基于液质联用技术的孟鲁司特钠咀嚼片的生物等效性研究

基于液质联用技术的孟鲁司特钠咀嚼片的生物等效性研究 基于液质联用技术的孟鲁司特钠咀嚼片的生物等效性 研究 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师 或指导小组 的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则，承担相应的法律责任。 ,’?,j、 。’ 一虢珏彳新酶j仍姥龟学姆峨。一。 l 年。月:尹日 ’: ‘一，‘ ? ’ ，’ (? 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人己发表或撰写的研究 成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究一:麟午 导，哗:弘嘲 月 日 支。1『年 目 录 中文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„1 英文摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((3 研究论文基于液质联用技术的孟鲁司特钠咀嚼片的生物等效性研究 前 言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??6 日U舌„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„。 材料与方 法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??6 结 果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??9 附 图„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??13 附 表„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„22 讨 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??33 结 论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??35 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„一35 综述孟鲁司特钠咀嚼片的临床研究进展„„„„„„„„„„„„„38 致 谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„??47 个人简 历„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„????48 中文摘要 基于液质联用技术的孟鲁司特钠咀嚼片的生物等效性研究 摘 要 目的:研究孟鲁司特钠咀嚼片 北京万生药业有限责任公司 在健康 受试者体内的药代动力学及生物利用度;并与市售孟鲁司特钠咀嚼片 杭 州默沙东制药有限公司 比较，评价其生物等效性。 :本试验按两制剂两周期的交叉试验设计口服单剂量10mg的孟 鲁司特钠咀嚼片。将20名健康志愿者随机分为两组，一组口服受试制剂， 另一组口服参比制剂，两周之后交叉服药。受试者在试验前一日晚8时开 始禁食，次日早晨7时开始空腹服药，用200mL温开水送服，2h内禁止 饮水，分别在4h后，8h后统一进标准餐一次。每一位受试者在服药前取 1、14、24h 空白血样，于服药后O(5、l、1(5、2、2(5、3、4、5、7、9、1 各个时刻采集血样。 MS 本试验采用LC(MS,MS法测定血浆中孟鲁司特的浓度。以Xterra mm C18 50x2(1mm，3(5“m 色谱柱为分析柱，以PhenomenexC18 4×3(0 mL, min， 为保护住，流动相为乙腈:水:甲酸 86:14:0(3，v,v,v 。流速:O(3 V， 进样量为20止，柱温20?。质谱条件是电喷雾离子源，源电压为4500 7L,min，辅助气为40L,min;正离子多离子反应模式监测，用于定量分析 586(3,422(5 孟鲁司特 ，m,z441(4,325(2 内 标， 的离子对分别为m,z V和35V;驻留时间都为lOOms。沉淀蛋 辛伐他汀 ，碰撞电压分别为34 白法处理血浆样品。本实验的方法学确证内容为方法专属性、线性和定 量下限、精密度和准确度、样品稳定性、提取回收率和基质效应等方面。 根据受试者不同时间的血药浓度数据求出其均值及标准差。使用 DAS软件拟合计算参比制剂和受试制剂的药代动力学参数及评价两个生 产厂家的两制剂是否具有生物等效性。 