免疫学专业优秀论文 重组四阶a群链球菌疫苗的基因克隆、表达纯化和免疫原性的初步研究

免疫学专业优秀 重组四阶a群链球菌疫苗的基因克隆、表达纯化和免疫原性的初步研究 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 免疫学专业优秀论文 重组四阶A群链球菌疫苗的基因克隆、表达纯 化和免疫原性的初步研究 关键词:重组四价 A群链球菌疫苗 原核表达 免疫原性 基因克隆 抗原特异性 免疫性疾病 摘要:M蛋白是A群链球菌细胞壁中的最重要的蛋白质抗原，根据其抗原特异性的血清分型有150种以上。抗M蛋白抗体为保护性抗体，于链球菌感染后数周至数月内产生，一般可存在1—2年，有的甚至长达10—30年，特异性的抗M蛋白抗体可抵抗同血清型A群链球菌的再感染，但与其它血清型之间无交叉保护。同时，M蛋白与人体心肌和骨骼肌的原肌球蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白和角蛋白等组织蛋白存在共同抗原表位，因而，部分血清型的A群链球菌感染可引起风湿热、风湿性心脏病等自身免疫性疾病。因此，天然M蛋白提取物或M蛋白全分子不能作为A群链球菌疫苗的保护性抗原。 近年来的研究发现，M蛋白是以两条完全相同的α—螺旋结构的多肽链构成的同源二聚体存在于细菌表面，空间结构为线性分子。每一个多肽链从氨基端到羧基端由A、B、C三个重复片段组成，A区为高度变异区，诱导机体产生型特异性保护抗体的抗原决定簇位于该区。B区的变异性比A区低，C区为保守区。M蛋白与人体组织蛋白有交叉反应的抗原表位主要位于B区、B—C区的侧翼、A—B区的侧翼.而在A区和C区中存在着一些与人体组织蛋白无交叉反应同时又可诱导机体产生调理抗体的保护性表位。因此，以M蛋白A区为基础针对A群链球菌不同血清型的型特异性疫苗既避开了人体产生交叉反应的区域，又可使机体产生保护性抗体，是A群链球菌疫苗研制的一个可行的。 第一部分:从美国疾病预防和控制中心(CDC)数据库获得A群链球菌M1、3、6、18四个血清型M蛋白N端型特异性氨基酸序列，根据文献报道并结合生物信息学的方法筛选每一个血清型特异性序列中与人体组织蛋白无同源性的区段，用这些筛选出的氨基酸序列设计出一个重组蛋白，该重组蛋白按M1—3—6—18型的顺序将氨基酸序列串连拼接，在串联序列的C末端加上了一个大多数血清型GAS所共有的与人体组织蛋白无交叉表位的14个氨基酸的保守序列J14。对设计蛋白与人体组织蛋白进行BlastP比对，亲水性，二级结构分析，空间结构分析以及B细胞表位预测。软件分析结果表明，设计蛋白与人体组织蛋白无同源性，亲水性好，与天然M蛋白空间结构相似，四个血清型的氨基酸序列拼接之后原有抗原表位未被改变。采用DNAWORK2.0在线软件设计了一组寡核苷酸引物，采用Overlap PCR方法合成该重组蛋白的编码核苷酸序列。将该序列克隆到pUC18克隆载体上构建克隆质粒pUC18—strep4，并测序。测序结果证实，合成的基因序列与设计序列完全一致，为设计重组蛋白的原核表达奠定了基础。 第二部分:构建表达重组目的蛋白的原核表达载体。以克隆载体PUC18—Strep4为模板通过PCR扩增获得目的基因，回收纯化目的DNA片段，BamH?和Hind?双酶切后，插入原核表达载体PQE30中，并将其转化入大肠杆菌M15中，通过氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选阳性克隆，酶切和测序鉴定。鉴定结果表明，成功构建原核表达载体PQE30—strep4。重组菌 M15/PQE30—strep4经IPTG诱导表达，表达产物经SDS—PAGE分析表明，重组蛋白分子量为24KD?，与预期分子量23.8KD一致，为可溶性表达。采用Nj2+—NTA亲和层析纯化重组蛋白，纯度达90%以上，每升LB培养基获得了9.46mg重组蛋 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 白。 第三部分:对重组蛋白的免疫原性进行初步研究。 以重组蛋白500μg/只的剂量混合等体积的弗氏完全佐剂皮下多点注射，免疫家兔三只。4周和8周后以相同剂量混合不完全弗氏佐剂加强免疫两次，免疫前采集一次血清样品，初次免疫4周后，每两周采集一次血清样品，至12周放血处死。ELISA法检测免疫后血清中抗重组目的蛋白抗体滴度的动态变化;菌体间接免疫荧光法(IFA)检测免疫血清中型特异性M蛋白抗体;体外杀菌实验检测型特异性抗体是否为杀菌抗体。结果表明，家兔经重组蛋白免疫后，产生了高滴度的抗重组蛋白抗体，菌体间接免疫荧光和体外杀菌实验的结果表明，家兔经重组蛋白免疫后产生了针对M1、M3、M6型A群链球菌M蛋白的型特异性杀菌抗体，但实验同时发现，三只免疫家兔的免疫前血清中已存在M18型A群链球菌的特异性抗体并具有杀菌活性，因而不能确定重组蛋白免疫后是否产生了针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性的杀菌抗体。 通过重组蛋白免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的间接免疫荧光反应证实，重组蛋白免疫后可产生针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性抗体。但免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的体外杀菌实验的结果不能确定重组蛋白免疫后小鼠产生的针对M18型A群链球菌的型特异性抗体为保护性抗体。 