晚期糖基化终产物修饰的LDL激活肥大细胞脱颗粒的受体途径研究（可编辑）

晚期糖基化终产物修饰的LDL激活肥大细胞脱颗粒的受体途径研究（可编辑） 二 第 军医大学 博士学位论文 晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细 胞脱颗粒的受体途径的研究? 研 究 生 赵馨娜 专 业 内科学心血管病 研究方向 冠心病防治 导 师 吴宗贵教授 导师组成员 梁春副教授 任雨笙教授 潘晓明副教授 廖德宁教授 论文提交日期 年月 学位授予日期 年月 第二军医大学第二附属医院?上海市凤阳路号 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其 他人 已经发或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明 的法律责任。 签字日勘芦月占日 学位论文作者签名:饼 学位论文使用授权书声明 本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定,有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文 被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者鲐铆种 剥醛钦 签字日期:年月日 签字日期艄月譬日本课题受国家自然基金面上项目基金资助 项目名称:节律调控分子.调节肥大细胞功能诱发斑块 破裂的机制研究 项目编号:目录 中文摘要英文摘要 缩略语 前言 日?舌”?一”??”一“一一“?”?一“??’ 第一部分:颈动脉斑块中的与及.在体外对 脱颗粒功能的影响? .材料与方法? .结果.讨论? 第二部分:在.诱导脱颗粒中的作用.材料与方法? .结果? .讨论? 第三部分:.介导脱颗粒的机制研究? .材料与方法? .结果??“一.. .讨论? 论文总结 参考文献综述 致谢晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径 的研究 摘要 研究背景:糖尿病的心血管并发症己成为糖尿病患者致残和致死 的最主要原因。 其中低密度脂蛋白 ,经晚期糖基化终产物 ,修饰后形成的糖基化低密度脂蛋白 ,.在体内沉积后对促进动脉粥 样硬化,的发生与发展起着尤其重要的作用。目前研究表明, 肥大细胞 ,作为一重要细胞组成成分参与了的形成和免疫介导 的斑块失稳定进程。然而,.对肥大细胞活性的影响及其相关机制尚未见报 道。 研究目的:研究?对小鼠骨髓来源肥大细胞 ,脱颗粒活性和样受体. ,的表 达及其相关信号通路的影响,为糖尿病致和急性心血管事件提供新理论。 研究方法:.取行颈动脉内膜剥脱术患者的颈动脉斑块,甲苯胺蓝染色及激光 扫描共聚焦显微镜 ,观察斑块内和 的分布情况。.获取雄性、.周龄/小鼠的骨髓细胞,经含重组鼠白 细胞介素. .,一和重组鼠干细胞因子 ,培养体系诱导骨髓细胞向肥大细胞分 化,观察细胞形态,周后收集悬浮细胞,甲苯胺蓝染色和流式细胞 仪检测鉴定 。.给予不同浓度的.刺激分化成熟的,分别检测其释放组胺及 .己糖胺酶水平,评价刺激活化脱颗粒的能力。.对可能介导 .激活肥大细胞的受体的研究:实时定量聚合酶链反应. .. 、流式细胞仪和.检测表面的基因和蛋白表达。检测基因敲除 , 的经.干预后的组胺及.己糖胺酶释放水平。.研究 .影响肥大细胞活性可能的信号通路:用.刺激肥大细胞,分 、 别在不同时间点用分析核因子.,、 /及磷酸化情况。分别用.、、/抑制剂、、 预孵肥大细胞后,再给予.刺激,观察细胞释放组胺和.己糖胺酶 的情况。 研究结果:.在人颈动脉斑块标本中观测到肥大细胞浸润及的沉积。.第二军医大学博士学位论文 经一和在体外诱导小鼠骨髓细胞.周后,甲苯胺蓝染色显示超过% 的细胞被染成蓝紫色,流式细胞仪检测细胞表面分子 和表达,双阳性 率超过%,鉴定为成熟的肥大细胞。.?呈浓度依赖性地激活肥大细胞释 放组胺和.己糖胺酶,在分钟时达到峰值,与对照组和非糖化低密度脂蛋白. 组相比差异均有统计学意义.,在干预浓度为/时作用最强。. .能够通过上调表面的表达促进肥大细胞脱颗粒,敲 除后?促肥大细胞脱颗粒的能力显著下降。..刺激肥大细胞后能 够促进、/和.磷酸化,对磷酸化则无影响;. 作用分钟时.和磷酸化表达己可升到最高,作用分钟时/ 磷酸化表达最高。敲除的肥大细胞?、和/磷酸化水平 不受.影响。、/和.抑制剂、和 均能拮抗.对肥大细胞释放组胺和.己糖胺酶的影响。 研究结论:.能够激活肥大细胞脱颗粒,促进其释放组胺和.己糖 胺酶, 该作用由介导,并与、/和.信号通路的激活相关。 ?对肥大细胞脱颗粒活性的影响可能是导致糖尿病患者易患和易 发急性 心血管事件的重要病因之一。 关键词:糖基化修饰的低密度脂蛋白,肥大细胞,动脉粥样硬化, 样受体, 脱颗粒: .?. . .’ . : ?, . . :. .. . ,. / . 、访 ..、. . . .。 . . .,, .. 叫‘, ., .肿 砌/ ,.. . ?.、 ?不 小, / . 讼 一一第二军医大学博士学位论文 : , , ?迅. % . . .. ..。?, . ,/ 匝订. ., 肿, 叫。 . .?心./ .... : .. .. ; : ;;; ..晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径的 研究 缩略词表 中文全称 动脉粥样硬化 低密度脂蛋白晚期糖基化终产物.晚期糖基化终 产物修饰的 低密度脂蛋白肥大细胞 小鼠骨髓细胞 小鼠骨髓来源肥大细胞野生型敲除 样受体样受体 糖基化终产物受体 . 重组鼠白细胞介素重组鼠千细胞因子 激光扫描共焦显微镜.逆转录聚合酶链反应.实时定量聚合酶链 反应 .白细胞介素 .伐 肿瘤坏死因子 丫 丫干扰素 ?核因子‘ 丝裂原活化蛋白激酶. 氨基端激酶细胞外信号调节激酶异硫氰酸荧光素 一一第二军医大学博士学位论文 藻红蛋白 ’ 平衡盐溶液 磷酸盐缓冲液 邻苯二甲酸二碳基乙醛 .硝基苯..乙酰基...? 氨基葡萄糖胺 辕食啖免疫印迹 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 .心 过硫酸铵 ?? 四甲基乙二胺乙二胺四乙酸 加强化学发光法 缓冲液加吐温信使核糖核酸 牛血清白蛋白 胎牛血清二甲基亚砜 .晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径的研究 ‘?一 罱 日 糖尿病是导致动脉粥样硬化的重要危险因素,具有很强的致微血管和大血管病变 作用。相关研究发现,糖尿病患者患冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病率是非糖尿病 患者的数倍【】。冠心病合并糖尿病患者冠脉病变更加弥散,累及冠脉支数更多,病变 部位斑块极不稳定,容易破裂,导致急性冠脉综合征 , 甚至猝死圳。因此,研究糖尿病中触发动脉粥样硬化斑块破裂的因素对疾病的防治 具有重大意义。 近年来,有关高血糖症引发动脉粥样硬化的分子机制取得了重大进展,其中 经糖基化修饰后形成的.在动脉粥样硬化发生和发展中起到尤为重要的作用 瞄】。葡萄糖可与循环或血管壁中的发生非酶糖基化反应可逆性的生成早期糖基 化产物碱,而后在持续高血糖状态下经脱水、氧化、重排等一系列化学反 应最终生成稳定而不可逆的.【】。研究表明,糖尿病患者体内的. 水平远远高于非糖尿病患者,且.的水平与罹患心血管疾病的风险正相关瓯】。 .长期存在于体内可损伤细胞摄取能力,诱导细胞凋亡,介导血管细胞粘附 分子.表达,降低的转运和血管活性物质的合成,调节巨噬细 胞受体表达,损伤血管反应性等,诱导炎症损伤反应【。。机体的许多组织和细胞均 表达包括清道夫受体、等受体,早期研究发现在斑块中表达 显著升高【】,且.能够激活”】和,但其促的确切机制尚 未完全明了。 众所周知,肥大细胞与变态反应和先天免疫反应相关,其功能的发挥主要通过其 活化及脱颗粒来实现。肥大细胞活化及脱颗粒产物包括组胺、肝 素、蛋白酶类糜蛋 白酶,类胰蛋白酶、白细胞三烯,和、 前列腺素和及多种细胞因子和趋化因子如.、、、、 .、.等等。近年发现肥大细胞参与人动脉粥样硬化斑块的炎性浸润。尸检和 病理检查显示,肥大细胞在动脉粥样硬化斑块破裂部位尤其是斑块肩部大量聚集,且 活化的肥大细胞比例明显增?刀。在早期动脉粥样硬化阶段的脂质条纹中即发现有 大量的肥大细胞存在,与巨噬细胞毗邻。在晚期动脉粥样硬化斑块中有外膜的微血管 侵入【,这些微血管周围附着大量富含致新生血管形成因子一的肥大细胞【, 诱导新生血管形成【,而新生血管管壁脆弱,再加上肥大细胞分泌的蛋白酶对血管基 底膜的降解,导致斑块内出血,斑块失稳定【只临床上也可见单纯过敏反应所诱发 一一第二军医大学博士学位论文 的过敏性心绞痛和心肌梗死,即综合征 的病例报道【.。 最近,等【】也报道了动脉粥样硬化小鼠模型中肥大细胞直接参与动脉粥样硬化的 证据。 肥大细胞细胞分泌师吨,.和,使内皮细胞粘附分子.选择素、.,及基质金属蛋 选择素和血管细胞粘附分子 白酶 ,表达上调,促进动脉粥样硬化的发生发展【,。 肥大细胞产生的类胰蛋白酶和糜蛋白酶可以通过激活并增强其活性【引,直 接降解细胞外周基质成份【,破坏斑块的纤维帽。另外,肥大细胞的活化可以诱导内皮细胞】和血管平滑肌细胞 ,凋亡,抑制 增殖和胶原合成【,,积极参与动脉粥样硬化斑块的削弱和破裂。肥大细胞还分泌组 胺,前列腺素、白三烯,增加血管通透性,引起冠脉收缩,平滑肌细胞迁移,促进炎 症‘。脱颗粒后释放的肝素,则能激活抗凝血酶?,影响脂肪分解】。因此,进一 步探索肥大细胞在动脉粥样硬化斑块失稳定中的一系列作用和机制对冠心病的预防 和治疗意义重大。 作为形成和发展的两个主要参与者,.对活性影响及其机制的 研究在国内外尚未见报道。本研究以.作为干预因素,观察其对体外培养的 小鼠骨髓来源肥大细胞脱颗粒功能的影响,并对相关受体介导及信号通路分子机制进 行初步探讨,为糖尿病导致的和急性心血管事件的研究和防治提供新理论、新视 点。晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径的研究 第一部分 颈动脉斑块中的与及在体外 对脱颗粒功能的影响 斑块破裂继发血栓形成是引起急性冠脉综合征的主要原因【引。长期高血糖导致的 机体体内大量?沉积和定植于血管组织的肥大细胞被激活后释放胞内活性介 质是形成及斑块失稳定的两个重要致病因素】。