结果:孟鲁司特钠的线性范围为1(O(1 000(Ong,mL，相关系数大于 O(997，最低定量浓度为1(0ng,mL。 1- 0(9974 n(7 ;在试验中分别对低、 个血浆样品中孟鲁司特的浓度进行测定，日内RSD茎5(2,、日间RSDSlO(1 中文摘要 RSD 10(1,，RE I(3,;低、中、高三个浓度下孟鲁司特血浆样品的提 取回收率分别为110(5,，96(7,和102(2,，内标辛伐他汀的提取回收率 预处理后放置24h、3次冻融循环及冻存30日后均较稳定，RSD均冬5(4,。 受试制剂和参比制剂的孟鲁司特达峰时间 Tm戤 分别为2(00+0(78、 衰期 tl,2ke 分别为5(3 3516(04(2302(3、 AUCo啪分别为 3517(14-2313(2ng,mL??h; 制剂和参比制剂无显著性差异，双向单侧t检验结果表明受试制剂Cm蚁的 90,可信限落在参Lt',N齐U70(O,(143(O,之间，受试制剂AUC的90, 可信 制剂孟鲁司特钠咀嚼片的相对生物利用度为 99(4+18(3 ,。 结论:北京万生药业有限责任公司研制生产的孟鲁司特钠咀嚼片与市 售的孟鲁司特钠咀嚼片具有生物等效性。 关键词:孟鲁司特钠咀嚼片;液质联用;药代动力学;生物等效性 2 m of ofmontelukastsodiuandits Theevaluation bioequivalence LC―MS,MS studyby technologies pharmacokinetics ABSTRACT LC―MS,MSmethod a method quantitativeusing Objective:Todevelop andits ordeterminationofmontelukastinhuman plasma sodiumchewabletablet the ofmontelukast bioequivalence study(Tocompare and whichmadein companyBeijing HangzhouMoshadongpharmaceutical WANSHENG inhuman body( pharmaceuticalcompany Methods:This to take experiment weredividedintotwo cross―over maddevolunteersrandom study(20healthy of ects thefirsttest taking groups，onegroupsubj taking preparation，after thefirstreference reference of ects subj taking preparation，anothergroup 20 the ects ectsfastedfrom formulations(Subj subj taking preparation，after until70’clockinanother volunteerswithan stomach o’clock day(The empty with water( andreference andserved 200mL took agents preparation 2haftermedicationof and8hunifiedmeal water，4h Quantitative drinking takeblank before sample takingorally comsumption，respectively(Toplasma andtake at after 0(5，1，1(5，2，2(5，3，4(5，7，9，11， 14，24h plasmasamples andallwere14( takingorally Theconcentrationofmontelukastinhuman wasdetermined by plasma MS withthe LC(MS,MS(Xterra C18 50x2(1mm，3(59m wasemployed ofacetonitrile:water:formic mobile acid 86:14:0(3， V,v,v phasecomposed as ataflowrateof0(3mL,min(APhenomenex C18 4x3(Omm wasperformed and at20。C( a column(Thesolutionwas with injected209Lanalyzed protected Mass ion at45 voltage00V,spraytemperature spectrometry:ESIsource，spray at 400。