[doc] 逆灸“关元”穴对大鼠更年期血浆、子宫一氧化氮合酶的影响

[doc] 逆灸“关元”穴对大鼠更年期血浆、子宫一氧化氮合酶的影响 逆灸“关元”穴对大鼠更年期血浆、子宫一氧 化氮合酶的影响 针刺研究2006年12月第31卷第6期?351? 逆灸”关元”穴对大鼠更年期血浆, 子宫一氧化氮合酶的影响 解秸萍李晓泓张露芬翟景慧张惠李蔚贾君君农艳陈旭 (北京中医药大学针灸学院,北京100029) 【摘要】目的:通过生物化学途径观察逆灸对大鼠更年期机体的影响.方法:选用SD雌性大鼠80只,其 中4月龄1O只,为年轻正常组;10月龄70只,根据阴道细胞涂片按动情周期随机分为7组,每组10只.这 7组分别为逆灸12月龄组,逆灸14月龄组,逆灸16月龄组,12月龄对照组,14月龄对照组,16月龄对照组 及10月龄对照组.逆灸组在10月龄时预以艾炷灸”关元”穴,每次1壮,每周2次,共灸8周.分别于12, 14,16月龄时与同月龄对照组及年轻正常组,10月龄对照组一起取血浆,子宫,以硝酸还原酶法一氧化 氮合酶(NOS)活性.结果:?大鼠更年期血浆NoS活性的变化及逆灸”关元”穴对其影响:对照各组与年轻 正常组比较,14月龄组NOs活性明显下降,P<0.01;逆灸各组与年 轻正常组比较无显着性差异,P>0.05; 逆灸14月龄组比同月龄对照组N0S活性增加,P<0.05.?大鼠更年期子宫NOS的变化及逆灸”关元”穴 对其影响:对照各组与年轻正常组比较,14,16月龄组NOs活性明显降低,有非常显着性差异,P<0.01;逆 灸各组与年轻正常组比较,14,16月龄组Nos活性降低,有显着性差异,P<0.05;逆灸16月龄组比16月 龄对照组NOS明显升高,P<0.05.结论:逆灸能升高更年期大鼠血浆及子宫中NoS活性,其早期类似于 预处理效应,中后期表现为明显的调节效应,类似预适应的延迟效应,体现了逆灸”关元”穴的保健作用. 【关键词】逆灸更年期一氧化氮合酶(NOS) 【中图分类号】R245.81【文献标识码】A【文章编号】1000—0607(2006)O6—0351—04 PreventativeMoxibustionof”Guanyuan”(CV4)onNOSActivityintheBloo dandUterusTissue OfMenopausalRats XIEJie-ping,LIXiao—hong,ZHANGLu—fen,ZHAIJing—hui,ZHANGHui,LIWei,JIAJun— jan,NONGYan,CHENXu(CollegeofAcu—Moxibustion,BeijingUniversi tyofChineseMedicine,Be— jingj00029) [ABSTRACT]0bjective:Toresearchtheeffectofpreventativemoxibustion(PM)of”Guanyuan,’(CV4)onnitricoxide synthase(NOS)activityintheplasmaanduterustissueinmenopausalrats.Methods:Atotalof70femaleSDrats(aged10 months)wererandomizedinto10-months(mo)control(con),12一 mo-con,14-mo-conand16一mo-con,12一mo-PM,14-mo-PMand 16-mo-PMgroupswith10ratsineachgroup.Inaddition,other10femaleSDratsaged4mowereusedasyoung-congroup. In ratsof3PMgroups,moxibustion(onemoxa-cone/time)wasappliedto”Guan yuan”(CV4)twiceaweek.8weeksaltogether. Attheendofexperimentsalltheratsweredecapitatedforcollectingbloodsamplesanduterustissues. NOSactivitiesinplasma andthehomogenizeduterustissuesupernateweredetectedwithnitratereductasemethod.Results:Incomparisonwithyoung~- congroup,NOSactivitiesofbothplasmaanduterustissuein14-mo-congroup,andthoseofuterusin16-mo-congroup.14-mo-PM