早期研究发现人斑块中有 沉积【 ,随病变进展可在和巨噬细胞内沉积;等人【】的研 究亦证实肥大细胞在动脉粥样硬化斑块破裂部位尤其是斑块肩部大量聚集。但 ?是否通过激活肥大细胞促使其脱颗粒从而参与进程尚不清楚,本研究 中我们将就这一问题进行探讨。 材料与方法 材料 、实验标本: 行颈动脉内膜剥脱术患者的颈动脉斑块标本,取自第二军医大学 附属长征医院血管外 科。 、实验动物: .周龄雄性/小鼠,购自第二军医大学动物实验中心。 、主要试剂: 多聚甲醛:江苏星联化工厂产品。 %多聚甲醛:先配缓冲液. ., .,双蒸水。 加温至一。,加入多聚甲醛,滴加,搅拌使之溶解,调值至约 .,双蒸水定容至。 甲苯胺蓝:上海生工生物技术有限公司 甲苯胺蓝染液: %乙醇加入甲苯胺蓝粉剂,配置甲苯胺蓝母液,。第二军医大学博 士学位论文 避光保存。使用时新鲜配置工作液:.氯化钠加入双蒸水配置%氯 化钠, 取加入甲苯胺蓝母液,调值至约..,用后丢弃。 ×: , 。铅, ., ,溶于蒸馏水 中,调节值至.,定容至,高温高压灭菌后?保存。使用时,用灭菌 蒸馏水稀释为×溶液。 ×修复液:谷歌生物 .鼠单克隆抗体: 产品 抗兔多克隆抗体:公司产品? :公司产品? :公司产品? :公司产品 ? 一 公司 产品? . :公司产品 :公司产品 牛血清白蛋白:,北京索莱宝科技有限公司分装 :谷歌生物 胎牛血清:,公司产品 细胞培养液:改良型.培养基,使用时加入胎牛血清使其 终浓度为%。 双抗青霉素/,链霉素/:公司 .:产品 :产品。 标记的抗小鼠 .单克隆抗体:产品 标记的抗小鼠单克隆抗体:产品 巯基乙醇:产品 公司产品 流式彘: 无水乙醇:上海振兴化工一厂 %医用酒精;长征医院 蛋白定量试剂盒:美国公司产品 购自公司,使用时用甲醇配制成%作液,避光保存不能超过 两个星期。 .. ,.,. ,. ,. ..晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径的 研究,. ,溶于双蒸水中,调节值至 ,. .左右,定容至,高温高压灭菌后保存备用。 甲醇:上海振兴化工一厂, 柠檬酸盐缓冲液 .:柠檬酸 :国药集团化学试剂有限公司 :购自公司。.加至柠檬酸盐缓冲液中,充分 溶解后保存。 台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒:碧云天生物技术研究所产品 、主要器材: 切片机:上海徕卡仪器有限公司,型号: 烘箱:上海福玛实验设备有限公司,型号:. 微波炉:产品,型号:. 倒置荧光显微镜:产品,型号: 正置荧光显微镜:产品 手术器械眼科剪、镊子等:上海医疗器械厂 细胞培养皿: 公司产品 细胞培养瓶: 公司产品 孔、孔及孔细胞培养板: 公司产品 一次性塑料吸管:上海志立生物有限公司 产品 移液器及相应:、、等, 连续分液器:.~,产品 及离心管: 公司产品 细胞筛:美国公司产品 .无菌滤器:美国公司产品 .无酶管:产品 及注射器:美国公司 无菌纱布:上海医疗器械厂 一次性换药碗:上海医疗器械厂 台式水平离心机:基因有限公司产品 超净台: 公司产品 恒温细胞培养箱: 产品 倒置显微镜:产品第二军医大学博士学位论文 数字显示恒温水浴箱:上海跃进医疗器械厂 血细胞计数板:浙江求精医用仪器厂产品 公司产品 流式细胞仪: 低温冷冻离心机:公司产品, 涡旋混合器:.,上海青浦沪西仪器厂 孔平底黑色酶标板: 公司产品 酶标仪: ,公司产品 洗板机: ,公司产品 ,公司产品 荧光分光光度计: 多功能酶标仪:~ ,公司产品 方法: 甲苯胺蓝染色: 组织切片常规脱蜡至蒸馏水,在新鲜配制的甲苯胺蓝工作液中染. 分钟,用蒸 馏水洗次,%酒精急速分化后无水乙醇脱水,二甲苯透明中性树胶 固封。 免疫荧光: 石蜡切片置于?烘箱中烘片,脱蜡至水,用冲洗三次,每次 切片置于缓冲液中微波修复,中火至沸后断电,间隔低火至沸。 。 自然冷却后洗次,每次 切片放入%过氧化氢溶液,室温下孵育 ,以阻断内源性过氧化物 酶。 洗次,每次 ,甩干后%封闭 封闭电荷。 去除液,每张切片加入 稀释的一抗见实验试剂覆盖组织,? 过夜。 。 洗三次,每次 去除液,每张切片加.相应种属的荧光二抗见实验试剂,避 光室温下孵育.。 避光洗次,每次。 。 去除液。每张切片加. 避光染胞核 洗次,每次。晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受 体途径的研究 切片稍干后用抗荧光淬灭封片剂封片,。避光保存待拍照。 、的分离、培养: 周龄的雄性/小鼠处死,%医用酒精消毒,分离小鼠股骨及胫腓骨, 浸泡于冷的中。在超净台内,用注射器抽取不含胎牛血清的培养基, 反复冲洗小鼠骨髓腔。收集冲得的骨髓细胞,过细胞筛,筛去骨碎片,, ,离心。用培养基重悬细胞,计数,调整细胞密度为..×/, 种于细胞培养皿中。每个培养皿中加入含.巯基乙醇、/的., %胎牛血清和双抗的 培养基,置于。孵箱培养。每天换一次 液每次更换/~/新鲜培养基,每次换液弃去贴壁细胞。培养周后开始在培养 基内添加/,观察细胞形态及生长情况。培养周后收集细胞,进行 鉴定。 、的鉴定: 甲苯胺蓝染色检查细胞纯度: 取甲苯胺蓝母液溶于 %溶液中,调节至.