疫苗

nullnull 在发展中国家，死亡总人数的30%～50%死于传染病。 在发达国家，传染病死亡人数仅占死亡总人数的4%～8%，主要得益于疫苗的广泛应用。null一、概述 二、灭活疫苗 三、减毒活疫苗 四、亚单位疫苗 五、活载体疫苗 六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗 疫苗 null一、概述1、疫苗的概念 人工免疫：有计划、有目的地给人体接种抗原，或输入抗体或免疫细胞，使机体获得某种特异性抵抗力，从而达到预防或治疗某种疾病的目的。null一、概述 人工主动免疫 人工被动免疫 输入物质 抗原（疫苗） 抗体或致敏淋巴细胞 诱导时间 慢（1～4周） 快（立刻发挥作用） 维持时间 长（数月~数年） 短（2~3周） 用 途 主要用于预防 治疗或应急预防人工主动免疫和人工被动免疫的比较疫苗：用于人工主动免疫的生物制品。null一、概述 疫苗：刺激机体免疫系统对某种病原微生物处于高度戒备状态-“时刻准备着！”null一、概述 人类急需的疫苗：HIV、HBV、HCV 生物武器和生物恐怖：炭疽杆菌、鼠疫杆菌、天花病毒null一、概述2、理想疫苗的● 安全：无致病性和接种后异常反应 ● 有效：可诱导产生可靠的保护性免疫 ● 实用：易于接种、保存和运输，价廉null3、疫苗的发展历史 ①古典疫苗时期：牛痘苗、狂犬病疫苗 ②培养疫苗时期：脊髓灰质炎疫苗、卡介苗 ③基因疫苗时期：乙型肝炎基因工程疫苗 一、概述null一、概述 二、灭活疫苗 三、减毒活疫苗 四、亚单位疫苗 五、活载体疫苗 六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗微生物疫苗 null 灭活疫苗（inactivated vaccine）：又称死疫苗，是用化学或物理的，将具有感染性的完整的病原微生物杀死，使其失去传染性而保留抗原性而成。 二、灭活疫苗null 百日咳、乙型脑炎、流行性脑脊髓膜炎、狂犬病、伤寒、钩体病、甲型肝炎、鼠疫、流感、脊髓灰质炎（salk）等疫苗。 二、灭活疫苗null ● 缺点：免疫力维持时间短，需要多次重复接种；接种剂量较大，不良反应；需要严格灭活。 二、灭活疫苗 ● 优点：易于制备；储存及运输方便；疫苗安全性高。null一、概述 二、灭活疫苗 三、减毒活疫苗 四、亚单位疫苗 五、活载体疫苗 六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗 微生物疫苗 null三、减毒活疫苗 减毒活疫苗（live-attenuated vaccine）：用人工诱变或从自然界筛选出的毒力高度降低或无毒的活的病原微生物制成的疫苗。null 结核病、脊髓灰质炎（Sabin）、麻疹、乙型脑炎、甲型肝炎、风疹疫苗、腮腺炎等疫苗。 三、减毒活疫苗null ● 优点：能诱发全面、稳定、持久的体液、细胞和粘膜免疫应答；一般只须接种一次；可采用口服、喷鼻或气雾途径免疫。 ● 缺点：有效期短和热稳定性差，运输、保存条件要求较高；回复突变危险；使用范围相对窄。 三、减毒活疫苗null 基因缺失活疫苗（gene deleted live vaccine）：采用分子生物学技术，去除与毒力或毒力相关基因片段，使病原微生物毒力减低或丧失。用缺失突变毒株制成的疫苗。三、减毒活疫苗 与自然突变株（多为点突变毒株）相比，基因缺失活疫苗具有突变性状明确、稳定、不易发生毒力返祖的优点。 null一、概述 二、灭活疫苗 三、减毒活疫苗 四、亚单位疫苗 五、活载体疫苗 六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗 微生物疫苗 null 对于某些抗原性弱、易发生免疫逃避的病原体，常规疫苗往往难以获得有效的免疫应答及保护性。四、亚单位疫苗 一些免疫保护机制不清，可能诱导免疫病理反应，有潜在致肿瘤作用的病毒，以及不易培养的病原体，则难以用传统方法生产疫苗。 null 亚单位疫苗（subunit vaccine）：不含病原体核酸，选用能诱发宿主产生中和抗体的微生物蛋白或面抗原而制成的疫苗。 四、亚单位疫苗null ● 白喉类毒素、破伤风类毒素 ● 流感嗜血杆菌荚膜多糖、脑膜炎球菌荚膜多糖 ● 流感病毒血凝素和神经氨酸酶 ● 乙型肝炎HBsAg ● 人乳头瘤病毒四、亚单位疫苗null 优点：除去了病原体中与诱发保护性免疫无关或有害成分，只保留有效的免疫原成分，因而免疫作用明显增强而稳定，可靠性提高，对机体引起的不良反应小。 缺点：需要选用佐剂；不能诱发细胞免疫和黏膜免疫。 