5种水溶性维生素在奶粉中的稳定性研究

维生素是维持生物正常生命过程所必需的一类 小分子有机物，需要量很少，但对维持健康十分重要。 维生素不能供给机体热能，也不能作为构成机体组织 的相应物质，其主要功能是通过作为辅酶的成分调节 机体代谢。大多数的维生素体内一般不能合成或合成 量不能满足生理需要，必须从食物中摄取。长期缺乏 任何一种维生素都会导致相应的疾病。 水溶性维生素也叫 B族维生素，包括烟酸、泛酸、 叶酸、VB12、生物素等 12种水溶性维生素。多数维生素 的性质不稳定，对光、氧、热、pH等非常敏感，食物在加 工、储存、运输、销售等一系列环节都可能造成维生素 的损失。为了弥补这种损失，维生素常常作为强化剂在 食品工业的某些产品中使用。将合成的 B族维生素添 加到食品中补偿人体生长和健康的需要已经成为一种 世界范围内的行动。 维生素是在食品中添加的微量生物活性成分，必 须通过检测来严格控制其在食品中的添加量。由于维 生素通常是预混在食品中，所以具体的检测工作常常 在添加到食品之前进行；当然对于储存一段时间后的 食品，还应在之后重新检测。 此外，为了评价食品标签上标注成分的准确性。 美国食品和药物管理局 FDA规定维生素在食品中的 实际添加量必须为标签上标注量的 100 %或更多,而 原生维生素产品中的维生素含量必须为标签上标注量 5种水溶性维生素在奶粉中的稳定性研究 刘志楠，喻东威，赵源，刘晓川，李梅，赵雅丽 （内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司质量管理系统分析检测中心，内蒙古呼和浩特 011500） 摘 要：微生物法检测奶粉中水溶性维生素，为美国公职分析化学家协会 AOAC要求的官方检测方法，也为国标所采 纳，一直沿用至今。其灵敏度高，已被全世界所公认。但该法操作复杂，影响结果的因素很多，对检验人员和实验室的 要求较高。针对这一问题采取对同一样品进行大量的实验，以确定其波动性，为乳制品的检测提供有力的数据支持。 选取同一包奶粉进行多次重复测定，观察其样品与平均值的分布情况，相对标准偏差以及 CV值。烟酸、泛酸、叶酸、 VB12稳定性较好，生物素相对次之；烟酸和泛酸重复测定的精密度最好，叶酸和 VB12相对较好，生物素精密度次之。 关键词：微生物法；烟酸；泛酸；叶酸；VB12；生物素；CV值 The Stable Study on Five Water-soluble Vitamin in Milk LIU Zhi-nan, YU Dong-wei, ZHAO Yuan, LIU Xiao-chuan, LI Mei, ZHAO Ya-li （Inner Mongolia mengniu dairy industry（group）limited company quality management department analysis test center Huhhot 011500, Inner Mongolia, China） Abstract: The microbiological method for assay of vitamin in milk power is the method of the AOAC official requirement, which is also adopted and continued up to now in Chinese national standard. It’s high sensitivity was generally accepted by the world, while the method raise relatively high demand for laboratory and analyst for its complicated operation and much influencing factors. For the question, we made lots of experiments to detect a sample to definite the fluctuation and provide suitable data. Repeated detected the same milk power sample and viewed the value distribution of the sample , the average, the relative standard deviation and the CV. Nicotinic acid, pantothenic acid, folic acid and Vitamin12 possess better stability than biotin; nicotinic acid and pantothenic acid were the best in precision, folic acid and vitamin12 were better than biotin. Key words: microbiological method; nicotinic acid; pantothenic acid; folic acid; Vitamin12; biotin; CV value 作者简介：刘志楠（1982—），男（蒙），分析研究员，硕士研究生，研究方 向：食品检测与分析。 