抗血清制备及抗体效价测定

    摘要........................................................................................................................................4 【实验过程】    4 PartⅠ. NDV 抗血清制备    4 一、实验原理    4 二、实验仪器、材料和试剂    5 1. 仪器    5 2. 材料    5 3. 试剂    5 三、方法和步骤    5 （一）NDV 兔抗血清制备    5 1. 家兔捉拿方法    5 2. 家兔固定方法    5 3. 初次免疫    6 4. 二次免疫    6 5. 终末免疫    6 6. 试血    7 7. 颈动脉放血    7 8. 血清分离    7 9. 抗血清保存    7 （二）NDV 鼠抗血清制备    8 1. 小白鼠的捉拿和固定    8 2. 初次免疫    8 3. 二次免疫    9 4. 终末免疫    9 5. 试血    9 6．放血    10 7．血清分离    10 8．抗血清保存    10 Part Ⅱ. 琼脂双扩散实验检测抗体效价    11 一、基本原理    11 二、实验仪器、材料和试剂    11 1. 仪器    11 2. 材料    11 3. 试剂    11 三、方法和步骤    11 1. 灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原提取    11 2. 1%琼脂糖配制    11 3. 倒平板    11 4. 打孔    11 5. 稀释抗血清    12 6. 加样    12 7. 孵育    12 8. 结果观察    12 Part Ⅲ. 酶联免疫吸附试验测定 NDV 抗血清效价    13 一、基本原理    13 二、实验仪器、材料和试剂    13 1. 仪器    13 2. 材料    13 3. 试剂    13 三、方法和步骤    13 1. 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活抗原提取    13 2、抗原包被    13 3. 封闭    14 4. 洗板    14 5. 稀释抗血清    14 6. 加抗血清    14 7. 洗板    14 8. 加酶标二抗    14 9. 洗板    14 10. 显色    14 11. 终止    14 12. 读数    14 13. 结果判定    15 Part Ⅳ. 免疫印迹实验鉴定抗体的特异性    15 一、基本原理    15 二、实验仪器、材料和试剂    15 1. 仪器    15 2. 材料    15 3. 试剂    15 （1）SDS-PAGE 相关试剂：    15 （2）Western blotting 相关试剂：    16 三、方法和步骤    16 1. SDS-PAGE    16 2. 转膜    17 3. 免疫检测    17 （1）膜的封闭    17 （2）洗膜    17 （3）加入一抗    17 （4）洗膜    18 （5）与二级抗体作用：    18 （6）洗膜    18 （7）Odessey 近红外成像仪扫描成像    18 【实验结果及分析】    18 NDV 抗血清制备及抗体效价测定 摘要：抗血清，新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全群毁灭。以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C 株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制备新城疫病毒抗血清。也叫免疫血清，是指含有免疫蛋白的血清。抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。此次实验主要是进行家兔与小鼠的新城疫病毒抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验、兔疫印迹实验对其进行抗体效价检测。 关键字：NDV  抗血清  抗体效价  免疫 【实验过程】 本次实验一共分为四个大步骤： Part Ⅳ. 