四、亚单位疫苗null 将病原体中能诱导保护性免疫应答的目的抗原编码基因克隆后，插入适当的原核或真核表达载体质粒； 再将重组质粒导入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中高效表达目的基因； 分离、提取、纯化目的蛋白而制成。 基因重组亚单位疫苗 (genetic engineering subunit vaccine)四、亚单位疫苗nullnull基因工程疫苗发展的重点 ① 不能或难以培养的病原体； ② 有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体； ③ 传统疫苗效果差或不良反应大的病原体； ④ 能简化免疫程序、降低成本的多价疫苗。四、亚单位疫苗null一、概述 二、灭活疫苗 三、减毒活疫苗 四、亚单位疫苗 五、活载体疫苗 六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗 微生物疫苗 null 活载体疫苗（live vector vaccine）：又称重组载体疫苗（recombinant vector vaccine），是将有效的目的抗原的编码基因导入活载体（无或弱毒的细菌或病毒株）中，构建重组菌株；目的基因可随重组菌株在宿主体内的增殖而大量表达，从而诱发相应的免疫保护作用。 五、活载体疫苗null 载体：腺病毒、牛痘病毒、金丝雀痘病毒、伤寒沙门菌减毒株、卡介苗、乳杆菌等。 病原体：乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、痢疾杆菌等。五、活载体疫苗null一、概述 二、灭活疫苗 三、减毒活疫苗 四、亚单位疫苗 五、活载体疫苗 六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗 微生物疫苗 null 1990年，Wolff等首次发现，给小鼠肌肉注射裸露质粒DNA后，质粒携带的基因可被肌细胞摄取并在其中表达，还可诱生特异性免疫应答。 四、核酸疫苗null 核酸疫苗（nucleotide vaccine）：又称DNA疫苗（DNA vaccine），是将一种或多种目的抗原的编码基因克隆到真核质粒表达载体上；再将重组质粒直接注入到体内，在宿主细胞内表达目的蛋白，诱发特异性免疫应答。 四、核酸疫苗null 目前进入临床试验的核酸疫苗有HIV DNA疫苗和疟疾 DNA疫苗。四、核酸疫苗null 由于核酸疫苗具有构建容易、生产方便、表达稳定及可诱发全面的免疫应答等特点，在抗感染、抗肿瘤免疫及疾病的预防等方面具有广阔的应用前景，被誉为疫苗的“第三次革命”。 四、核酸疫苗null 局部注射的核酸（重组质粒DNA）被周围的细胞（如黏膜上皮细胞、抗原提呈细胞）摄取后，进入核内进行转录，并在胞质中翻译成目的蛋白。1、免疫机制四、核酸疫苗null 目的蛋白被蛋白酶复合体降解成含有表位的抗原肽，可作为： ● “内源性抗原”：与MHCⅠ类分子结合，诱发CTL介导的细胞免疫应答。 ● “外源性抗原”：与MHCⅡ类分子结合，诱发偏向Th1型免疫应答。四、核酸疫苗null 目的蛋白亦可通过细胞分泌或细胞破裂的方式进入组织间，以天然折叠形式激活B淋巴细胞而产生抗体。四、核酸疫苗null DNA疫苗接种后，体内仅表达pg～ng水平的外源蛋白，但能诱发强而持久的细胞免疫和体液免疫应答。 如何解释这一现象呢？ 四、核酸疫苗null 目的基因（含载体质粒）含有CpG基序的回文序列，能激活较强的CTL效应，并能激活巨噬细胞与NK细胞，因此，CpG回文序列被称为免疫刺激DNA序列。 CpG基序与IL-2、TNF-β、IFN-γ的基因结构相似而产生协同作用。 四、核酸疫苗null2、构建与免疫 ①目的基因的选择：侧重于免疫原性，即所表达的目的蛋白刺激机体免疫应答的能力。目的蛋白中是否具有受MHC分子限制的T细胞抗原表位，是保证核酸免疫有效的先决条件。 四、核酸疫苗null ②载体的选择：构建DNA疫苗的质粒通常是复制型的真核表达质粒，能高水平地表达目的基因。 四、核酸疫苗null免疫途径、剂量、时间：常见免疫途径有肌肉注射、皮内或皮下免疫、粘膜免疫等。 四、核酸疫苗null3、核酸疫苗与传统疫苗的比较 传统免疫所使用的抗原一般是灭活病原体、减毒的活病原体或病原体的亚单位蛋白。 核酸疫苗仅仅是病原体某种抗原的基因片段，可提供与天然构象极为接近的目的蛋白，提呈给宿主免疫系统，与自然感染过程相似。 四、核酸疫苗null 核酸疫苗兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全方位免疫应答的高效力。 