亚硝酸盐急性中毒小鼠肝损伤机理探讨

※营养卫生 良 晶 科 学 2009,Vo1．30,No．07 229 亚硝酸盐急性中毒小鼠肝损伤机理探讨 巫光宏 1，初志战1，何 平1，黄卓烈1，陈 静 ， (1．华南农业大学生命科学学院，广东 广州 510642；2．暨南大学医学院，广东 广州 510632) 摘 要：目的：研究探讨亚硝酸盐急性中毒小鼠肝损伤作用及机理。方法：将小鼠随机分为正常对照组、亚硝酸 盐低、中、高剂量组。采用分光光度法测定小鼠肝组织的丙二醛(MDA)、谷光甘肽(GSH)的含量以及谷丙转氨酶 (ALT)的活性；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测超氧化物歧化酶(s0D)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性。结果：与 正常对照组比较，亚硝酸盐各组小鼠肝脏 MDA含量明显增高，以中、高剂量组差异显著(p<0．05和 P<0．01)； 转氨酶ALT活性均明显降低(p<0．01)，GSH含量均有所增高，以低剂量组差异显著(p<0．01)，结果呈现随亚硝 酸盐剂量增加MDA含量增高、AL，T活性及 GSH含量下降的趋势。同时 SOD、LDH的同工酶电泳结果显示， SOD 和 LDH的酶活随着亚硝酸盐剂量增高而明显下降。结论：亚硝酸盐急性中毒，可导致小鼠肝组织受损，其损伤 程度随剂量增加而加重，损伤机理与肝脏严重缺氧和 自由基增多有关。 关键词：亚硝酸钠；肝组织；急性中毒；自由基 Study on Mechanism of Acute Poisoning and Hepatic Injury Induced by Sodium Nitrite in Mice W U Guang—hong ，CHU Zhi—zhan ，HE Ping ，HUANG Zhuo—lie ，CHEN Jing · (1_College of Life Science，South China Agricultural Unive~ity，Guangzhou 510642，China； 2．CoHege of Medicine，Jinan University，Guangzhou 5 10632，China) Abstract：In this study，the mice were divided into four groups(normal group，low—dosage group of sodium nitrite，middle— dosage group of sodium nitrite and high-dosage group of sodium nitrite)．Spectrophotometric method was used to detect the contents of maleic dialdehyde(MDA)and glutathione(GSH)and the activity of alanine aminotransferase(ALT)in the liver． Lactate dehydrogenase(LDH)and superoxide dismutase(SOD)isoenzyme in the liver were determined by polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE)．The results showed that by compared with the control group，the MDA level of sodium nitrite groups is increased remarkably，the activity of ALT in sodium nitrite groups is decreased obviously(P< O．01)，and the GSH content is enhanced in sodium nitrite groups，especially in low—dosage group(p<0．01)．Meanwhile isoenzyme electrophoresis indi— cated that the activities of LDH an d SOD are reduced following with the increase of sodium nitrite dosage．In conclusion，the hepatictissueisdamagedby acutepoisoningwithnitrites，andthedegreeofinjuryisaggravatedfollowingwiththeincreaseof nitrites content．