C，NEB gas:25L,min，collisiongas:7L ,min，AUX gas:30L,min，CUR and detection reaction monitoringscanningpositive gas:40L,min;Multiple for and were montelukast ion-pairs performed(Thepositive were m,z586(3,422(5 DP:34V and 英文摘要 dwelltime:lOOms(Protein totreat methodwasused precipitating plasma limitof samples。The andmatrix effectwere quantitation，samplestability,extractionrecovery validated( to ectsatdifferenttimeof concentrationdatato Accordingsubj plasma deriveitsmeanandstandard main deviation，the pharrnacokineticparameters ofmontelukast andreference werecalculated includingagents preparation by DAS2(0 and the ofmontelukastwhich respectivelyevaluatingbioequivalence tWO producedby companies( Results:111ecalibrationcurveswaslinearoverthe investigated concentration withcorrelationcoefficientthan range:1(O一1000(Ong,mL higher O(997(ne was andthe was LLOQ 1(0ng,mL regressionequation werenot RSD morethan y 0(00666x+0(00063，r 0(9974 n 7 (Theinter―day werenotmore 1 RE RSD than werenotmore 5(1,，the 0(O,，and intra-day than1(3,(Theextractionin and were low，middle recovery highQc samples 11 1 ofISwas1 0(5,，96(7,and 02(2,，respectively(Therecovery 00(8,， RSDwas werelaidwithoutwith4hatroom 4(0, n 9 (Samples light atroom with three 24h，after temperature，afterpre-treatmenttemperature offreeze-thawandfreezedwithin30 a cycles days 一80。C hadgoodstability andtheRS(Dwerenotmorethan5(4,( Themain of andreference pharmacokinetic parametersagents of montelukastsodiumchewabletabletscalculatedfrom preparation single oral as dose were study 3土 0(76 h， 17(1士23 4(93+1(28 h，AUC0，24hwere 3404(7士2248(5 and 3513(2 ng,mL??h， AUC0(。。were 35 and aremo monparametric Wilcoxon test，theagentsreference‘preparation markable the conversion difference，Cm觚，AUCo(24h，AUCo哟bylogarithmic after of andreference areno variance，the analysis subject preparation markabledifference(Theresultsoftwoone―sidettestshowed ects that:subj 90,confidenceintervalforthereference ofthe C preparations preparation 4 ――――,――――――――――――――――――――――― ―――――――――――――――――――――――――――――――――― ―――――――――――――――――――――――――――――――――― ―――――――――一 英文摘要 of 70,一1 ects AUC90, correspondingparameters 