左右,制备成 .%工作液。收集经.和诱导分化.周的小鼠骨髓细胞,,, 离心重悬后细胞涂片。将风干的细胞涂片在%多聚甲醛中固定分钟,然 后把涂片浸入.%甲苯胺蓝工作液染色分钟,%乙醇快速分色,洗遍 后正置显微镜下观察染色情况。 流式细胞仪鉴定表型: 收集经.和诱导分化周的小鼠骨髓细胞,?,, 离心,用 ,离心洗遍后用流式重悬。细胞计数板计数, 调节细胞密度约为/。取悬液分别加入标记的抗小鼠单克隆 抗体和标记的抗小鼠 单克隆抗体,?避光孵育。,, 离心,弃去液体,将细胞用流式洗涤次,每管重悬细胞后上 机检测细胞表型。 、.的制备: 参照文献报道】,取健康成人血清超速离心分离得到,用蛋白定第 二军医大学博士学位论文 量试剂盒检测蛋白浓度。充分透析后,用含和蔗糖的高糖反应液 与在 。下共同孵育天,以不含糖的反应液同样孵育.作为对照。 天后用无菌 充分透析,荧光检测糖化程度。超净台内经.无菌 滤器过滤,加入保存液,分装后.?长期保存备用。 、.对脱颗粒功能的影响: .对释放组胺功能的影响: 成熟的用含%血清的培养基同步化后,收集细胞,。, ,离心,用洗涤两次,将培养基尽量洗干净。重 悬细胞,细胞计数板计数后于?预稳分钟。 ?按、./、/、/、/浓度分别加到. 管中,用调节体积为。//作为阳性对照,不含糖 反应液孵育的./作为阴性对照。 经预稳好的按 /密度在每个激发管内各加入 细胞悬液,?分别孵育.、、、、、分钟。以不 含细胞及刺激因素的作为空白对照。 干预时间到后,加入冷的 终止反应。。,,离心后 取上清。 余下的细胞用 重悬后超声裂解,,,离心后取上 注 同 将所得上清加到含 三蒸水的孔平底黑色酶标板中,混匀,加入 . ,充分混匀后即刻加入 %工作液,室温下避光孵育 分钟,每孔加入 . 终止作用。用多功能酶标仪读取荧光 。 值吸收波长,发射波长 按组胺释放率%细胞上清液组胺含量/细胞上清液组胺含量细胞 裂解液组 胺含量×%计算不同浓度及不同时间点.刺激后肥大细胞组 胺释放量。 相同实验重复至少次,每个样品测定次,取其平均值。 .对释放.己糖鹄癣功能的影响: 成熟的用含%血清的培养基同步化后,收集细胞,。, ,离心,用洗涤两次,将培养基尽量洗干净。重晚期糖基化终产物 修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径的研究 悬细胞,细胞计数板计数后?预稳分钟。 按、/、?/、//浓度分 别加到.管中,用调节体积为。/作为阳性对照,. 作为阴性对照。 经预稳好的按×/密度在每个激发管内各加入 细胞悬液,孵育分钟。以不含细胞及刺激因素的 作为空白对照。 干预时间到后,加入冷的 终止反应,,,离心后 取上清。 .% 余下的细胞加入 ,室温下放置,,, 离心后取上清。以不含细胞的.% 作为空白对照。 将所得上清加入含有 的孔酶标板中,孵育,加入 . /终止反应,酶标仪处测吸光值。 按.己糖胺酶释放率%细胞上清一己糖胺酶含量/细胞上清一己糖胺酶含 量细胞裂解液.己糖胺酶含量× %计算.刺激后. 己糖胺酶释放量。 相同实验方案重复至少次,每个样品测定次,取其平均值。 、台盼蓝染色: 成熟的分别用和/浓度的.干预,收集细胞, .离心分钟,弃上清,重悬。吸取细胞悬液到.管内,加入 台盼蓝染色液×,轻轻混匀,染色分钟染色分钟时间已经足够,也可以更长 一些,但不宜超过分钟。吸取少量经过染色的细胞,用血细胞计数板计数。每个 细胞样品至少数个细胞,数出蓝色细胞和细胞总数。按细胞存活率细胞总数 .蓝色细胞数/细胞总数×%计算细胞存活率。 相同实验方案重复至少次,每个样品测定次,取其平均值。 、统计分析: 所有实验数据均用?表示,两个样本均数比较采用检验,多个样本均数比 较采用方差分析。以.为有统计学意义。第二军医大学博士学位 论文 结果: 人颈动脉斑块染色: 光镜下观察肥大细胞在斑块中分布很不均匀,主要集中在斑块肩区、纤维帽和动 脉外膜内,图.。荧光显微镜观察到同甲苯胺蓝染色同样的结果,同时发现在斑 块新生血管周围也有较多肥大细胞呈红色聚集图.;同时斑块肩部、外膜、 斑块新生血管及脂核内也发现绿色沉积图. :激光共聚焦显示,部 分肥大细胞和在斑块内分布~致,紧密接触图. ,提示和肥大细 胞在斑块内可能相互作用。 、的分离、培养和鉴定: 在体外用和刺激小鼠骨髓细胞能够诱导其分化成为成熟的肥大 细胞。小鼠骨髓来源细胞培养天后可见大部分为形态不规则的类圆形悬浮细胞,大 小不均,少部分开始出现贴壁图. 。随着培养时间延长,贴壁细胞逐渐减少至 消失,悬浮细胞逐渐增多,形态渐均一化。培养周后,贴壁细胞基本消失,细胞呈 圆形,大小一致,折光性均匀,悬浮生长图. 。.和诱导培养 周后经甲苯胺蓝染色可见%以上的细胞被染为蓝紫色,胞核致密,胞浆内充满粗大 的紫红色异染颗粒图.。流式细胞仪鉴定显示,培养周后,表面 标记和双阳性表达率为%以上图.。 、.对脱颗粒功能的影响: .对释放组胺功能的影响: 未经干预的可自发释放一定基础量的组胺%,经不同浓度的 .、、、/干预分钟后,除外./浓度组,其余各 .浓度组与对照组相比,组胺释放率均明显升高.。干预浓度为 /时组胺释放率最高。提高.浓度至 /后,组胺释放率未见进 一步升高。/组与对照组相比则无明显促组胺释放作用. 图。提示.