and16-mo-PMgroupsdecreasedsignificantly(P<O.05,0.01).Comparisonbetween14-mo-conand14一mo-PMgroupsandbe— tween16-mo-conand16一 mo-PMgroupsindicatedthatplasmaNOSactivityof14-mo-PMgroupanduter usNOSactivityof16-mE)- PMgroupweresignificantlyhigherthanthoseoftheformergroups,suggestin gthatpreventivemoxibustioncouldinhibitthedecline ofNOSlevelsinbloodanduterustissue.Conclusion:Preventivemoxibustion ofCV4caneffectivelyrelievethedeclineofplas— maand/oruterusNOSlevelsinmenopausalrats. [KEYWORDS]PreventativemoxibustionMenopausePIasmaanduterusNOS 项目来源:国家自然科学基金资助项目(No.90209026) 第-作者简介:解秸萍(1961一),女,N~Ig~,副教授,主要从事腧穴特异 性研究.E-mail:xiejieping@sina.com ?352?AcupunctureResearch.December2006,Vo1.31,No.6 “逆灸”即用灸法保健防病,是针灸”治未病”的 重要.明?高武在《针灸聚英》里说:”无病而先 针灸日逆,逆,未至而迎之也.”艾灸关元穴是古今针 灸养生保健,延年益寿的传统方法.因此,本实验从 预防的角度,在雌性大鼠更年期前期予以逆灸”关 元”穴,观察其对随后更年期机体影响的作用途径. 一 氧化氮合酶(NOS)可催化L一精氨酸和氧分 子作用生成NO和L一瓜氨酸,NO是一种有活性的 亲脂性气体,低浓度NO可作为一种信息分子,弥散 进入细胞后,激活可溶性鸟苷酸环化酶(SGC),产生 环磷酸鸟苷(cGMP),发挥作用:如作为一种内皮源 性松弛因子(EDRF),对心脑血管,血流进行调节; 作为一种信号分子进行信息传递;NO在神经系统 广泛存在,作为一种新型的非经典的神经递质和信 使物质影响许多神经活动__1],如学习,记忆,镇痛 等;另外,No作为一种活泼的自由基,可诱发自由 基反应,同时又能清除自由基,在调控衰老过程中具 有双重作用;NO还能清除细胞内病原体,阻止病毒 复制,抑菌,抗肿瘤,在免疫细胞中发挥信息传递作 用;近年发现?4卵巢,子宫内膜等生殖器官也存在 NoS,并发现No在子宫内膜功能活动及性功能的 调节中发挥重要作用.研究表明],更年期心脑 血管病,骨质疏松症等与No水平的下降相关.鉴 于NO如此广泛,重要的作用,其在介导逆灸关元穴 对更年期机体功能包括生殖器官机能的调节及预防 保健,延年益寿等方面发挥怎样的作用?本实验主 要通过观察逆灸”关元”穴对大鼠血浆,子宫NoS 的影响,对其效应规律进行了研究.(由于No的半 衰期很短,仅5,6S,直接检测尚存在技术上的困 难,因此目前多采用检测Nos的间接方法来测定 组织细胞中的No含量,推测No的作用.) l与方法 1.1动物 选用已临近更年期的10月龄SD雌性大鼠,体 重(300?20)g;年轻4月龄SD雌性大鼠,体重 (250?20)g.均为清洁级,购自北京维通利华实验 动物技术有限公司. 1.2仪器设备与试剂 731分光光度计,上海第三仪器厂.电热 恒温水浴箱,北京医疗设备厂.ZK380型低温离心 机(德国).三洋超低温冰箱(日本).ER一182A型 电子天平(日本).新艺牌DY89—1型电子玻璃匀浆 机,宁波新芝生物科技股份有限公司. NOS药盒购自南京建成生物工程研究所. EDTA,抑肽酶,北京东亚生物制品厂. 1.3实验分组 4月龄雌性大鼠10只,为年轻正常组;10月龄 雌性大鼠7O只,根据阴道细胞涂片按动情周期随机 分7组,每组10只.更年期大鼠中3个逆灸组,分 别为逆灸12月龄组,逆灸14月龄组,逆灸16月龄 组;3个模型对照组,分别为12月龄对照组,14月龄 对照组,16月龄对照组;另一组为10月龄对照组. 1.4更年期模型制备 自然老化鼠. 1.5艾柱及取穴 艾炷大小:底托直径1.2cm,底托厚度 0.4cm,底托中间有3mm的孔,艾炷直径0.7cm, 高度1cm,重量约2g.吴江市云龙医疗器械有限 公司研制. 穴位:”关元”两后肢根部连线的中点,参照大鼠 穴位图谱定位. 