检测分析 2011年 4月 第 32卷第 4期 食品研究与开发 Food Research And Development 145 刘志楠，等：5种水溶性维生素在奶粉中的稳定性研究 的 80 %或更多（合理的超出部分通常认为是厂家在正 常生产过程中产的）,European Directive2002/46/EC 也 制定了一系列法规, 用于检测添加过维生素的食品中 标注的维生素含量[1]。 2010年我国针对食品安全体系存在的一些列问 题作出了相应的规定，出台了最新国家标准作为检测 乳品中各种营养素的国家强制性检测标准，国标 GB5413-2010[2-6]《乳产品标准及标准检验方法》对婴幼 儿配方食品与奶粉中维生素含量的检测方法、检测限 度、适用范围等都做了明确的规定。 目前我国维生素检测相关标准涉及的方法有微 生物法和高效液相色谱法。其中微生物法为水溶性维 生素通用方法，为烟酸、泛酸、叶酸、VB12、生物素所共 用，高效液相色谱法仅应用于烟酸和泛酸。 1 材料与方法 1.1 材料 奶粉。 1.2 试剂及设备 VB12、烟酸、叶酸、泛酸、生物素检测培养基及标准 品：购于中科院微生物研究所；无菌双蒸水，酶标仪 （630 nm）。超净台；微量移液器（100 μL~1 000 μL、 20 μL~200 μL）；一次性无菌滤膜（0.22 μm）；一次性无 菌注射器。 1.3 菌种 德式乳杆菌 Lactobacillusdelbrueckii.（ATCC7830）； 植物乳酸杆菌 Lactobacillus plantarum （ATCC 8014）； 鼠李糖乳杆菌 Lactobacillus rhamnosus（ATCC 7469）。 1.4 方法 微生物培养法：某些菌体生长对某种特定维生素 具有较强的依赖性。配制选择性的培养基，即含有菌 体生长除待测维生素以外的所有营养元素。待测维生 素添加的多少直接影响菌体的生长情况。通过添加不 同浓度的待检测维生素作为标注曲线，就可以半定量 判定样品中的特定维生素的含量，最后通过细菌生长 的浊度显示出来。 1.5 前处理 取 1 g样品至 50 mL离心管中，准确加入双蒸水 39 mL，漩涡混匀。在超净台中用 0.22 μm无菌滤膜过 滤至 1.5 mL或 2.0 mL无菌试管中。 1.6 培养基制备 加入 10 mL无菌水至维生素培养基中，盖好瓶 盖，摇匀。在 90℃~100℃水浴中加热至少 5 min，其间 振荡至少 2次（保证瓶子封闭），迅速冷却至室温（低于 30℃）。使用 0.22 μm无菌滤膜过滤培养基至 15 mL无 菌离心管中。 1.7 标准品配制 VB12、烟酸、叶酸、泛酸、生物素标准品用无菌水配 置成不同的浓度梯度，以无菌双蒸水为参比，在 630 nm 处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，标品浓度为横坐 标，绘制标准曲线。 1.8 检测步骤 取出需要数量的微孔板条并在板上固定，未使用 的微孔板条立即放回原来的箔袋中，并与干燥剂一起 重新封好，储存在 2℃~8℃条件下；用移液器吸取 150μL 待检维生素培养基至微孔中；用移液器吸取 150 μL标 准品或样品至指定的微孔中；用粘合箔盖住微孔条或 微孔；除去粘合箔上的保护层，将其平放在微孔条上， 用手或压舌板将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条， 保证粘合箔和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘部 分；在（37±1）℃黑暗条件下（可用孵育器）孵育 20 h~ 48 h。 1.9 测量及计算 用酶标仪 630 nm条件下读取混浊度。使用维生 素专用软件进行计算（4P法）。 2 结果 2.1 不同项目样品检测数值统计情况 对泛酸、烟酸、VB12、叶酸、生物素等 5种维生素的 平均值、标准偏差、RSD和 CV值的统计结果见 1。 表 1结果显示：烟酸和 VB12的 CV值均为 5 %，精 密度最高。泛酸和叶酸 CV值均为 7 %，精密度紧随其 后。生物素的精密度相对较低，CV值为 14 %。 2.2 不同项目样品检测数值与平均值的偏离情况 对泛酸、烟酸、VB12、叶酸、生物素等 5种维生素的 平均值进行横向的比较，横线为各检测项目的平均数 值。结果见图 1~图 5。 如图 1~图 5所示：样品结果成不规则分布，生物 素结果分布的较为开阔，总体数值与平均值偏移较大。 其余项目结果相对较好。 