呈浓度依赖性的激活肥大细胞释放组胺。用/ 刺激,于不同时间段.、、、、、分钟检测组 胺释放率,发现.随时间推移提高肥大细胞组胺释放率,且其作用迅速,晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径的研究 分钟时组胺释放己见升高,分钟时即达到峰值,再延长作用时间直至小时,组 胺释放量未见进一步增加,与分钟组相比无统计学差异.;./ 组随干预时间延长对肥大细胞组胺释放无影响图.、.;提示.可呈 时间依赖地促进肥大细胞组胺释放,作用分钟时已可使组胺释放率达 到峰值。 .对释放.己糖胺酶功能的影响: 未经干预的可自发释放一定基础量的一己糖胺酶%,经/ 干预分钟后,与对照组相比,己糖胺酶释放量增加.。. /组与对照组相比则无明显促一己糖胺酶释放作用.图。 提示.可激活肥大细胞释放己糖胺酶。 .对存活的影响: 小时后,台盼蓝染细胞计算细胞存活 用、/?干预 率,两组细胞存活率均在%以上。与对照组相比,.对存活率 影响无统计学差异.图。提示对肥大细胞组胺及己糖胺 酶释放量的增加不是因其细胞毒性致使细胞死亡导致的。第二军医大学博士学位论文 蔷 图人颈动脉斑块甲苯胺蓝染色箭头所示肥大细胞, 图人颈动脉斑块免疫荧光染色× :标记,示肥大细胞呈红色:抗标记呈绿色:和抗 染色双阳性呈黄色,示肥大细胞在局部与共表达?? 晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径的研究 :::::::::. ?????????????????????????????????????????????一 图一 培养左×,右× 培养,细胞形态不规则,大小不均,少量细胞开始贴壁 :培养,细胞呈圆形,大小一致,折光性均匀,悬浮生长 ?, 擘 蠢? 多 ?豁 制 黼 .四 雪 图. 甲苯胺蓝染色左×, 右× 一一晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径 的研究 一永一可。一?.口~七日上图 / .干预不同时间对组胺释放的影响 一一.永一。啊日口一?母? 。 图 . / 干预不同时间对组胺释放的影响木. .组 组,群. 一一第二军医大学博士学位论文 摹 ‘ 日 晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径的研究 讨论: 斑块破裂继发血栓形成是引起急性冠脉综合征的主要原因。大量定植于血管周 围及血管外膜的肥大细胞在诱发斑块突然破裂中扮演重要角色。尸检和病理检查显示, 肥大细胞在动脉粥样硬化斑块破裂部位尤其是斑块肩部大量聚集,且大多被激活脱颗 粒【 引。研究亦证实在动脉粥样硬化损伤的不同阶段均有肥大细胞参与的证据】。 而肥大细胞缺失小鼠或肥大细胞膜稳定剂色甘酸二钠等阻断肥 大细胞脱颗粒的药物 均可有效阻止斑块进展并减少斑块破裂】。鉴于肥大细胞在斑块破裂导致急性心血 管事件中的重要作用,针对肥大细胞脱颗粒和释放活性介质进行干预,正成为未来治 疗动脉粥样硬化、稳定斑块的重要策略。 .是机体内在长期高糖环境下经非酶糖基化修饰生成的不可逆产 物。糖尿病患者体内.水平较正常人明显升高,且.水平与罹患动 脉粥样硬化和冠心病的风险正相关【,?。.可在斑块内沉积,长期存在于 体内可损伤细胞摄取能力,诱导细胞凋亡,介导血管细胞粘附分子.表达, 降低的转运和血管活性物质的合成,调节巨噬细胞受体表达,损伤血管反 应性等,促进的形成和发展【?,是糖尿病血管病变的重要原因。目前国内外有 关.对动脉粥样硬化有关的研究主要集中在对血管内皮细胞、平滑肌细胞和 巨噬细胞上】,而其对肥大细胞作用如何尚未见报道。等人的研究显示 能够在体外激活大鼠腹腔来源的肥大细胞,内即可促使肥大细胞释放组 胺。尽管未见相关报道,我们仍有理由相信具有促炎效应的?可能会通过激 活肥大细胞脱颗粒来影响糖尿病动脉粥样硬化进程并促使糖尿病动脉粥样硬化斑块 失稳定。 该部分实验中,我们首先在人颈动脉斑块标本中观察到分布不均匀的肥大细胞, 主要集中在斑块肩区、动脉外膜内和斑块内新生血管周;同时斑块肩部、外膜、斑块 新生血管及脂核内也发现沉积部分图片未在文中显示;这与等人的 研究结果一致。另外, 和荧光抗体双标染色发现,部分肥大细胞和 在斑块内分布一致,紧密接触,提示和肥大细胞在斑块内很可能相互作用。另 外还有大量肥大细胞与分布虽未完全重合,但毗邻显示,考虑可能是与肥大细 胞并存于斑块易破损区的巨噬细胞内沉积的。因目前尚未有商品化的. 荧光抗体,故而只能暂用荧光抗体代替观察。而且目前收到的标本例数尚不足 以进行统计分析,仅能起一定提示作用,后期仍需补充样本量。 肥大细胞来源于骨髓造血干细胞,不成熟的肥大细胞前体离开骨髓后存 在于外周循环中,可向有如、.、.、.、.、等合适的生长因子第二军医大学博士学位论文 的组织迁移,发育成熟后定植于机体各组织部位,发挥其功能效应【‘。体外分离骨 髓细胞并诱导其分化为成熟的肥大细胞对肥大细胞功能研究具有重要意义。.和 在肥大细胞的生存和发育过程中起着不可或缺的作用。 年,等人 首次提出肥大细胞来源于骨髓前体细胞。随后和等【均报道了体 外利用生长因子诱导骨髓细胞分化为成熟的肥大细胞。此后的多项研究均表明小鼠骨 髓细胞在.