The mechanism ofhepafic injury may be connected with severe hypoxia and the increase offree radicals in liver． Key words：sodium nitrite；hepatic tissue；acute poisoning；free radical 中图分类号：R965 文献标识码：A 文章编号：1002．6630(2009)07．0229．04 亚硝酸盐是常用的食品添加剂，误食或过量使用， 极易导致急性中毒，甚至死亡 。其中毒机理与亚硝酸 盐进入体内和血红蛋白结合形成高铁血红蛋白及亚硝基 血红蛋 白，使之变性，丧失携氧能力，造成机体严重 缺氧有关⋯。然而了解机体在缺氧情况下肝脏、脑等组 织器官受损情况及机理，对修订亚硝酸盐食品添加剂安 全使用剂量和有效治疗亚硝酸盐急性中毒具有参考意 义。本研究旨在通过测定亚硝酸盐急性中毒小鼠的肝组 织生理生化指标变化，揭示亚硝酸盐对小鼠肝组织的损 害作用及其机理。 1 材料与方法 1．1 动物与试剂 健康雄性昆明小鼠56只，体重 1 8～22g。由广东 省实验动物中心提供。动物合格号：SCXK(粤)2003． 0002，粤监证字 2007AO06。 收稿 日期：2008—07．04 作者简介：巫光宏(1964．)，女，副教授，博士，主要从事动物生物化学研究。E-mail：wgh@scau．edu．ca 通讯作者：陈静(1960．)，女，教授，主要从事营养与慢性病研究。E．mail：nhl00@126．com 230 2009,Vo1．30,No．07 良 品 科 学 ※营养卫生 5％亚硝酸钠(NaNOz)溶液、硫代巴比妥酸、谷光 甘肽(GSH)、氮蓝四唑(NBT)，核黄素、四甲基乙二胺 (TEMED)、NAD 、甲硫酚嗪(PMS)等试剂为进口分装 或国产分析纯。 1．2 仪器与设备 高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；DUR530 核酸蛋白毛质自动分析仪 美国Beckman公司；PL一202一 S电子天平 梅特勒 一托利多仪器公司；DYCZ一23A电 泳槽、DD月稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂；TS一1 脱色摇床 江苏海门市麒麟医用仪器厂。 1．3 方法 1．3．1 动物的分组及处理方法 将小鼠随机分为正常对照组、亚硝酸盐高中低剂量 组，每组 14只。亚硝酸盐给药剂量，以LD50190mg／ kg bw为中剂量组，按等比值 1．38，设低剂量 138mg／kg bw，高剂量263mg／kg bw。正常对照组用蒸馏水灌胃； 亚硝酸盐高中低剂量组，分别以263、190和 138mg／kg bw剂量一次性灌胃。观察 24h内小鼠的急性毒性反应及 死亡情况。对死亡小鼠和 24h未死亡小鼠断头处死后， 立刻取肝脏称重，放置组织匀浆器中，加入冰浴冷却 的生理盐水研磨成 10％的组织匀浆液，10000r／min冷冻 离心 1 5min，取上清液，一80℃冷冻待用。 1．3．2 小鼠肝组织的丙二醛(MDA)及谷光甘肽(GSH)的 含量测定 肝组织的蛋白含量测定采用Bradford法【2J。MDA采 用硫代 巴比妥酸分光光度法测定⋯ ，分别测样品的 A45o、A532、A6oo值，按公式：C(umol／L)：6．45 A532 一 A600)一0．56A 50’计算出MDA的含量C( mol／L)，再 根据蛋白含量换算成 tamol／mg pro。 GSH参考相关研究方法进行测定【41。GSH曲线 的绘制，建立回归方程为Y=0．0498x(r=0．9978)，式 中：Y为412nm吸光度；X为GSH终浓度( g／m1)。肝 匀浆的GSH含量的测定：按标准曲线的方法进行测定样 品的吸光度(A -： )，对应标准回归方程式即可求出样品 溶液中GSH的浓度( g／m1)，再根据样品的蛋白含量转 换成 ug／mg pro。 1．3_3 小鼠肝组织的谷丙转氨酶(ALT)的活性测定 ALT测定方法为改良赖氏法[51。丙酮酸标准曲线绘 制，建立回归方程为Y=0．706x(r=0．9965)，式中： Y为520rim吸光度；x为丙酮酸含量( mol／L)。肝组织 的 A L T测定：按标准 曲线方法测定样 品的吸光度 (A )，对照标准回归方程式即可求出样品溶液中丙酮 酸的含量( mol／L)。ALT酶活为：样品液与ALT基质 液在37℃下反应 60min时每生成 1“mol丙酮酸所需的酶 量为 1个活性单位(U)。ALT的酶比活单位： 白所含有的酶活性单位(U／mg pro)。 1．3．