1.6各组的处理方法 所有逆灸组大鼠均在1O月龄时开始艾炷灸. 灸前将穴区直径1.5,2cm的鼠毛剪干净,暴露穴 区皮肤,将艾炷点燃后,直接放置在穴位上,灸至艾 炷烧完,每次灸1壮.灸后局部皮肤略红,但不发 泡.每周灸2次,共灸8周. 另3个同期模型对照组于逆灸组治疗时同样抓 取,但不灸治,持续8周.年轻正常组与10月龄对 照组不做任何处理.实验期间所有动物在同等条件 下饲养. 1.7取材与样品处理 各组大鼠于取材日期快速断头取血2mL,注 入预先加有EDTA50L,抑肽酶40L的试管 中,混匀,迅速低温离心(3500r/min,15min),分 离血浆,一70?保存待测. 子宫匀浆方法:冰上迅速摘取子宫,在生理盐水 中煮沸5min称重,置于玻璃匀浆管中,加入1N HC11mL,于冰上在匀浆机中进行匀浆,充分匀浆 后室温放置100min,加入1NNaOH0.8mL中 和至pH值7.离心(3500r/min,15min),取上 清,一70?保存待测. 1.8指标检测方法 以硝酸还原酶法检测N0S活性,按说明书操作. 1.9数据处理和统计学分析 应用SPSS11.0统计软件包进行统计学处理. 数据以平均值士标准差(士s)表示,组间差异采用 针刺研究2006年12月第31卷第6期?353? 单因素方差分析,两同期月龄组用独立样本t检验. 以P%0.05作为显着性差异的标准. 2结果 2.1大鼠更年期血浆NOS的变化及逆灸”关元” 穴对其的影响 对照各组与年轻正常组比较,14月龄组NOS 活性明显下降,有非常显着性差异(P%0.01),10, 12,16月龄与年轻正常组间均无显着性差异, P>o.05;逆灸各组与年轻正常组间无显着性差异, P>O.05.对照组间比较,14月龄比12月龄降低, P<O.01;16月龄比14月龄升高,P<O.01;16月 龄与12月龄之间无明显差异.逆灸组间比较,16 月龄比12月龄,14月龄均明显升高,P%0.01;14 月龄与12月龄组无显着性差异.逆灸组与1O月龄 组比,12,14月龄均下降,P<O.05;16月龄与10月 龄组间无显着性差异.逆灸各组与同月龄对照组比 较有先降后升趋势,即逆灸12月龄组比12月龄对 照组略下降,而逆灸14,16月龄组比14,16月龄对 照组又上升,其中,逆灸14月龄组增加有显着性差 异,P<0.05.见表1. 2.2大鼠更年期子宫NOS的变化及逆灸”关元” 穴对其的影响 对照各组与年轻正常组比较,14,16月龄NOS 活性较年轻正常组明显降低,有非常显着性差异, P%0.01;逆灸各组与年轻正常组比较,14,16月龄 组降低有显着性差异,分别为P%0.01,P%0.05. 对照组间比较,14月龄,16月龄比12月龄均明显降 低,P%0.05;16月龄与14月龄无显着性差异.逆 灸组间比较,14月龄比12月龄下降,P%0.05;16 月龄与12月龄组间无显着性差异;16月龄比14月 龄明显升高,P%0.05.逆灸组与1O月龄组比较, 14,16月龄组NoS活性下降,P%0.05;12月龄与 1O月龄对照组间无显着性差异.逆灸各组与同月 龄对照组比较有先降后升趋势,即逆灸12月龄组比 12月龄对照组略下降,而逆灸14,16月龄比14,16 月龄对照组又上升,其中,逆灸16月龄组与16月龄 对照组比较有显着性差异,P<0.05.见表1. 表1大鼠更年期血浆,子宫NOS的变化及逆灸”关元”穴对其的影响(?S) 与年轻正常组比:*P%0.05,**P%0.01;与12月龄对照组比:?P%0.05,??P%0.01 与14月龄对照组比:??P%0.01;与12月龄逆灸组比:?P%0.05,??P%0.01; 与14月龄逆灸组比:?P%0.05,??P%0.01;与1O月龄组比:#P%0.05, ##P%0.01;与同月龄对照组比:?P%0,05. 3讨论 3.1逆灸”关元”穴对大鼠更年期血浆NOS的影 响及意义 NO是一氧化氮合酶(NOS)在氧气存在下催化 精氨酸分解生成,因此NOS是NO合成过程中的 限速酶和关键酶.NOS在机体许多组织的许多类 型细胞中存在,血管内皮细胞,血小板,脑细胞,肾上 皮细胞,巨噬细胞,中性粒细胞,肝细胞内等均有其 分布,其催化的NO信号分子的作用相当广泛.近 年研究证明,更年期及衰老时,外周血及脑等组织中 NOS或NO含量减少,活性降低.认为更年期时, 妇女患心脑血管病的比例明显增加与血管内皮产生 N0的下降有关_1. 本实验研究显示,大鼠更年期的某一阶段(14 月龄)NOS活性有明显的下降,随后机体经过调整, ?354?AcupunctureResearch,December2006,Vo1.31,No.6 16月龄又恢复正常.