免疫印迹实验鉴定抗体的特异性 PartⅠ. NDV 抗血清制备 一、实验原理 将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应 B 细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中 实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强， 效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、 次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐 剂，以增强免疫性。 本实验介绍新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）抗血清的制备过程。新城疫病 毒（Newcastle disease virus，NDV）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病 毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒属（Paramyxovirus）中的 一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全 群毁灭。以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C 株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制 备新城疫病毒抗血清。 二、实验仪器、材料和试剂 1. 仪器 5mL 无菌冻存管，2.5mL 和 1mL 注射器，塑料静脉插管，碘酒，75％酒精棉球，剪刀，止血钳，250mL 无菌三角瓶，50mL 无菌尖底离心管，家兔固定槽，家兔解剖台，棉线，5mL吸头和移液器，温箱，离心机。 2. 材料 家兔：1-2kg 清洁级雄性或未孕雌免；小鼠：SPF 级 6-8 周龄昆明鼠。 3. 试剂 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），0.01M PBS（ pH7.2） （8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以 NaOH 调节 pH 至 7.2，加双蒸水至 1000 mL），麻醉剂：普鲁卡因溶液，硫柳汞。 三、方法和步骤 （一）NDV 兔抗血清制备 1. 家兔捉拿方法 动物的捉拿和固定是进行动物实验的基本操作之一，正确的抓取固定动物是为了不损害 动物健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，保证实验顺利进行。家兔习性温顺，除脚 爪锐利应避免被其抓伤外，较易捕捉。拿时切忌以手提抓兔耳、拖拉四肢或提拿腰背部。正 确的方法是用右手抓住其颈背部皮毛，轻提动物，再以左手托住其臀部，使兔的体重主要落 在左手掌心（如图 1）。 图 1. 家兔的捉拿方法 2. 家兔固定方法 家兔的固定，依不同的实验需要，常用兔固定箱或兔手术台固定。兔固定箱通常由木头、铁皮或者树脂材料制成，便于拆卸清洗消毒，一般用于固定兔子狐狸貉子等。使用时时可将家兔置于兔固定箱内，在不需要帮手的情况下单人即可对兔子等动物打耳号，灌药、耳缘静脉注射、取血、或观察耳部血管的变化等，常用于生理、药理和免疫等作动物整体实验时限制实验物的活动。（如图2） 图 2. 家兔固定箱固定方法 在需要观察血压、呼吸和进行颈、胸、腹部手术时，应将家兔以仰卧位固定于兔手术台 上。固定方法是：先以四条 1cm 宽的布带作成活的圈套，分别套在家兔的四肢腕或踝关节 上方，抽紧布带的长头，将兔仰卧位放在兔手术台上，再将头部用兔头固定器固定，然后将 两前肢放平直，把两前肢的系带从背部交叉穿过，使对侧的布带压住本侧的前肢，将四肢分 别系在兔手术台的木柱上。（如图3） 图 3. 家兔手术台固定方法 3. 初次免疫 在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择 6~10 处免疫接种 点，采用皮下、皮内或肌肉注射，每点注射上述鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.1～ 0.2mL。如果使用没有加佐剂的灭活新城疫病毒 Ulster 2C 株，也可以采用耳缘静脉注射的方法进行免疫。（如图4） 图 4. 家兔耳缘静脉注射方法 4. 