4 小鼠肝组织的超氧化物歧化酶(SOD)、 酶(LDH)的电泳测定 每毫克蛋 乳酸脱氢 进行不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳(PAGE)t6]， 分离胶的浓度为 1O％，点样量均为 100 g／孔，浓缩胶 电压80V，分离胶电压 160V，一4℃电泳约 5h。SOD 活性染色：参照Beauchamp和Fridoich的方’7去【 ，电泳 后取下凝胶板，37℃，遮光浸泡于 lmg／ml NBT溶液中 20min，将凝胶移入 3．6×10—2mol／L pH7．8 PBS(内含2．8 ×10 5mol／L核黄素和 2．80×10 TEMED)中，遮光浸泡 15rain，然后移入5×10-2mol／L pH7．8 PBS中，在 lO001x 日光灯下光照20~30min，在蓝色背景凝胶中出现清晰 透明的区带即SOD同工酶活性带。LDH活性染色：分 别取 5mg／ml NAD+4ml、lmo儿 乳酸钠 2．5ml、0．1mollL NaC1 2．5ml、1mg／ml NBT 10ml、 lmg／ml PMS lml、 0．1mol／L PBS(pH7．5)5ml，混匀。37℃染色20min，凝 胶的LDH同工酶带呈现蓝紫色区带【6]。分别用蒸馏水洗 胶，在照片观察灯上进行拍照。 1．3 实验数据处理 采用SPSS 13．0软件进行统计分析，以 ±S表 示结果；组间差异采用方差分析及邓肯新复极差检验 分 析 。 2 结果与分析 2．1 不同剂量的亚硝酸盐小鼠24h中毒反应和死亡情况 用不同剂量的亚硝酸盐一次性灌胃后，24h内观 察，小鼠逐渐出现烦躁跳动 ，尖叫，继而呼吸困难， 口唇发紫，部分中毒小鼠最后伸腿死亡。其中，高剂 量组死亡 1 0只，中剂量组死亡 7只，低剂量组死亡 2 只，其他中毒小鼠症状由重减轻，平均 1 10min恢复正 常。表 1结果表明，随着亚硝酸盐剂量的增加，小鼠 出现中毒症状的时间缩短，死亡率增高，呈现明显的 剂量与效应关系。 表1 不同剂量亚硝酸盐小鼠中毒症状出现时间及死亡率(n=14， ±S) Table 1 Time of toxic symptom and death rates induced by different dosages of sodium nitrite in mice(n=14，x±S) 2．2 不同剂量的亚硝酸盐对小鼠肝脏组织的影响 表 2结果显示，与正常对照组比较，亚硝酸盐各 实验组MDA含量均有所增加，高剂量组差异极显著(p ※营养卫生 食 晶 科 学 2009,VoL 30,No．07 231 <0．01)，中剂量组差异显著(p<0．O5)；ATL活性均明 显降低(p<0．01)，GSH含量有所增加，低剂量组增加 最明显，差异显著(p<0．01)。 表2 各实验组肝组织MDA、GSH含量和ALT活性的比较(n=14， ±S) Table 2 Comparison of liver MDA．GSH and ALT levels among four groups(n=14．X±S) 组别 MDA(~moYmg pro)GSH(．u g／mg pro) ALT(U／mg pro) 正常对照组 0．7730±0．197 11．621± 1．367 95．792±2．798 亚硝酸盐低剂量组 1．688±0．157 18．410±0．779“74．138±2．143 亚硝酸盐中剂量组 2．146±0．215 13．612±0．978 58．179±1．350” 亚硝酸盐高剂量组 5．158±0．391” 12．560±0．714 45．799±5．430” 注： ．与正常对照组比较，P<0．05； ．与正常对照组比较，P< O．Ol。 2．3 不同剂量的亚硝酸盐对小鼠肝组织 SOD的影响 II III IV + I．正常对照组；II．亚硝酸盐低剂量组；III．亚硝酸盐中剂量组； IV．亚硝酸盐高剂量组。下同。 图1 各实验组肝组织SOD的聚丙烯酰胺凝胶电泳图 Fig．1 PAGE analysis of liver S0D by activity staining of foru groups 如图1所示，通过SOD酶活性的专一性染色可知， 亚硝酸盐各组SOD活性明显低于正常对照组，呈现随剂 量增加，SOD活性降低的负相关效应关系。 2．3 不同剂量的亚硝酸盐对小鼠肝组织LDH的影响 II III IV I + 图2 各实验组肝组织LDH的聚丙烯酰胺凝胶电泳图 Fig．2 PAGE analysis of liver LDH by activity staining of four groups 各实验组肝组织的LDH同工酶谱见图2，小鼠肝组 织的LDH同工酶只有 LDH5，亚硝酸盐各组LDH5酶活 性较正常对照组明显增高，以低剂量组最明显，中剂 量组次之，结果表明随亚硝酸盐剂量增加，肝脏组织 缺氧加重，LDH5酶活性逐渐下降，糖酵解代谢障碍。 