和联合诱导下能够分化为肥大细胞 肥大细胞胞质内含有肝素和组胺等物质的强嗜碱性颗粒,能够被甲苯胺蓝染为蓝 紫色。 和是肥大细胞主要的表面标记,介导肥大细胞过敏反应及细胞 的生长发育【。不成熟的肥大细胞前体表达 ,而不表达。因此通过 甲苯胺蓝染色和流式细胞仪检测肥大细胞表面分子和表达,可以对肥 大细胞成熟与否进行鉴型?。 我们由小鼠长骨内分离出骨髓细胞,经体外.和诱导分化,初 期大部分细胞形态不规则,类圆形,大小不均,少部分开始出现贴壁,随培养时间延 长,贴壁细胞逐渐减少至消失,悬浮细胞逐渐增多,形态渐均一化。培养周后,贴 壁细胞基本消失,细胞呈圆形,大小一致,折光性均匀,悬浮生长。甲苯胺蓝染色可 见%以上细胞被染为蓝紫色。流式检测显示细胞表面标记和双阳性 表达率%以上,证实为成熟的肥大细胞。 肥大细胞功能的发挥主要通过其活化及脱颗粒来实现,其活化及脱颗粒产物包括 组胺、肝素、多种蛋白酶、各种细胞因子和趋化因子等多种介质。肥大细胞被激 活后释放的活性产物可诱发血管痉挛【】,降解基质削弱纤维帽【吲、促进内皮细胞凋 亡【、诱导血管新生增加斑块内出血【】以及调节巨噬细胞胆固醇逆转运等【,从而 影响进程。 组胺是自体活性物质之一,组织中的组胺以无活性状态存在于嗜碱性粒细胞和肥 大细胞的颗粒中。当机体受到外界理化因素刺激时引起这些细胞 脱颗粒,导致组胺释 放,产生生物效应。血浆中组胺水平可反映这两种细胞的激活状态及数目。肥大细胞 作为组胺的重要来源,在外界刺激下通过释放组胺参与介导调节体内多种病理生理反 应。对发生动脉粥样硬化的血管,组胺具有强效的缩血管效应,可以使粥样硬化病变 冠脉部分明显收缩,而正常冠脉则无明显改变【。变异性心绞痛患者的冠状动脉在痉 挛前也有短暂的组胺水平升蒯?。此外,组胺还可与上相应受体结合,促进 细胞增殖【。碱性环境下组胺能够与缩合反应生成荧光物质】,故而可通过 检测荧光值的方法在体外评价刺激因素作用下肥大细胞组胺释放水平。.己糖 胺酶储存于肥大细胞的分泌颗粒中,肥大细胞被激活后与组胺一起释放到胞外,因此 被视为肥大细胞脱颗粒的标志性分子。.己糖胺酶可以和柠檬酸盐溶液生成晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径的研究 生色基团,酶标仪读取吸光值评价肥大细胞体外刺激因素下释放.己糖胺酶水平。 我们发现.能够呈浓度依赖地在短时间内促进释放组胺及. 己糖胺酶,且并非由其细胞毒性所致。糖尿病患者体内糖基化的血清约为 ,而我们发现. ./ /即可引起肥大细胞脱颗粒,在/ 时达到最大值,提示我们体外实验所摸出的浓度与体内生理情况大致相符合。另外, 我们得到的时间趋势也和其它如/、物质、等诱导肥大细胞脱颗粒的时间 相近【?。等人嘲的研究发现,.可以通过在秒内使大鼠腹 腔肥大细胞组胺释放达到峰值,这可能与两种细胞来源不同,且两者作用发生的机制 不同有关。 本研究第一部分我们发现.可能在斑块内和肥大细胞相互作用,影响糖 尿病进程;在体外成功建立了小鼠骨髓来源肥大细胞的培养体系,诱导成熟的肥 大细胞,为后续实验和临床应用奠定了基础;首次了.可以在体外促使 小鼠骨髓来源的肥大细胞脱颗粒,该作用可能是糖尿病患者易发动脉粥样硬化及急性 心血管事件的病因之一。第二军医大学博士学位论文 第二部分 在诱导脱颗粒中的作用 我们第一部分的研究表明,.能够促进释放组胺和.己糖胺 酶,但进一步的机制尚不明确。样受体. ,是一类识别 病原相关分子模式的模式识别受体,在识别内、外源性的配体后通过激活.途 径诱导炎症因子、细胞间黏附分子以及单核细胞趋化因子等的表达【。大量流行病学、 临床病理学和动物模型的研究均提示,在的发生、发展中起着重大作用。 敲除的小鼠高脂喂养后与对照组相比,动脉粥样硬化病变显著减轻】。此外, 人和鼠斑块当中的内皮细胞、肥大细胞和巨噬细胞上表达均显著升高【。 等【】的研究首次报道了.通过介导血管内皮细胞和巨噬细 胞分泌促炎因子;而等【】亦证明小鼠骨髓来源的肥大细胞能够 表达,且可通过其激活肥大细胞释放炎性介质。由此我们猜想. 对的脱颗粒作用是否可能由介导,在本部分实验中我们就此设想进 行探讨。 材料与方法 材料: 、实验动物: .周龄雄性/小鼠购自第二军医大学动物实验中心。?周龄雄性小 鼠及相应一小鼠由第二军医大学医学免疫学研究所馈赠。 、主要试剂: 胎牛血清:,公司产品 细胞培养液:改良型.培养基,使用时加入胎牛血清使其终 浓度为%。 双抗青霉素/,链霉素/:公司 .:产品晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途 径的研究 :产品 .巯基乙醇:公司产品 公司产品 流式虢: 标记的抗小鼠单克隆抗体:产品 ×: , ., ,溶于蒸馏水 ., 中,调节值至.,定容至,高温高压灭菌后?保存。使用时,用灭菌 蒸馏水稀释为×溶液。 :,大连宝生物 三氯甲烷:兴达化工试剂厂 :公司 异丙醇:上海振兴化工厂 无水乙醇:上海振兴化工厂 常规分析用琼脂糖:美国公司产品 核酸染料:美国公司产品试剂盒:,大连宝生物 :,大连宝生物 . ’俐试剂盒:,大连宝生物 . :,大连宝生物 :天根生化科技北京有限公司 :上海双螺旋生物技术有限公司 ? 试剂盒:,大连宝生物 鼬:,大连宝生物 蛋白定量试剂盒:美国公司产品 兔抗鼠多克隆抗体: 公司产品 抗.