Fot uhi J , et al . Nit ric o xide ( ) t he axolotl A m bystom a mex ican u m : an immuno synt hase and neuro nal NAD P H diap horase are identical in 2histochemical analysis J . Gen Co m p Endocrinal , 2001 , brain and perip heral tissuesJ . Proc Natl Acad Sci , 1991 , () 121 1: 74,83 . () 88 17: 7 797,7 801 . 13 肖岚 , 蔡文琴 . 大鼠小肠肌间神经丛中 NOS 神经元的 5 Li Z S , Furness J B , Youn g H M , et al . Nit ric o xide () 发育研究 J . 解剖学报 , 1998 , 29 3: 312,316. synt hase immunoactivity and NAD P H diap horase enzyme 〔责任编辑 王 勇〕activit y in neuro ns of t he gast rointestinal t ract of t he toad ,