3 讨 论 亚硝酸盐作为发色剂和防腐剂常用于肉类食品加工 中，但摄入过量可对人体产生危害，大量研究表 明，人类一次性摄入 0．2～0．5g亚硝酸盐可引起急性中 毒，3g即可致死[8]。为此我国在国家标准GB 2760— 1996 《食品添加剂使用卫生标准》中 了亚硝酸盐的用 量，粮食中的限量为≤3mg／kg bw、肉类制品中的限量 为≤30mg／kg bw、肉类罐头中的限量为≤50mg／kg bw[91。 本实验以高于国家肉类制品亚硝酸盐标准的4．6倍(138rag／ bw)、6_3倍(I90mg／kg bw)和 8．8倍(263mg／kg bw)倍剂 量给小鼠一次性灌胃染毒后，小鼠很快出现剧烈性跳 动、尖叫、继而呼吸困难，抽搐、 口唇紫青 、两腿 伸直而死亡，呈现随着亚硝酸盐剂量逐渐增加，小鼠 缺氧中毒症状出现的时间明显缩短，症状加重，死亡 率显著增高的趋势。认证了NaNO：作为一种强氧化剂， 进入小鼠血液后可使血红蛋白中的二价铁氧化成三价 铁，使其丧失携带氧的能力而致机体缺氧的机理【 】。 为观察在亚硝酸盐急性中毒情况下，肝脏组织是否 受损，测定肝损伤敏感指标 ALT活性。结果表明，实 验各组小鼠肝脏 ALT活性较对照组明显降低，呈现剂量 效应负相关，提示在亚硝酸盐急性中毒状况下，肝脏 组织受到破坏，并随剂量的增加而加重。国内外研究 发现，缺氧应激可导致肝组织中的AMP、次黄嘌呤堆 积和离子转运功能障碍，Caz+进入肝细胞激活 Caz+依赖 性蛋白酶，使黄嘌呤脱氢酶转变形成黄嘌呤氧化酶，随 后黄嘌呤氧化酶作用于因缺氧而堆积的次黄嘌呤时即可 产生大量 ·。同时，NaN0 分解的一氧化氮产物也 是一种活性 0 ·，过量 自由基可引发肝脏细胞膜脂质 过氧化反应，结构破坏、功能受损 -11】。本实验结果 发现，实验各组小鼠肝脏脂质过氧化最终代谢产物 MDA含量显著增多，并随亚硝酸盐剂量增加而增加， 而自由基清除物质还原型的谷胱甘肽(GSH)含量和抗氧化 酶SOD活性(图 1)则代偿性升高，但呈现随着亚硝酸盐 剂量增加而逐渐下降，表明在缺氧情况下，小鼠肝脏 氧化应急能力增强， 自由基异常增多，机体抗氧化能 力随着 自由基的增多，由代偿进入失代偿。结果证实， 亚硝酸盐引发组织缺氧和 自由基增多是造成肝脏损伤的 主要原 因。 乳酸脱氢酶(LDH)是机体糖酵解途径的一种重要的氧 化还原酶 ，以肝 、心肌、肾、肌 肉、红细胞中含量 较多，组织器官缺氧或损害时，乳酸脱氢酶活性会发 生显著变化，这对判断器官损伤程度具有重要意义[12】。 本研究结果(图 2)发现，小鼠肝脏乳酸脱氢酶主要以 LDH5为主，亚硝酸盐各组LDH5酶活性较正常对照组 明显增高，以低剂量组最明显，中剂量组次之，表明 232 2009,Vo1．30,No．07 良 品 科 学 ※营养卫生 小鼠肝脏在缺氧状态下，糖酵解代谢增强，但随着亚 硝酸盐剂量 的增加 ，小鼠肝脏缺氧 中毒症状加重， LDH5活性受抑制，糖酵解代谢障碍，肝组织由于缺氧 和能量供给不足，损伤加重，导致小鼠死亡。这可能 是亚硝酸盐所致肝脏损伤的另一个重要机制。 本实验结果提示，亚硝酸盐急性中毒所致机体缺 氧，容易导致肝脏组织的损伤。因此，建议在亚硝酸 盐急性中毒治疗过程中，应重视肝脏等组织器官抗氧化 营养物质的辅助治疗，这对肝脏康复具有积极作用。另 外建议在修订食物中亚硝酸盐标准时，应将肝脏受损因 素考虑进去 。 参考 文献： 【1]1 王春林，于炎湖，齐德生，等．肉鸭亚硝酸盐急性毒性试验fJ1．粮食 与饲料工业，2001，10：35．36． BRADFORD M M ．A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantifies of protein utilizing the principle of protein—dye binding[J]．Analytical Biochemistry，1976，72：248—254． 赵实杰，许长成，邹琦，等．植物组织中丙_醛测定方法的改进【J]． f4] [5] [6】 【8】 [9] 【10】 【11】 [12】 植物生理学通讯，1991，3O(3)：207．210． LAPSHINA E A，SUDNIKOVICH E J，MAKSIMC}IIK J Z，et a1． An tioxidative enzyme and glutathione stransferase activities in dia~tic rats exposed to long—term ASA treatment[J]．Life 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