兔多克隆抗体:北京康为世纪生物科技有限公司产品? 美国公司 . 预染蛋白:公司产品 化学发光液:公司产品 .蛋白上样缓冲液×:北京康为世纪生物科技有限公司 蛋白酶及磷酸酶抑制剂:公司产品 刚蛋白提取液及:购自上海申能博彩生物技术有限公司 抗体稀释液:天恩泽生物技术有限公司产品 :上海生工生物技术公司 一?第二军医大学博士学位论文 :上海生工生物技术公司 :上海博光生物技术公司 %/丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺::上海生工生物技术公司 相关试剂: . ,溶于双蒸水中, .缓冲液.,.:称取 调节值至.,双蒸水定容至,保存备用。 .,溶于双蒸水中, .缓冲液.,.:称取 调节值至.,双蒸水定容至, 保存备用。 ×:称取 , .,溶于双蒸水中,调节值至 .,双蒸水定容至。 :量取 ,加入超纯水稀释为×,再加入 。 ×电泳缓冲液:称取 ,甘氨酸, 溶于双蒸水, 使用时用蒸馏水稀释为×。 转膜液:称取,甘氨酸,溶于双蒸馏水中,使用时 用蒸馏水稀释为×,并加入%甲醇溶液。 封闭液:%溶于。 :购自公司,使用时用甲醇配制成%工作液,避光保存不能超过 两个星期。 :. ,. ,. ,. ,. ,. ,. ,溶于双蒸水中,调节值至 .左右,定容至,高温高压灭菌后保存备用。 甲醇:上海振兴化工一厂柠檬酸盐缓冲液 .:柠檬酸 ,? :国药集团化学试剂有限公司 :购自公司。.至柠檬酸盐缓冲液中,充分 溶解后 保存。 、主要器材: 手术器械眼科剪、镊子等:上海医疗器械厂 细胞培养皿: 公司产品 细胞培养瓶: 公司产品 公司产品 孔、孔及孔细胞培养板: ..晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径的 研究 一次性塑料吸管:上海志立生物有限公司 产品 移液器及相应:、、等, 连续分液器:.~,产品 及离心管: 公司产品 细胞筛:公司产品 .无菌滤器:公司产品 .无酶管:产品 及注射器:美国公司 无菌纱布:上海医疗器械厂 一次性换药碗:上海医疗器械厂 台式水平离心机:基因有限公司产品 公司产品 超净台: 恒温细胞培养箱: 产品 倒置显微镜:产品 数字显示恒温水浴箱:上海跃进医疗器械厂 血细胞计数板:浙江求精医用仪器厂产品 公司产品 流式细胞仪: 低温冷冻离心机:公司产品, 涡旋混合器:,上海青浦沪西仪器厂 管:产品 孔板:公司产品 水平电泳槽:美国.公司 电泳仪:,上海天能科技有限公司 仪:,公司 . 仪:美国公司 ,公司产品 荧光分光光度计: 膜:公司产品 垂直电泳槽:,上海天能科技有限公司 转膜槽:,上海天能科技有限公司 脱色摇床:江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司 凝胶成像分析系统:美国?公司产品 孔平底黑色酶标板: 公司产品 酶标仪: ,公司产品第二军医大学博士学位论文 洗板机: ,公司产品 ,公司产品 多功能酶标仪:? 方法: 、的分离、培养及鉴定: 同第一部分。 、.的制备: 同第一部分。 、.对中表达的影响: 成熟的用含%血清的培养基同步化后,收集细胞,。, /种于 ,离心,细胞计数板计数,调整细胞密度为. 孔板中,每孔加培养基。用、/的.干预细胞,. /作为对照,?分别孵育、、、、、后 收集细胞,离心,弃去上清,用洗次后,加入 吹打混匀细胞,.?保存留待抽提。 成熟的用含%血清的培养基同步化后,收集细胞,?, /种于 ,离心,细胞计数板计数,调整细胞密度为. 孔板中,每孔加培养基。用、/的.干预细胞,. /作为对照,?分别孵育、、、、、后 收集细胞,离心,弃去上清,洗次后,用流式 重悬。取悬液加入标记的抗小鼠单克隆抗体,?避光孵育 。。,,离心,弃去液体,将细胞用流式腩洗涤次, 每管重悬细胞后上机检测细胞表达。 成熟的用含%血清的培养基同步化后,收集细胞,。, ,离心,细胞计数板计数,调整细胞密度为.×/种于 孔板中,每孔加培养基。分别用、/的.干预细胞, 观察细胞表达情况。 ./作为对照, 相同实验方案重复至少次,每个样品测定次,取其平均值。晚期糖 基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径的研究 、.对脱颗粒功能的影响: 成熟的斗和卅用含%胎牛血清的培养基同步化 后,收集细胞,。,,离心后弃上清,重悬。用、/的 ?分别干预士和/细胞,./作为阴性对照,/ /作为阳性对照,。孵育,分别检测其组胺及.己糖胺酶释放量。具 体检测步骤同第一部分。 相同实验方案重复至少次,每个样品测定次,取其平均值。 : 、蛋白抽提及 蛋白抽提步骤: ,离心收集,弃上清; 冷的重悬细胞,。,,离心洗细胞次,洗净残存的培养基; 配制含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液:每 中加入 动? 和蛋白酶及磷酸酶抑制剂×,摇匀置于冰上; 加入预冷的蛋白裂解液:个细胞约加入...蛋白裂解液; 冰上静置裂解细胞,为使细胞充分裂解静置过程中要经常摇动混 匀。 ? 于预冷的离心机内,离心分钟,弃去沉淀,上清即刻转入新的 管中.。或.。