二次免疫 第一次免疫后间隔2周再以鸡新城疫病毒Ulster 2C株灭活疫苗采用与初次免疫相同的方法在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位，选择 6~10 处免疫接种点，采用皮下、皮内或肌肉注射加强免疫。 5. 终末免疫 第二次免疫后间隔 2 周再按上述二次免疫方法进行第三次免疫。 6. 试血 终末免疫免疫 7 天后经兔耳缘静脉采血 2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗 体效价达 1:16 以上（稀释抗体）以上时，即可放血，如效价不高，则加强免疫 l 次后，再 行检测。 7. 颈动脉放血   将免疫家兔仰面固定于家兔手术台上，头部放低，暴露颈部。沿气管钝性分离皮下组织，暴露气管前的胸锁乳突肌；分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，在肌束下面靠近气管两侧，可见淡红色搏动的颈动脉。（如图5） 图 5. 兔颈部血管神经分布图 将双侧动脉仔细分离，于每侧动脉分别套入两根棉线，一根在远心端，一根在近心端， （图 6）。 图 6. 兔颈部动脉血管 先将一侧动脉远心端丝线结扎紧，然后在近心端用止血钳夹住（止血钳头部用细塑料管包裹，避免损伤动脉）。用小的尖头眼科剪在两侧丝线中间的动脉壁上剪开一个小口，以便插入塑料静脉插管（或大号钢针头），再用近心端棉线固定静脉插管，避免其从动脉内滑出；轻轻松开止血钳，血液很快沿导管流入三角瓶，直至血流缓慢点滴而出时，以同法在对侧动脉内插管放血，并将动物固定架后端抬高，增加放血量，一般一只家兔可放血80-100mL。 8. 血清分离 将血液置室温中凝固约 1hr，然后置 4℃过夜，使血块收缩；用 5mL 无菌移液管吸取上层血清，转移至 50 mL 无菌尖底离心管中。然后将血块自容器壁分离，将血清全部倾入另一 50 mL 无菌尖底离心管，在 4℃下 2,500g 离心 10 分钟，取上清液即血清部分与前述血清混合，将混合血清 4℃1,500g 离心 10 分钟，弃沉淀收集血清。 9. 抗血清保存 （1）4℃保存：将抗血清除菌后，加入 0.0l％硫柳汞或 0.1％叠氮钠，液体状态保存于 普通冰箱，可以存放 3 个月到半年，效价高时，一年之内不会影响使用。 （2）低温保存：将抗血清除菌后，加入等量甘油，放在-20℃或-40℃，一般保存 5 年 抗体效价不会有明显下降。抗体切忌反复冻融，反复冻融会使抗体效价显著降低。 （二）NDV 鼠抗血清制备 1. 小白鼠的捉拿和固定 小白鼠较大白鼠温和，虽也要提防被其咬伤手指，但毋需戴手套捕捉。可先用右手抓住 鼠尾提起，置于鼠笼或实验台上，用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳后颈背部皮肤，将鼠体 置于左手心中，拉直后肢，以无名指及小指按住鼠尾部即可。有经验者可直接用左手小指钩 起鼠尾，迅速以拇指利食指、中指捏住其耳后项背部皮肤亦可。如操作时间较长，也可固定 于小白鼠固定板上。（如图7） 图 7. 小白鼠的捉拿和固定 2. 初次免疫 分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL。 （1）腹腔注射法：小鼠固定后，使腹部朝上，颈部拉直，右手持注射器（5～6 号针头）， 从耻骨联合上一侧向头端以 30 度角刺入腹腔（应避开膀胱）。可先刺入皮下 2～3mm，再刺入腹腔，以防药液外漏。针头刺入部位不宜太高太深，以免刺破内脏。注射量一般为 0.1～0.25mL/10g 鼠重。 图 8. 小鼠腹腔注射法 （2）皮下注射法：一般两人合作。一人左手抓住小鼠头部皮肤，右手拉住鼠尾；另一 人左手提高背部皮肤，右手持住注射器（针头号同上），将针头刺入提起的皮下。若一人操 作，左手小指和手掌夹住鼠尾，拇指和食指提起背部皮肤，右手持注射器给药。一般用量为 0.05～0.25mL/10g 鼠重。 图 9. 小鼠皮下注射法 （3）肌肉注射法：两人合作时，一人抓鼠方法同上，另一人左手拉直一侧后肢，右手持注射器，注射部位多选后腿上部外侧（针头号同上）。如一人操作，抓鼠方法类似腹腔注射，只是药液注射在肌肉内，每腿的注射量不宜超过 0.1mL。 （4）尾静脉注射法：将小鼠置于待置的固定筒内，使鼠尾外露，并用酒精或二甲苯棉球涂擦，或插入 40℃～50℃温水中浸泡片刻，使尾部血管扩张。左手拉尾，选择扩张最明显的血管；右手持注射器（4～5 号针头），将针头刺入血管，缓慢给药。