43,，subjpreparations confidenceintervalforthe reference ofthe preparation to80,一1 relative whichwas out parameters25,，the bioavailabilityfigured by ofmontelukast AUC0(24h was 99(4士18(3 ,( sodium chewabletablet Conclusion:Subjectspreparation:montelukast in WANSHENG manufacture Beijing pharma_ceutical reference sodium chewable in product:montelukast tablet made Hangzhou in volunteers( ，(Moshadong pharmaceuticalcompany arebioequivalent healthy words:Montelukastsodiumchewable Key Pharmacokinetic;bioequivalence 研究论文 基于液质联用技术的孟鲁司特钠咀嚼片的生物等效性研究 (‘‘(-^- 舌 刖 sodium 属于过敏介质阻释药，是一种选择性 孟鲁司特钠 montelukast 白三烯受体拮抗剂。生物化学和药理学的生物测定显示，本品对CysLT。 CysLTl受体结合所产生的生理效应而无任何受体激动活性【3。5】，显著改善 哮喘炎症指标。临床上多用于治疗哮喘、过敏性鼻炎、咳嗽变异性哮喘和 毛细支气管炎等症【6。11。 目前，孟鲁司特钠浓度的测定方法多见于用高效液相色谱法[12-13】，此 外还有对孟鲁司特钠耐受性和生物等效性的药代动力学研究[14-16]。本试 验 根据国家食品药品监督管理局的临床试验研究批件 批件号: 利用度和生物等效性试验指导原则”及国家食品药品监督管理局的相关指 导原则，建立了高效液相色谱(串联质谱法测定血浆中孟鲁司特的分析方 法，对20名健康受试者单剂量口服北京万生药业有限责任公司研制的孟 鲁司特钠咀嚼片药代动力学和相对生物利用度进行研究，并评价其生物等 效性。 材料与方法 1仪器 API4000 元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱 日本Shimadzu公司 。 勃尔离心机有限公司 ，KQ一100A型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公 司’ 。ZH(2型混合器 天津药典标准仪器厂 。 2药品与试剂 研究论文 试验药品送检合格，由北京万生药业有限责任公司提供。 参比制剂 R :孟鲁司特钠咀嚼片， 商品名顺尔宁 ;规格:5mg, 108。 片;批号:08017;杭州默沙东制药有限公司，失效期20091 标准对照品:孟鲁司特钠对照品，北京万生药业有限责任公司提供。 内标为辛伐他汀，批号:100601(200502，中国药品生物制品检定所。 市售色谱纯，水为实验室自制重蒸水。 3实验设计 3(1样品分析方法 3(1(1LC―MS,MS分析方法( MS 色谱条件:色谱柱:Xterra 保护柱:C18，4×3(0 酸 86:14:0(3，v,v,v 。流速:O(3 mL,min，进样量20pL，柱温20?。 质谱条件:离子源:电喷雾离子源 ESI源 ;喷雾电压4500V;雾 化气温度400?;雾化气流速30L,min;帘气25L,min;碰撞气7L,min; 辅助气40L,min;检测的方式:正离子多离子反应模式监测，用于定量分 析的离子对分别为rn,z586(3,m,z422(5 孟鲁司特 ，m,z441(4,325(2 内 V和35V;驻留时间都是100ms。 标，辛伐他汀 ，碰撞电压分别为34 孟鲁司特和内标的一级和二级全扫描质谱图见图1。 3(1(2标准溶液的配制 孟鲁司特标准溶液的配制:精密称取孟鲁司特钠标准品26(1mg 相当 于孟鲁司特25mg ，置25mL容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，为孟鲁 容量瓶中，定容至刻度，作为对照品贮备液 2 ，取贮备液 2 1(0mL， 置10mL容量瓶中，并用空白血浆稀释到刻度，作为孟鲁司特贮备液 3， 1000(0 ng,n也 ，将贮备液 3 依次分别用空白血浆稀释得相应浓度为 300(0、100(0、30(0、10(0、3(00、1(00ng,mL工作溶液。 内标标准溶液的配制:精密称取辛伐他汀对照品25(0 mg，置25mL容 量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，得辛伐他汀贮备液。