保存备用。 蛋白浓度测定: 配制液:按照蛋白定量试剂盒说明书,分别配制/、 /、/,/ /,/,/,/、 /的溶液。 试剂盒液和液按:比例混合,配制工作液. 分别吸取标准品到孔板的对应孔中。 稀释待测样品至总体积为,加到孔板相应孔中。 每孔分别加入工作液,振板秒以彻底混匀。 盖好微孔板,?孵育分钟。 酶标仪波长处测值,作出标准曲线,根据标准曲线求出公式,计算 每个 样本蛋白浓度。第二军医大学博士学位论文聚丙酰胺凝胶电泳.: 玻璃板洗净、晾干,对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上 准备灌胶。 制备分离胶. % 凝胶浓度 . %/丙烯酰胺:双丙烯酰胺 . . % . 混合,灌胶前加入和 % . 总体积 灌胶时,用移液器吸取配置好的胶沿玻璃板缓缓注入,至凝胶高 度 为左右,预留.高度配制浓缩胶,然后胶上加水液封。加水速 度不可太快,以免胶被冲变形。室温放置..小时至胶聚合完全。 见水 和胶之间出现一条明显折线时,说明胶己凝结。待胶充分凝固后, 倒去 上层水,用吸水纸吸干。 . 配制浓缩胶 % 凝胶浓度 %/丙烯酰胺:双丙烯酰胺 . . % . 混合,灌胶前加入和 籼 总体积 将剩余空间灌满浓缩胶,小心水平插入梳子。灌胶时要使胶沿玻璃板流 下,避免胶中产生气泡。浓缩胶凝固过程中要经常在两边补胶,以防胶 凝固过程中体积收缩,使加样孔上样体积减小。浓缩胶聚合约需..小 时,小心拔出梳子,用水冲洗一下,将其放入电泳槽中。 蛋白上样:晚期糖基化终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径的研究 提取好的蛋白,约.左右按:的比例与×上样缓冲液混合, 加到管中,在沸水中煮使蛋白完全变性。将准备好的样品和 预染的蛋白质分子量分别上样,加进第一个孔中。 电泳:使用电泳装置,电压,也可用.,电泳至溴酚蓝 刚跑出凝胶底部即可中止电泳,然后进行转膜。 转膜: 制备足量×转膜缓冲液,以充满转膜槽;小心从玻璃板上剥下凝胶,去 除浓缩胶,同时在胶的右上角做个记号;将凝胶在转膜缓冲液中浸泡约 .分钟,滤纸在转膜缓冲液中浸泡至少秒;将膜在甲醇中湿润 秒,使膜由不透明变成半透明,放入双蒸水中浸泡分钟,再小心将膜 放入转膜缓冲液中平衡至少分钟,开始转膜。 将夹子打开使黑色一面保持水平,在上面垫一张海绵垫,垫上垫三层滤纸, 仔细用玻棒来回擀几遍以擀走气泡。按照海绵垫.滤纸.胶.膜.滤纸.海绵垫 的顺序放好,合起夹子,放入转膜槽中。将转膜装置置于冰中,恒 流条件下,转移时间为时可根据待测蛋白分子量大小适当调整转膜 时间,分子量大,转膜时间适当延长。转完后在膜上作个记号,以判断 正反面。 封闭:将膜用暇湿,移至含有封闭液的平皿中,在脱色摇床上摇动 封闭,或?封闭过夜。 一抗孵育:从封闭液中取出膜置于自封袋中,加入用一抗稀释液按说明书 推荐稀释比稀释好的一抗,封口后脱色摇床摇动孵育小时。室温下 脱色摇床上洗次,每次分钟。 二抗孵育:将洗好的的膜置于自封袋中,加入按说明书推荐稀释比稀释好 的辣根过氧化物酶标记的二抗,脱色摇床上摇动孵育小时。用在脱 色摇床上洗涤次,每次分钟。 显影:发光液、两种试剂按:比例混合。膜正面朝上平铺,吸干 洗涤液,加入混好的发光液,在.凝胶成像仪上显影成像。 、抽提、的反转录及:所有步骤均在冰上操作。 经裂解后的细胞解冻后每 加入预冷的三氯甲烷, 混匀后静置分钟。离心机提前开机预冷,,。,离心分钟。 小心吸取上层水相约.至新的.管中,加入等体积预冷的异丙醇,第二军医大学博士学位论文 混匀后室温静置分钟使其充分沉淀。,,离心分钟,管壁 上可见微量絮状沉淀。小心弃去上清,用无酶水配制的%乙醇,。 离心分钟。弃上清,用滤纸小心吸净残余液体,室温干燥.分钟,用 无核酶水重悬。取悬液在上检测浓度及纯度, 剩余进行反转录或.长期保存备用。 试剂 反转录为:参照 ? 说明,在冰上配制反应液,将得到的玎反应液加入到下一 步的反应体系中。 涮 使腿 撇 × ×触酬盯溉船融恤 ? 圳姒 戆融嘏的 呻 。 搴髓体系可按需糊敲大, 髓黼髓大朗 蘸 反转录条件为:?分钟反转录反应 ?秒反转录酶失活反应 ? :参照说明书,按下列 . 组分在冰上配制反应液。仪上进行反应。 反应液爱蠢 :皈应豢停/ 反应结束后,按以下方法配胶进行琼脂糖凝胶电泳:晚期糖基化 终产物修饰的激活肥大细胞脱颗粒的受体途径的研究 按~%的琼脂糖浓度据样品分子量不同而定配胶,置于 微波炉内加热至琼脂糖完全溶解。温度降至大约?时,加入染料, 立即倒入靠近一端梳子的电泳槽。待凝胶完全凝固后,小心拔去 梳子,倒入 ,少许超出胶面,使缓冲液进入凝胶孔。用微量移液器将样品 及依次加入加样孔内。盖上电泳槽并通电,~恒压电泳。当 指示剂泳动到距凝胶前沿约厘米的位置时,停止电泳,.凝胶成像 仪上成像。 反应:参照 ? 试剂盒说明按下 列组分在冰上配制反应液,加至孔板相应孔内, 仪上反应。 试剡 使用量 终滚度 :移 . × 酽 . 刚甜《 .? 。 . 《洲 .脚 阱 ’ . 灭麓蒸馏承。 棚 .反应条件:预变性:,秒 反应:,秒 ,秒 ,秒 融解阶段:,秒 ,秒 ,秒 引物序列:以下引物均由上海捷瑞生物技术有限公司合成。 ’ :’ ’ :’ ’ :’