如推注有阻力而且局部变白，说明针头不在血管内，应重新插入。穿刺时宜从近为尖部 1/3 处静脉开始，以便重复向上移位注射。一般用药量为 0.1～0.2ml/10g，不宜超过 0.5ml/10g。 图 10. 鼠尾皮下注射法 3. 二次免疫 第一次免疫后间隔 2 周分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL。 4. 终末免疫 第二次免疫后间隔 2 周分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL，或者腹腔注射鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗 0.2mL。 5. 试血 末次注射 7 天后鼠眼球采血 0.2mL，分离血清，用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达 1:16 以上（稀释抗体），即可放血，如效价不高，继续加大剂量，加强 l-2 次后，常可使效 价增高。鼠眼球采血可采用以下两种方法： （1）眼眶后静脉丛采血：用 7~10cm 长的玻璃取血管，其一端内径为 1—1.5 mm，另 一端逐渐扩大，细端长约 1cm 即可，将其尖端折断，使其锋利。将取血管浸入 1%肝素或其它抗凝剂溶液处理，干燥后使用。采血时，右手提免疫后昆明鼠鼠尾，鼠头朝下将鼠旋转离心甩动 1min，左手拇指和食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并用中指配合，轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛充血。取用肝素过的医用毛细采血管，右手拇指、食指和中指握住毛细管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入约 2~3mm，手指旋转捻动毛细管以刺破静脉丛，鼠血顺毛细管流入 1.5mL 无菌离心管中，收集鼠血。采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。用本法短期内可重复采血。小鼠一次可采血 0.2—0.3 ml，大鼠一次可采 0.5—0.1ml（图 11）。 图 11. 鼠眼眶后静脉丛采血法   （2）眶动脉和眶静脉取血法：右手提免疫后昆明鼠鼠尾，鼠头朝下将鼠旋转离心甩动 1min，用镊子拔去一侧鼠眼球，用左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球突出，右手用无钩弯镊子或弯止血钳迅速摘除眼球，立即将鼠倒置，头朝下，眼眶内很快流出血液，将鼠血滴入 1.5mL 无菌离心管中，收集鼠血。注意不要让小鼠流血过多，以免死亡。一般只适用于一次采血。大部动物采血后可以存活，可采另一侧眼球取血。此法既能采取较大量的血液， 又可避免断头取血法中因组织液的混入导致溶血的现象，现常取代断头取血法。先使动物眼 球突出充血后，以弯头眼科镊迅速钳取眼球，并将鼠倒置，头向下，眼眶内很快流出血液， 让血液滴入盛器，直至不流为止。此法由于取血过程中动物未死，心脏不断在跳动，因此取 血量比断头法多，一般可取鼠体重 4～5％的血液量，是一种较好的取血方法。 （3）剪尾采血：需血量少时可用此方法。将动物固定，显露尾部，将尾尘剪去约 5mm， 从尾根部向尾端部按摩，血即从断端流出。若用二甲苯棉球涂擦尾部或事先将鼠尾浸在 45℃水中数分钟，使尾部血管充盈，可采到较多的血，但注意二甲苯可致溶血。也可用锋利刀片割破尾动脉或尾静脉，让血液自行流出，采血后，消毒，止血。如将动物麻醉取血量可更多些。三根尾势脉可交替切割，并自尾尖向尾根方向切割，小鼠每次采血约 0.1ml。 6．放血 小鼠也可以采取眶动脉和眶静脉取血法放血，此外还可用如下方法：   （1）断头取血：当需要较大量的血液，而又不需继续保存动物生命时采用此法。左手 捉持动物，使其头略向下倾，右手持剪刀猛力剪掉鼠头，让血液滴入盛器。小鼠可采血 0.8～1.0ml，大鼠可采用 5～8ml。 （2）心脏取血：动物仰卧固定在固定板上，剪去心前区部位的被毛，用碘酒酒精消毒 皮肤。在左侧第 3～4 肋间，用左手食指摸到心搏处，右手取连有 4～5 号针头的注射器，选择心搏最强处穿刺，当针刺入心脏时，血液由于心脏跳动的力量自动进人注射器。此法要求实验者掌握以下要点：要迅速而直接插入心脏，否则，心脏将从针尖处滑脱；如第一次没刺准，将针头抽出重刺，不要在心脏周围乱探，以免损伤心、肺；要缓慢而稳定的抽吸，否则，太多的真空反而使心脏塌陷。