这和临床是相符合的,即更年 期综合征反应主要在更年期的一个阶段,经过机体 调整可逐渐恢复.而逆灸14月龄组比14月龄对照 组NOS活性有显着增加,说明逆灸可以有效逆转 大鼠在14月龄时血浆NOS活性的下降,并进一步 提高16月龄时NOS的活性,这对于预防更年期心 脑血管病和诸脏器缺血,缺氧等损害具有重要意义. 3.2逆灸”关元”穴对大鼠更年期子宫NOS的影 响及意义 研究表明,生殖系统血管内皮细胞及平滑肌细 胞能够产生NO,并通过NO-cGMP通路引起血管 舒张],调节卵泡的发育,排卵,卵母细胞减数分裂 的成熟等,同时也参与胚胎着床,维持妊娠,调节分 娩以及调控人类月经周期等].在正常周期子宫内 膜中也存在NOS,通过NO-cGMP通路参与女性性 反应的生理机制.伴随老龄化和绝经期的到来, 大多数妇女会经历不同程度的性功能变化,与此相 关的生殖器感觉和血流改变,至少部分与NOS水 平变化相关引.本研究发现,随月龄增加,对照各 组大鼠更年期子宫的NOS活性与年轻正常组比较 逐渐减少,尤其是14,16月龄下降明显.结合本实 验观察大鼠更年期子宫的衰变情况(另文发表),认 为子宫NOS活性的降低可能参与了更年期子宫等 生殖器官的老化,与前人的研究结果一致,这与 NOS催化NO减少,导致子宫局部血流障碍,组织 缺血,缺氧,自由基清除功能降低等有关.逆灸”关 元”穴后,逆灸16月龄组比16月龄对照组子宫 NOS活性明显增加,说明逆灸”关元”穴可通过增加 子宫NOS的活性,改善子宫局部血流,增加组织供 血,供氧,增加自由基清除作用,防止更年期子宫的 衰变,这种作用主要体现为明显的后效应(16月 龄).但逆灸14,16月龄组与年轻正常组及10月龄 对照组比较子宫NOS活性仍降低,说明逆灸虽然 能在一定程度上改善子宫NOS的活性,但不能完 全逆转子宫NOS活性的降低使之恢复正常,这和 机体的衰老过程不可完全逆转有关. 3.3逆灸对大鼠更年期血浆,子宫NOS的影响效 应与预处理相似 本实验显示,逆灸后逆灸12月龄大鼠血浆,子 宫NOS的活性比12月龄对照组均有轻度下降的 趋势,而后14月龄血浆,16月龄子宫NoS活性又 较对照组升高,并有显着性差异,展现的是一种先降 后升的曲线,而且最初的下降比较轻微.说明逆灸 效应的开始本身就是一种温和的预处理,或者说是 预处理的触发因素,而且这种预处理对机体不会造 成损伤,其后效应在14或16月龄,类似预适应的延 迟效应.近年研究发现,NO是迟发心肌缺血预 适应(IP)的触发和中介物质之一,本实验结果说明, NO确实参与了机体预适应的延迟效应机制,但在 逆灸的后效应或者说预适应的延迟效应中,灸刺激 是真正的预适应触发因素,NO是预适应的一个中 介物质. 综上所述,逆灸”关元”穴可预防大鼠更年期血 浆,子宫NOS活性的异常降低,提示逆灸”关元”穴 的保健效应,且逆灸对于血浆与子宫NOS活性的 影响均有明显的后效应.但比较而言,对血浆NOS 的改善比子宫要快,其原因有待进一步研究. 参考文献 1崔晓军,李伊为,陈东风,等.电针对局灶性脑缺血大鼠脑组织 NO及NOS的影响.上海针灸杂志,2003,22(3):25 2孙贤奎,梅俊.一氧化氮合成酶阳性神经元在大鼠脑干的分布 及其衰老变化.解剖学杂志,1998,21(4):308 3李秋明,王荣华,付宜鸣.衰老时大鼠大脑皮质枕叶一氧化氮合酶 阳性神经元的变化.神经解剖学杂志,2002,18(1):24 4常红,杨增明.一氧化氮合酶与雌性生殖.生殖与避孕,2001,21 (3):131 5黄睿,朱桂金.一氧化氮合酶在人子宫内膜和蜕膜的表达.同济 医科大学,2001,30(2):151 6张华,冯新送,庄洪.一氧化氮与绝经后骨质疏松症关系的临 床研究.中医正骨,2004,16(10):7 7常宁,富玲,原银栋,等.去势成年雌性大鼠骨质疏松模型血 清NO和NOS的水平及其意义.中国骨质疏松杂志,2003,i0 (2):135 8叶刚,杨皓庄,张穗梅.雌,孕激素对去势雌大鼠血清NO,心肌 NOS活性的影响.医学临床研究,2002,19(3):200 9林文注,王佩.实验针灸学.上海:上海科学技术出版社,1994. 288 lO杨丁友,段学忠.龟鹿二仙胶加味治疗绝经后妇女不稳定型心绞 痛的临床研究.安徽中医学院,2000,19(4):2O 11MinK,O’ConnellL,MunarrizR,eta1.Experimentalmodels fortheinvestigationoffemalesexualfunctionanddysfunction. 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