精密吸取辛伐他汀 研究论文 储备液O(03mL，置lOOmL容量瓶中，用乙腈稀释并定容制成浓度为 300(Ong,mL工作液。 3(1(3血浆样品处理 1 S，离心 1000转, 汀的乙腈溶液 ，1001(tL,乙腈，200此甲醇，涡旋30 分 5 S，离心取上清， 乙腈:水:甲酸 86:14:O(3，v,v,V ，涡旋混合30 进样20此进行LC(MS,MS分析。 3(2临床试验 3(2(1健康受试者的选择 身高为174+5cm。试验前进行体检及尿、血常规，心、肾、肝功能，血糖 等项检查，结果均正常 见表1 。志愿者在受试前两周和试验期间没有 服用任何药物，均无烟酒嗜好。 3(2(2知情同意与医学监护 本试验严格遵守赫尔辛基宣言的人体医学研究的伦理准则。试验开始 前，研究者向受试者提供试验药物的相关资料并详细说明所进行试验的目 的、方法和意义，可能会出现的不良反应、受试者与研究者权益等项内容， 受试者经过充分考虑后对可能会发生的不良反应表示理解并书面签署知 情同意书，并经河北医科大学第二医院医学伦理委员会批准进行试验。 在医生和护士的共同监护下，该试验在I期临床试验专门病房开展， 在研究人员的安排下，受试者进行整个实验过程。I期临床试验病房都准 备有急救需要的药品和抢救需要的设备。 3(2(3给药方法及剂量 20名健康受试者随机分成两组，,组先服受试制剂，一周后服参比 制剂;另一组先服参比制剂，一周后服受试制剂。根据孟鲁司特钠制剂的 临床常用剂量，确定此次试验的给药剂量为lOmg。受试者在试验前一日 晚8点开始禁食，次日早晨7点空腹服用药物，受试制剂和参比制剂均用 200mL温开水送服，2h内禁止饮水，分别在4h后、8h后进标准餐一次。 试验期间保持适当的活动，不允许长时间卧床休息，不要剧烈运动。 研究论文 3(2(4血样采集与处理 分别在受试者服药前取空白血样，于服药后O(5、1、‘1(5、2、2(5、 3、 冰箱待测。 结 果 1方法学验证 1(1选择性 在一级扫描质谱中，孟鲁司特和内标辛伐他汀分别生成准分子离子峰 生成的主要碎片离子为m,z422(5和rn,z325(2。结果见图1。 取空白人血浆100止，除不加内标溶液外 以乙腈代替 ，按“3(1(3’’ 项下方法操作，进样量20 pL，得色谱图 见图2A ;将孟鲁司特钠标准 项下方法操作，得色谱图 见图2B ;取健康志愿受试者用药3h后的血 浆样品]oorm，同上法操作，得色谱图 见图2C 。以上色谱图表明在本 次实验的色谱条件下，空白血浆中的内源性物质不影响孟鲁司特的测定， 通过与空白血样添加标准溶液 孟鲁司特、辛伐他汀 的色谱图相比，确 证孟鲁司特和内标的保留时间均约为1(0min。 在分析过程中对基质效应进行了考察，结果基质效应不显著，不影响 孟鲁司特和内标的测定。 1(2标准曲线、线性范围和定量下限 浆溶液，按“3(1(3”项下方法操作处理后进行测定。以孟鲁司特与内标峰 峰面积比 y 对孟鲁司特浓度 x 作加权回归 1,C2 ，孟鲁司特在上 述血浆浓度范围内线性关系良好，R2大于0(997。本法的线性范围是1(O, 定血浆中孟鲁司特的典型标准曲线图见图3。 研究论文 依“3(1(2’’项下操作制备标准曲线的最低浓度模拟血样6份，按“3(1(3” 为4(4,，RSD为5(8,。结果见表2。 1(3精密度与准确度 血浆样品制备6份，连续3天测定3个分析批，共54个样品，测定方法 的准确度、批间精密度和批内精密度。按“3(1(3”项下处理测定，测得孟鲁 司特峰与内标峰峰面积比，并使用当日批次的标准曲线计算孟鲁司特浓 度，其准确度和精密度见表3。本法测定3个浓度血浆样品中孟鲁司特的 日内精密度RSD 5(1,、日间精密度RSD 10(0,，RESl(3,。 1(4提取回收率 备6份，按“3(1(3’’项下处理测定，测得孟鲁司特峰面积S血样，取对照品 同浓度溶液进样209L测定，测得孟鲁司特的峰面积S对照晶。用峰面积比 值计算血浆中孟鲁司特的提取回收率 孟鲁司特回收率 S血样,S对照品 血浆样品的提取回收率分别为110(5,，96(7,和102(2,。内标的提取 回 收率为100(8,，RSD为4(O, n 9 。 ( 1(5稳定性 分别取浓度为3(00、800(0ng,mL的生物模拟样品，考察上述样品在 避光条件下室温放置4h后及样品预处理后放置24h、3次冻融循环后及在 (80?冻存30日的稳定性。结果表明，孟鲁司特血浆样品在上述四项条件 下均较稳定存在 见表5(1,表5―4 。 1(6质量控制和实际样品测定 实际生物样品按“3(1(3’’项下处理测定，建立随行标准曲线，并分别配 制高、中、低三个浓度的质控样品，并与待测实际样品同时测定，在质控 样品测定结果的偏差小于15,时，该批样品测定结果才能认为有效并进行 药代动力学等方面的计算。 