若不需保留动物生命时，也可麻*醉后切开动物胸部，将注射器直接刺人心脏抽吸血液。 7．血清分离 血清分离方法与（一）8 相同。 8．抗血清保存 抗血清保存方法与（一）9 相同。 Part Ⅱ. 琼脂双扩散实验检测抗体效价 一、基本原理 抗原、抗体在凝胶中扩散，并进行沉淀反应，称为免疫扩散实验（immuno diffusion）。 将抗原与其相应抗体加入含有一定电解质的琼脂凝胶平板中邻近孔内，抗原和抗体从小孔向 四周自由扩散，当扩散到两者浓度比例合适的部位时，出现白色的免疫复合物沉淀线，即双向琼脂扩散试验。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例，而 且与其分子大小及扩散速度相关。如果反应材料中有两种以上的抗原抗体系统，则两孔间出 现多条沉淀线。此方法最早由 Ouchterlony 提出，因此又称为 Ouchterlony 技术。本次实验将以 WF83 株酚水抗原检测兔抗 APP 抗血清效价，其中酚水抗原以 APP 的荚膜和脂多糖抗原为主，本方法也是 APP 血清学分型的常用方法。 二、实验仪器、材料和试剂 1. 仪器 11cm 平皿，200μL 微量可调移液器和吸头，打孔器，针头，1.5mL eppendorf 管，50 mL离心管，离心管架，温箱，微波炉，离心机。 2. 材料 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），上述用鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗免疫家兔、昆明系小白鼠制备的抗血清，未免疫家兔、昆明系小白鼠血清。 3. 试剂 0.01M PBS（ pH7.2）（8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以NaOH 调节 pH 至 7.2，加双蒸水至 1000 mL），琼脂糖，鸡新城疫病毒抗血清，氯仿。 三、方法和步骤 1. 灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原提取 取鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司）1mL，加氯仿 500µL，漩涡振荡器上充分混合均匀，高速台式离心机 12000rpm 离心 15min，收集上清备用。 2. 1%琼脂糖配制 称取琼脂糖粉 0.3 克，放入三角瓶，加入无菌生理盐水 30mL，微波炉中小功率加热， 使琼脂完全溶化。 3. 倒平板 取无菌 9cm 玻璃培养皿 1 个，平放于实验台（台面要水平），将融化的 1%琼脂溶液趁热倒培养皿中（约加 25mL），使琼脂厚度达 4mm，在室温下放置使琼脂冷却凝固。 4. 打孔 先取一张一张纸，画上将要打孔的图样，通常双向琼脂扩散实验打孔有双孔、线性排列 3 孔、三角形排列 3 孔、正三角形排列 4 孔、十字形排列 5 孔、梅花形排列 7 孔琼脂糖等模式（图）。将图样放在琼脂糖平板下方，将打孔器在正对图样为空的正上方垂直于琼脂糖平板上轻轻按下再用注射器针头挑取孔中琼脂糖，即形成加样微孔。注意在用注射器针头挑取孔中琼脂糖时不要碰伤了孔周围的琼脂。待微孔全部打好后，将平板经过酒精灯外火焰加热封底（温度不宜过高，防止琼脂融化过多，孔塌陷）。为了测定 NDV 免疫血清的效价，本实验采用梅花状排列的小孔，孔径为 8mm，空间距为 5-8mm。打好孔后用记号笔在琼脂平板的底面将孔编号。 图 12.琼脂双扩散实验打孔图样 5. 稀释抗血清 取 1.5mL 无菌尖底 12支离心管排列于离心管架上并做好标记，在每管各加生理盐水 100µL，吸取 100µL 免疫血清加入第 1 管，并充分混匀后吸出 100µL 加入第 2 管，经充分混匀后吸出 100µL 加入第 3 管中，如此依次 2×稀释至第 10 管，混匀后吸出 100µL 弃去。此时 1～10 管血清稀释度为 1:2～1:64。 图 13 稀释抗血清 6. 加样 在每组呈梅花状排列的小孔的中央孔加入一滴灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原 （30µL），周围各孔依次加入未免疫动物血清、不同稀释度抗血清各 30µL。加样时注意不 要使液体溢出孔外。 图 13.琼脂双扩散实验加样图 7. 孵育 盖上平板盖放入湿盒，置 37℃温箱孵育 24～48h。 8. 