表 1 同一奶粉检测不同项目统计数值 Table 1 The statistic value of different item for the same milk power sample 平均值 标准偏差 RSD CV/% 30组泛酸数 值/(mg/kg) 3.61 0.26 0.07 7 30组烟酸数 值/（mg/kg） 3.88 0.19 0.05 5 30组 VB12数 值/（μg/kg） 2.08 0.10 0.05 5 30组叶酸数 值/（μg/kg） 61.71 4.10 0.07 7 项目 30组生物素 数值/（μg/kg） 42.00 6.06 0.14 14 检测分析 146 图 1 泛酸检测同一样品散点图 Fig.1 The same sample scatterplot of pantothenic acid determination 同一样品多次测定泛 酸 浓 度 /（ m g/ 10 0 g） 泛酸同一样本多次测定 3 结果与讨论 实验对同一样品不同项目进行 30 个组份的测 试，目的在于观测微生物法检测水溶性维生素的稳定 性。结果显示：烟酸、VB12、泛酸、叶酸的 CV值均小于 10%，符合国标所要求的在重复性条件下获得的 2次独 立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 %。 就样品性质而言烟酸（烟酰胺）性质非常稳定，数 据结果重复性很好，CV值为 5 %。其次 VB12的 CV值 也达到了 5 %，精密度烟酸和 VB12为最好。泛酸和叶酸 CV值均为 7 %，精密度紧随其后，但叶酸相对而言对 光较为敏感，操作时要相对注意一些，以防止其见光 分解。生物素相对于其他 4种而言变化相对较大，CV 值为 14 %。生物素的测定方法众多，微生物法非常灵 敏，但由于其他营养物质的影响，所以并非都能达到高 准确性[7]。除生物素外，几种维生素检测结果与平均值 偏离的范围均比较小。方法重现性和人员的操作过程 都在可以接受的范围内。叶酸来源于绿叶蔬菜,缺乏 时可引起细胞性贫血和粒细胞减少,尤其对于处于生 长发育旺盛期的婴幼儿,如果缺少足够的叶酸,生长就 会受到严重影响。孕妇在怀孕期间一般都需要补充叶 酸，以防止胎儿畸形的产生。所以叶酸的检测准确性 尤为重要。 食品中维生素的测定方法是以仪器分析法为主， 但对于少数几种维生素由于其含量甚微，低于仪器的 最低检出限，目前仍然依靠微生物法进行测定。但微 生物法不易掌握，因此将在测定中积累的一些经验归 纳总结，对食品企业或专业实验室的维生素微生物法 测定大有裨益。 参考文献： [1] 雷涛，张辉，韩惠雯，等.婴幼儿配方奶粉中水溶性维生素的检测 方法研究[J].乳业科学与技术，2004(2):81 [2] 中华人民共和国卫生部.GB 5413.15-2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中烟酸和烟酰胺的测定[S].北京：中国标准出 版社，2010：3-7 [3] 中华人民共和国卫生部.GB 5413.17-2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中泛酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2010： 1-4 [4] 中华人民共和国卫生部.GB 5413.14-2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素 B12的测定北京：中国标准出版社， 2010：1-4 [5] 中华人民共和国卫生部.GB 5413.16-2010食品安全国家标准婴 幼儿食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）的测定[S].北京：中国标准 出版社，2010：1-6 [6] 中华人民共和国卫生部.GB 5413.19-2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定[S].北京：中国标准出版 社，2010：1-4 [7] 刁力兰，李秀珍，杨平平，等.生物素测定方法的分析[J].食品与 发酵工程，2007，33(6)：107 收稿日期：2010-09-25 图 5 生物素检测同一样品散点图 Fig.5 The same sample scatterplot of biotin determination 同一样品多次测定烟 酸 浓 度 /（ m g/ 10 0 g） 烟酸同一样本多次测定 图 2 烟酸检测同一样品散点图 Fig.2 The same sample scatterplot of nicotinic acid determination 同一样品多次测定VB 12 浓 度 /（ μg /1 00 g） VB12同一样本多次测定 图 3 VB12检测同一样品散点图 Fig.3 The same sample scatterplot of vitamin 12 determination 同一样品多次测定 叶酸同一样本多次测定 图 4 叶酸检测同一样品散点图 Fig.4 The same sample scatterplot of folic acid determination 同一样品多次测定 生 物 素 浓 度 /（ μg /1 00 g） 生物素同一样本多次测定 叶 酸 浓 度 /（ μg /1 00 g） 检测分析 刘志楠，等：5种水溶性维生素在奶粉中的稳定性研究 147