2药代动力学结果和生物利用度比较 2(1血浆药物浓度和药时曲线 研究论文 20名健康受试者口服单剂量10mg受试制剂和参比制剂后，不同时间 血药浓度数据见表6、7，平均血药浓度(时间曲线见图4。20名健康受试 者的个体血药浓度(时间曲线见图5。 2(2药代动力学参数计算 将孟鲁司特血药浓度数据用DAS2(0程序软件计算，得到药代动力学 相关参数，权重系数为l。将受试者的药时数据逐个作曲线拟合，用求得 的个体参数计算平均值。Tm甜Cm戤取实测值，采用梯形法计算药时曲线 的AUC值 。20名受试者口服单剂量受试制剂和参比制剂的药代动力学 参数计算结果分别见表8、9。从表8、9中可以看出受试制剂和参比制剂 3404(74-2248(5、 5(314-1(16、4(934-1(28h; AUCo(24h分别为 3516(04-2302(3、 ; 分 别 为 AUCo曲 3517(1+2313(2ng,mL??h 362 1(8+2366(2ng,mL??h。 2(3相对生物利用度 由每位受试者交叉服用受试制剂和参比制剂的血药浓度间曲线下面 积 AUC0-24h 计算出每位受试者孟鲁司特的相生物利用度。结果表明受 试制剂孟鲁司特咀嚼片的相对生物利用度为 99(44-18(3 ,。 一 2(4生物等效性分析 通过DAS2(0统计软件将各制剂所得的主要药代动力学参数，Cm戕及 AUC值做对数转换后进行方差分析，以及双、单侧t检验、90,置信区间 检验，用非参数法分析Tm觚，评价两种制剂的生物等效性。受试制剂和参 比制剂的统计分析结果分别见表10、11、12。 从表10、11可知，孟鲁司特AUC[In]值多因素方差分析的结果显示， 只有个体间存在显著性差异 P O(05 ，周期间及制剂间均无显著性差异 P O(05 。经双单侧f检验和90,置信区间检验，拒绝不等效假设，受 参比制剂的生物利用度为99(44-18(3,，与参比制剂比较差异在4-20, 以内。 研究论文 孟鲁司特Cm觚[1n]值多因素方差分析结果表明，仅个体间有显著性差 检验和90,置信区间检验，拒绝不等效假设，受试制剂的Cm戤[1n]值90, 置信区间为95(4,,131(3,。按照生物等效性判断标准，受试制剂AUC 的90,置信区间落在标准参比制剂的80(O,,124(8,之间，Cm戤落在 69(8,--"143,之间即可认为等效，故判定两制剂具有生物等效性。 Tm麟用非参数法分析，受试制剂与参比制剂无显著性差异 P O(05 ， 故认为受试制剂的达峰时间与参比制剂的达峰时间没有显著性差异。 3不良反应观察 试验过程中研究人员同时对试验用药物可能出现的不良反应进行了 观察，试验结束后对志愿者作体检复查，体检结果参见表13。在整个试 验过程中受试者均表现出了良好的耐受性，均未有任何药物不良反应发 牛。 研究论文 附 图 ‘坩 3肼 3埘 降 言 2肼 ‘13(3 凄 2M 588(6 437』 1 M 4325 1(Oe7_ 415(3 J l。:。。!五 j(。(i(。。。-lL((;山((!。:;。(。l。。j。。。。IL!;。，。(:!f止;;。I。上h!‘((。(，:。。。-。(。J上l;“。j，。i。(山 5??m嵋j!:u，!』。;:二Iij !型丝婴 L―――――――――――――――――――――_: from to2(848mln Sample1 TuneSamplelD of :El+MS2 686(30 CE 15 :2(797 MT20090219105200――(―w――――t―ff―――。 ‘ 。。(。(。(。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。‘。。。‘。‘。。。。。。。。。。。。。。。。’’。。’’。。。‘。‘。。。。。。’。。‘。。‘。。‘。‘。。M。。。。a。’1k。。’‘。6‘。(。7’1。e。。15。’。。 c’。。p’―s―I 422(4 6(Se5， II 6(0e5ij m,z586(3一 j 4‘懈j :墨 弯3埘jI一 1 !星2(6e5j 『( j z“5 ，??蹦 m(3 1(0e5。( j ，叩 s埘 姗(。”1 42S2 :( 660 800 伽 700 300 350 400 450 5? i―――――(―，―，――(――――――――，―――――――――i―(――，―――，――，―+―，―(――，―，―二，―j――(―――(――，―(―((――，――――。―， -――――――――――――――一:100 1加 200 250 一―――――――――――――――(―――――――――――――(―――――――――――――――――――――――――!!!!!!!!――――――――(―――――――(――――――――――――(――――――――――――――――――――――――――J 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