结果观察 将平板从湿盒中取出，在散射光的背景下（平板后方约 15cm 处用手或深色物挡住）观察，或在凝胶成像系统上用白光光源观察，看抗原孔与不同稀释度的抗血清孔之间是否有白色沉淀线，有沉淀线为阳性，否则为阴性。 图 14. 琼脂双扩散沉淀线 Part Ⅲ. 酶联免疫吸附试验测定 NDV 抗血清效价 一、基本原理 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, 简称 ELISA）是酶免疫技术的 一种，是将抗原抗体反应的特异性与酶催化反应的高效性相结合而建立的一种技术，其基本 原理是：将酶分子与抗体（或抗原）结合，当酶标记抗体（或抗原）与固相载体上的相应抗 原（或抗体）结合时，即可在底物溶液的参与下，产生肉眼可见的颜色反应，颜色的深浅与 抗原或抗体的量呈比例关系，用酶标仪测定其吸光值进行定量分析。ELISA 技术具有特异、 敏感、结果判断客观、简便和安全等优点，在生物学及相关学科中应用广泛。本次实验以 APP 分泌到细胞外的天然毒素 ApxIIA 为检测抗原，包被酶标板，通过间接ELISA 方法检测抗血清中针对毒素的抗体。 二、实验仪器、材料和试剂 1. 仪器 96 孔聚苯乙烯酶标板，200µL 和 10µL 微量移液器和吸头，10mL 无菌小烧杯，温箱， 酶标仪，洗板机。 2. 材料 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），上述用鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗免疫家兔、昆明系小白鼠制备的抗血清，未免疫家兔、昆明系小白鼠血清。 3. 试剂 包被液：0.01M 碳酸盐缓冲液（1.59 g NaCO3，2.93 g NaHCO3，加去离子水至 1000 mL），洗涤液：0.01M PBST（pH7.2，含 0.05％ Tween-20 的 PBS），封闭液：含 1％牛血清白蛋白（BSA）的 PBST，酶标二抗：辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG，使用时用PBST以1:5000稀释，显色液：四甲基联苯胺（3,3’,5, 5’-Tetramethylbenzidine,TMB）显色液，终止液：2M H2SO4 或 1％ SDS。 三、方法和步骤 1. 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活抗原提取   取鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司）1mL，加氯仿 500µL， 漩涡振荡器上充分混合均匀，高速台式离心机 12000rpm 离心 15min，收集上清备用。 2、抗原包被   取上述离心上清 100µL 加入用 900µL 包被液（碳酸盐缓冲液）稀释，在 96 孔酶标板各孔中加入稀释的灭活鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株抗原 100µL，在湿盒中于 37℃温箱孵育 2h，或 4℃包被过夜。 3. 封闭 取出 96 孔酶标板，甩干各孔中包被液，将 96 孔酶标板倒扣在吸水纸上叩干，每孔加入封闭液（含 1%BSA 的 PBST）100µL，37℃孵育 1h。 4. 洗板 取出 96 孔酶标板，甩去封闭液，每孔添加 PBST 200µL，浸泡 1min，甩干后再重复洗涤操作 2 次，将 96 孔酶标板倒扣在吸水纸上叩干或拍干。 5. 稀释抗血清 取 1.5mL 无菌尖底离心管 9 支排列于离心管架上并做好标记，在第 1 管中加入洗涤液297µL，其余各管各洗涤液 150µL，吸取 3µL 免疫血清加入第 1 管，并充分混匀后吸出 150µL加入第 2 管，经充分混匀后吸出 150µL 加入第 3 管中，如此依次 2×稀释至第 9 管，此时 1～9 管血清稀释度为 1:100～1:25600。           图 15稀释抗血清 6. 加抗血清 在 12 孔酶标板条第 1-9 孔依次加入 1:100～1:25600 各稀释度抗血清各 100µL，第 10、11 孔每孔加入 100µL 1:100 稀释的未免疫动物血清作为阴性对照，第 12 加 PBST 作为空白对照，将酶标板平放在 37℃培养箱温浴 1hr。 图16 加抗血清 7. 洗板 操作同步骤 4，需重复 4 次。 8. 加酶标二抗 在酶标板各孔加入 1:5000 稀释的 HRP 标记羊抗兔 IgG 100µL，将酶标板平放在 37℃孵育 1hr。 