四、核酸疫苗null 灭活疫苗和亚单位疫苗在体内代谢较快，难以长时间维持较稳定的含量，需多次接种免疫原，加强免疫。 核酸疫苗可在体内不断翻译表达，较长时间维持较高的蛋白水平，免疫具有连续性，一次接种可获得长期或终身免疫力。 四、核酸疫苗null一、概述 二、灭活疫苗 三、减毒活疫苗 四、亚单位疫苗 五、活载体疫苗 六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗 微生物疫苗 null 植物疫苗（plant-based vaccine）：亦称转基因植物疫苗（transgenic plant vaccine），是指将抗原基因导入植物细胞并在其中表达，人食用已表达目的抗原的转基因植物后，可诱发特异性免疫应答的新型疫苗。 五、植物疫苗null （1）建立整合抗原基因的稳定表达植株，并可通过无性或有性繁殖生产大量的转基因植物。 1、植物疫苗的构建五、植物疫苗null （2）建立瞬时表达植株，即利用基因工程植物病毒为载体，将抗原编码基因插入到植物病毒基因中，再将重组病毒株感染植物，抗原基因随病毒在植物体内复制而得以高效表达，获得高产量的目的蛋白。 五、植物疫苗null （1）植物种子、块茎、果实等是蛋白质很好的聚积和保存场所，使植物疫苗（重组蛋白）的生产、运输和储存更为容易，免疫途径更简便、安全。 2、植物疫苗的优点五、植物疫苗null （2）植物疫苗（抗原）通过胃内酸性环境时，可受到细胞壁的保护，直接到达肠粘膜部位，诱发粘膜和全身免疫应答，比传统的免疫途径更有效。 五、植物疫苗null （3）植物疫苗不需严格的分离纯化程序，经济价廉，可望替代传统的发酵生产，有利于在发展中国家推广。 五、植物疫苗null一、概述 二、灭活疫苗 三、减毒活疫苗 四、亚单位疫苗 五、活载体疫苗 六、核酸疫苗 七、植物疫苗 八、治疗性疫苗 微生物疫苗 null 预防性疫苗的接种对象是健康人群，多采用模拟自然感染过程的策略，一般为微生物的保护性抗原，成分较单纯，主要用于免疫预防作用，对机体无明显的病理损伤，使用安全可靠。六、治疗性疫苗null 预防性疫苗已广泛用于预防病原体进化相对保守、自然感染可获得牢固免疫力、保护性免疫主要依赖于中和抗体的传染病，如天花、脊髓灰质炎、麻疹乙型肝炎、白喉、破伤风等。六、治疗性疫苗null 治疗性疫苗（therapeutic vaccine）的接种对象是持续性感染患者，其抗原成分不像预防性疫苗那样单纯，可根据需要进行组合和调整，例如，将微生物抗原（基因）与不同细胞因子（基因）构建成嵌合性疫苗。 六、治疗性疫苗null 治疗性疫苗旨在激活Th1和有效的细胞免疫，打破机体的免疫耐受状态，部分纠正机体的免疫缺陷，提高对病原体特异性免疫应答水平，故特别强调佐剂的选用。 六、治疗性疫苗null 由于目前很多传染病、肿瘤等尚无有效的治疗药物，而治疗性疫苗的不良反应比化疗药物少，故治疗性疫苗与药物治疗可协同作用，提高机体的特异性免疫应答水平，加速康复，减少复发。六、治疗性疫苗null 目前，疫苗研制的主要问题是改进免疫方法，简化免疫程序，提高疫苗的稳定性及安全性，以及降低疫苗的生产成本。六、治疗性疫苗人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产流程生产流程生产流程细胞制备 病毒接种 病毒收获 病毒灭活 合并、浓缩、纯化 检定 分装及冻干 1. 细胞制备 1. 细胞制备 选用12－14日龄地鼠，无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化、分散细胞，接种培养瓶，用适宜的培养液进行培养。 培养液为含适量灭活小牛血清和乳蛋白水解物的MEM，199或其他适宜培养液 2. 病毒接种 2. 病毒接种接种狂犬病病毒，置适宜温度下培养一定时间后，弃去培养液，用PBS冲洗去除小牛血清，加入适量维持液，置33一35℃继续培养。3. 病毒收获3. 病毒收获经培养适宜时间，收获病毒液，根据细胞生长情况，可多次收获病毒液。 4. 病毒灭活4. 病毒灭活病毒收获液按1：4000的比例加入甲醛，置适宜温度下一定时间内灭活病毒。6.合并、浓缩、纯化 6.合并、浓缩、纯化 同批细胞生产的多次病毒收获液可在严格无菌操作的条件下合并为一批，经超滤或其他适宜方法适当浓缩。 经浓缩并检定合格的病毒液以柱色谱或其他适宜的方法纯化，纯化后加入适量人血白蛋白作为稳定剂及一定量硫柳汞作为防腐剂，即为原液。7. 原液检定 7. 原液检定 半成品配制、检定。 8. 分装及冻干8. 分装及冻干工业用冻干机进行冷冻干燥。null