抗中性粒胞浆抗体

Page 1 RECI 抗中性粒胞浆抗体 ANCA ELISA 用途 ANCA 在血管炎疾病的诊断中有重要的临床意义，目前检测 ANCA 多用间接免疫荧光 法，也用 ELISA 法针对靶物质测定。依照荧光法测定显示的核型分为胞浆型、核周型 和不典型核周型 3 型（表－4）。胞浆型 ANCA（cANCA）是一种抗蛋白激酶-3(PR3) 的抗体；而核周型 ANCA（pANCA）是一种抗髓过氧化物酶(MPO)的抗体。pANCA 在 许多炎症性疾病中，特别是在 Goodpasture 综合征、结节性多发性动脉炎等血管炎类疾 病中呈阳性。cANCA在韦格内肉芽肿疾病中的阳性率为 30%～90%，有特异性。用ELISA 法可直接测定抗蛋白激酶-3(PR3)的抗体和抗髓过氧化物酶(MPO)的 IgG 和 IgM 两种抗 体，同时具有更高的敏感性。 ANCA 的临床意义 疾 病 cANCA PANCA 不典型pANCA 韦格内肉芽肿 + - - 显微镜下多动脉炎 + + - 变应性肉芽肿 + + - 结节性多动脉炎 - + - 原发性新月型肾小球肾炎 - + - 系统性红斑狼疮 - + + 类风湿关节炎 - + + 溃疡性结肠炎 - - + 克隆病 - - + 原发性硬化性胆管炎 - - + 自身免疫性肝炎 - + - 原发性胆汁性肝硬化 - - + 本试剂盒用于定性检测人血清中的 ANCA 抗体浓度。 原理 RECI 公司 ANCA ELISA 试剂盒用于检测人血清中 ANCA 抗体。检测包括以下三个温育 步骤： 1、 被检血清（适当稀释后）在包被了 ANCA 抗原的微孔板上进行温育。标本中的特 异性抗体将与固化的抗原结合。洗板以洗脱未结合的抗体和其他血清成分。 2、 加入标记了过氧化物酶的羊抗人 IgG（γ链特异性）(酶联物)，进行温育。该酶联物 可以与在第 1 步中固定在微孔板上的 IgG 抗体起反应。洗板以洗脱未结合的酶联物。 3、 结合了酶联物的微孔板与过氧化物底物溶液进行温育。过氧化物酶与底物反应产生 颜色改变。一段时间后，终止反应，在酶标仪上检测光密度。光密度值与样品中的抗体 含量有关。 Page 2 试剂盒组成(储存于 2-8°C) 酶标板(Plate) 96wells 浓缩洗涤液(10X)(Wash Buffer) 100ml 样品稀释液(Sample Diluent) 30ml 阴性对照(Positive Control) 1 vial 显色液(TMB) 15ml 终止液(Stop Solution) 15ml 校正液(Calibrator) 1 vial 酶联物(Conjugate) 15ml 阳性对照(Negative Control) 1 vial 需要但未提供的材料 1. 可在 450nm 处进行读数的酶标仪； 2. 能精确吸取 10 和 200µL 的移液器； 3. 可调多道（8）移液器（50－200µL）； 4. 供可调多道移液器使用的试剂存放槽； 5. 洗瓶或洗板机； 6. 蒸馏水或去离子水； 7. 1 升的圆柱形量筒； 8. 血清移液器：1 和（10 或 25 mL）； 9. 移液器枪头； 10. 纸巾； 11. 计时器，用以监控温育步骤； 12. 处理池和消毒剂（例如：0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水）； 注意事项: 1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达 到室温 20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。 2. 洗板不正确可以导致假阳性或假阴性结果。在加入酶联物或底物前确保尽量吸干孔 内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。 3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。 4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。 5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。 6. 在储存和温育时避免强光直接照射。 7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。 8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会 Page 3 破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。 标本收集 1. 用无菌静脉采血程序采集的新鲜血清和正确保存的血清可用在本试剂盒上。不需添 加任何抗凝剂或进行预处理。避免使用溶血标本，脂质标本或微生物污染的血清。 2. 室温（20－25℃）下保存标本不要超过 8 小时。2－10℃保存血清，不超过 48 小时。 如耽搁的时间更长，请在-20℃或更低的温度下保存标本。标本避免多次冻融，这样 可能会损失抗体活性，产生错误结果。 准备工作 1. 浓缩洗涤液(10X)用双蒸水稀释成 1X(至 1000ml)。未用完的放回 2-8°C。 2. 试剂盒应平衡至室温（20－25℃）再试验。 3. 血清标本、质控品、校正液用样品稀释液作 1:21 稀释，即 10ul 校正液加入 200ul 样 品稀释液中(10ul 血清加入 200ul 样品稀释液中)。混匀。(注意：样品稀释液用前摇 匀) 试验过程 1. 加入 100ul 已稀释质控品至适当酶标板孔中。 2. 加入 100ul 已稀释校正液至适当酶标板孔中。 3. 加入 100ul 已稀释血清至适当酶标板孔中。 4. 空白孔内加入 100ul 样品稀释液，室温 25 分钟。 5. 洗板： 手工洗板 5 次： a. 剧烈摇动并甩尽孔内液体， b. 在孔中加满洗液。保证孔中无残余气泡。 c. 重复前两步骤共 5 次。 d. 摇动并甩尽孔内液体，把板翻转，在厚叠吸水纸上拍干所有洗液。观察微孔板，确保 无残留的洗液。 如果使用自动洗板系统，设置加液体积为 300-350µL/孔。设置洗板循环为 5 个，且清洗 中无时间间隔。把微孔板从洗板机上移开，把板翻转，在厚叠吸水纸上拍干所有洗液。 6. 每孔加入 100ul 酶联物,室温 25 分钟。 7. 洗板：同步骤 5。 8. 每孔加入显色液 100ul；室温 10-15 分钟。 9. 每孔加入终止液 50ul，混匀，以空白孔调零，30 分钟内在 450nm 处读取 OD 值。 结果判断 Cutoff 值=校正液 Calibrator 的平均 OD 值×CF(CF 值位于盒内标签上) Index=标本的 OD 值/Cutoff 值 结果 Index 正常 ≤0.9 可疑 0.91-1.09 阳性 ≥1.1