9. 洗板 操作同步骤 5，需重复至少 5 次。 10. 显色 在酶标板各孔加入 TMB 显色液 100µL，将酶标板置室温避光静置 10min。 11. 终止 在酶标板各孔加入 50µL 2M H2SO4，终止反应。 12. 读数 在 405nm 波长下以 12 孔为空白孔调零，测定光密度值。 13. 结果判定 P/N＝检测孔 OD 值/阴性孔 OD 值，P/N>2.1 为阳性，P/N<1.5 为阴性，介于其间为可疑。效价判定：以出现阳性孔的最高稀释度作为待检血清效价。 Part Ⅳ. 免疫印迹实验鉴定抗体的特异性 一、基本原理 免疫印迹（Western blotting）最早是由 Towbin 等于 1979 年将 Southern blotting 技术扩展到蛋白质领域，并与特异灵敏的免疫分析技术相结合而发展的技术。它的基本原理是将凝胶电泳与固相免疫结合起来，其主要的操作分为三个过程：1）将抗原物质经 SDS-PAGE 凝胶电泳分离；2）将分离的组分从 PAGE 凝胶上转移到固相基质上，如硝酸纤维素膜等，此过程称为印记，以利于随后的检测反应的进行；3）对转移后的组分分别进行免疫检测，与抗血清一起孵育，使一级抗体与待检测的抗原决定簇结合，再与经荧光素、酶或核素标记的第二抗体反应，显示出蛋白组分区带，并可对其进行定量。 图 17. 免疫印迹实验图 二、实验仪器、材料和试剂 1. 仪器 电泳仪，垂直电泳槽，电转膜仪，水平摇床，无菌培养皿，凝胶成像系统或相机 2. 材料 鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），上述用鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗免疫家兔、昆明系小白鼠制备的抗血清，未免疫家兔、昆明系小白鼠血清。 3. 试剂 （1）SDS-PAGE 相关试剂： ①5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：75.5g Tris 碱，470g 甘氨酸，250mL 10% SDS，加去离子水溶解定容至 5000mL； ②：1.5mol/L（pH8.8）：Tris 碱 181.7g 溶于去离子水中，用 HCl 调 pH 值至 8.8，定容至 1000mL； ③1.0mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH6.8）：Tris 碱 121.1g 溶于去离子水中，用 HCl 调 pH 值至 6.8，定容至 1000mL； ④10%过硫酸铵：1g 过硫酸铵溶于 10mL 去离子水中，4℃保存； ⑤2×SDS 凝胶加样缓冲液：10mL 1.0mol/L Tris-HCl （pH6.8），3.1g 二硫苏糖醇（DTT）， 4g SDS，0.2g 溴酚蓝，20mL 甘油，定容至 100mL； ⑥30%聚丙烯酰胺母液：将 145g 丙烯酰胺和 5g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于 300mL 去 离子水中，加热至 37℃溶解，定容至 500mL，4℃避光保存备用； ⑦考马斯亮蓝染色液：450mL 甲醇，450mL 去离子水，100mL 冰乙酸，2.5g 考马斯亮蓝 R250，溶解后定容至 1000mL； ⑧脱色缓冲液：450mL 甲醇，450mL 去离子水，100mL 冰乙酸，定容至 1000mL； ⑨其它：预染蛋白质 Marker，正丁醇 （2）Western blotting 相关试剂： ①转膜缓冲液：2.9g 甘氨酸，5.8g Tris 碱，0.37g SDS，200mL 甲醇，定容至 1000mL； ②洗涤液：含 0.5％ Tween 20 的 TBS。TBS（pH8.0）：称取 1.21g Tris 碱，8.77g NaCl， 充分溶解，调 pH 至 8.0 后，定容至 1000mL； ③封闭液：含 10％ 脱脂奶的 PBST 溶液； ④一级抗体：鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗免疫家兔制备的抗血清，使用前用 PBST 以 1:100 稀释； ⑤二级抗体：IRDye800 标记的羊抗兔 IgG，使用前用 PBST 以 1:15000 稀释； ⑥终止液：灭菌去离子水 三、方法和步骤 1. SDS-PAGE （1）夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板； （2）配制 12%的 SDS 丙烯酰胺分离胶 10mL，在烧杯中依次加入：     灭菌去离子水          3.3mL 30%丙烯酰胺溶液      8mL 4mL 1.5mol/L Tris（pH8.8）  2.5mL 10% SDS              0.1mL 10%过硫酸铵          0.1mL TEMED              0.004mL 摇匀后用移液器加入到两块玻璃板的间隙中； （3）在分离胶上加入正丁醇 0.3mL，置 37℃约 30min； （4）待分离胶聚合后，倾出覆盖层的正丁醇液体，用去离子水淋洗凝胶表面 2～3 次， 用滤纸片吸净残留液体； （5）配制 5%浓缩胶 3mL，在烧杯中依次加入： 灭菌去离子水              2.1mL 30%丙烯酰胺溶液 8mL      0.5mL 1.0mol/L Tris（pH6.8）      0.38mL 10% SDS                  0.03 L 10%过砀酸铵                0.03mL TEMED                  0.005mL 摇匀后加到分离胶上，立即插入梳子，置 37℃约 10min。 （6）待凝胶完全聚合后拔出梳子，固定于电泳装置。加电泳缓冲液，直至盖住点样孔； （7）取 10μL NDV 与等体积的 2×SDS 凝胶加样缓冲液混合，加入已经预制好的 SDS-PAGE 胶点样孔中； （8）将电泳装置与电源相接，将电压调到 80V（约 30min），待指示溴酚蓝泳动至分离胶时，将电压调到 120V，待溴酚蓝泳动至分离胶底部时关掉电源（约 90min），取出聚丙烯酰胺凝胶。 2. 转膜 （1）待电泳结束后，戴上手套，取下凝胶，确定样品所在泳道，切除浓缩胶，测量实 际电转所用胶块大小（长×宽）； （2）剪切 6 张滤纸和 1 张硝酸纤维素滤膜，滤纸和硝酸纤维素滤膜的大小需同凝胶的大小完全相等或略小于凝胶； （3）将硝酸纤维素滤膜浸于去离子水中，使其完全湿润，剪去一个角落作为记号，将 6 张滤纸浸泱于电转缓冲液中； （4）按照如下顺序于安装电转移装置（如图 15 所示）： 塑料夹板（黑色）－海绵垫－3 张滤纸－凝胶－硝酸纤维素滤膜－3 张滤纸－海绵垫－ 塑料夹板（白色），每加一层，需要精确对齐，并用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡。 摆放好后，将夹板固定于电转槽中，连接电源，根据凝胶面积按 0.65mA/cm2 接通电流，将电转槽放置于冰水混合物中电转移 1h。 图 18. 电转移装置安装示意图 3. 免疫检测 （1）膜的封闭 电转移结束后，取出硝酸纤维素滤膜放入洁净平板中，加入封闭液（含 10% 脱脂奶的 PBST）10mL，平放于水平摇床上室温作用 1h。 （2）洗膜 把硝酸纤维素滤膜放入一个新的平板中，加入 20mL 洗涤液 PBST，平放于摇床上室温摇动 5min，并重复洗涤 2 次。 （3）加入一抗 把洗涤后的硝酸纤维素滤膜放入一个新的平板中，加入 10mL 一级抗体反应液（用 PBST以 1:100 稀释的鸡新城疫病毒 Ulster 2C 株灭活疫苗免疫家兔制备的抗血清），平放于摇床上室温反应 30min。 （4）洗膜 将硝酸纤维素滤膜转移至一个新平板，用 PBST 洗膜 3 次，每次 5min。 （5）与二级抗体作用： 把硝酸纤维素滤膜放入一个新平板，加入 10mL 二抗反应液（用 PBST 以 1:15000 稀释的 IRDye800 标记的羊抗兔 IgG），平放于摇床上室温反应 30min。 （6）洗膜 将硝酸纤维素滤膜转移至一个新平板，用 PBST 洗膜 3 次，每次 5min；再用 PBS 洗膜2 次，每次 5min。 （7）Odessey 近红外成像仪扫描成像 打开 Odessey 近红外成像仪，将上述硝酸纤维素滤膜平铺于扫描区表面，选定激发光和发射光波长，用 Odessey 近红外成像系统扫描拍照。 图 20. 免疫检测示意图 【实验结果及分析】 表格1小鼠酶联免疫吸附试验结果 由图可知，出现阳性孔的最高稀释浓度为25600，故小鼠血清效价为25600。 表格2 兔子酶联免疫吸附试验结果 由图可知，出现阳性孔的最高稀释浓度为25600，故兔子血清效价为25600。 兔疫印迹实验鉴定抗体特异性图（见图中标记处） 由左图可知，最左边的为兔疫印迹条带，右边为鼠疫印迹，都得到了较好的印迹图，说明抗体特异性较好。