将120只SPF级6周龄的雄性BALB/c小鼠随机分成两组，各60只，一组皮下注射纯化的重组蛋白(与弗氏完全佐剂等体积混合)，50μg/只，并于初次免疫后第14天和第28天加强两次。另一组采用PBS混合弗氏佐剂皮下注射，其它与第一组相同。小鼠末次免疫14天后，将两组小鼠各随机分成5组，10只/组，分别用M1、M3、M6、M18、M5五个血清型的GAS腹腔注射感染小鼠，连续统计小鼠的生存率至第10天。结果表明，各血清型A群链球菌攻毒后，重组蛋白免疫组小鼠末期生存率均高于对照组，但仅M1型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间存在统计学差异(P&lt;0.05)，其余各血清型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间均无统计学差异(P&gt;0.05)。以上结果说明，本次实验中小鼠经重组蛋白免疫后似乎对A群链球菌毒株攻击的保护作用并不明显。 将正常小鼠血清和重组蛋白免疫小鼠血清分别与人体心肌进行免疫组化反应。结果发现，正常血清和免疫血清与心肌均未出现明显的特异性染色的痕迹。这表明，重组蛋白与人体心肌无共同抗原存在。 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 正文 M蛋白是A群链球菌细胞壁中的最重要的蛋白质抗原，根据其抗原特异性的血清分型有150种以上。抗M蛋白抗体为保护性抗体，于链球菌感染后数周至数月内产生，一般可存在1—2年，有的甚至长达10—30年，特异性的抗M蛋白抗体可抵抗同血清型A群链球菌的再感染，但与其它血清型之间无交叉保护。同时，M蛋白与人体心肌和骨骼肌的原肌球蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白和角蛋白等组织蛋白存在共同抗原表位，因而，部分血清型的A群链球菌感染可引起风湿热、风湿性心脏病等自身免疫性疾病。因此，天然M蛋白提取物或M蛋白全分子不能作为A群链球菌疫苗的保护性抗原。 近年来的研究发现，M蛋白是以两条完全相同的α—螺旋结构的多肽链构成的同源二聚体存在于细菌表面，空间结构为线性分子。每一个多肽链从氨基端到羧基端由A、B、C三个重复片段组成，A区为高度变异区，诱导机体产生型特异性保护抗体的抗原决定簇位于该区。B区 M蛋白与人体组织蛋白有交叉反应的抗原表的变异性比A区低，C区为保守区。 位主要位于B区、B—C区的侧翼、A—B区的侧翼.而在A区和C区中存在着一些与人体组织蛋白无交叉反应同时又可诱导机体产生调理抗体的保护性表位。因此，以M蛋白A区为基础设计针对A群链球菌不同血清型的型特异性疫苗既避开了人体产生交叉反应的区域，又可使机体产生保护性抗体，是A群链球菌疫苗研制的一个可行的方法。 第一部分:从美国疾病预防和控制中心(CDC)数据库获得A群链球菌M1、3、6、18四个血清型M蛋白N端型特异性氨基酸序列，根据文献报道并结合生物信息学的方法筛选每一个血清型特异性序列中与人体组织蛋白无同源性的区段，用这些筛选出的氨基酸序列设计出一个重组蛋白，该重 —3—6—18型的顺序将氨基酸序列串连拼接，在串联序列的C末端组蛋白按M1 加上了一个大多数血清型GAS所共有的与人体组织蛋白无交叉表位的14个氨基酸的保守序列J14。对设计蛋白与人体组织蛋白进行BlastP比对，亲水性分析，二级结构分析，空间结构分析以及B细胞表位预测。软件分析结果表明，设计蛋白与人体组织蛋白无同源性，亲水性好，与天然M蛋白空间结构相似，四个血清型的氨基酸序列拼接之后原有抗原表位未被改变。采用DNAWORK2.0在线软件设计了一组寡核苷酸引物，采用Overlap PCR方法合成该重组蛋白的编码核苷酸序列。将该序列克隆到pUC18克隆载体上构建克隆质粒pUC18—strep4，并测序。测序结果证实，合成的基因序列与设计序列完全一致，为设计重组蛋白的原核表达奠定了基础。 第二部分:构建表达重组目的蛋白的原核表达载体。以克隆载体PUC18—Strep4为模板通过PCR扩增获得目的基因，回收纯化目的DNA片段，BamH?和Hind?双酶切后，插入原核表达载体PQE30中，并将其转化入大肠杆菌M15中，通过氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选阳性克隆，酶切和测序鉴定。鉴定结果表明，成功构建原核表达载体PQE30—strep4。重组菌 M15/PQE30—strep4经IPTG诱导表达，表达产物经SDS—PAGE分析表明，重组蛋白分子量为24KD?，与预期分子量23.8KD一致，为可溶性表达。采用Nj2+—NTA亲和层析纯化重组蛋白，纯度达90%以上，每升LB培养基获得了9.46mg重组蛋白。 第三部分:对重组蛋白的免疫原性进行初步研究。 以重组蛋白500μg/只的剂量混合等体积的弗氏完全佐剂皮下多点注射，免疫家兔三只。4周和8周后以相同剂量混合不完全弗氏佐剂加强免疫两次，免疫前采集一次血清样品，初次免疫4周后，每两周采集一次血清样品，至12周放血处死。ELISA法检测免疫后血清中抗重组目的蛋白抗体滴度的动态变化;菌体间接免疫荧光法(IFA) 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 检测免疫血清中型特异性M蛋白抗体;体外杀菌实验检测型特异性抗体是否为杀菌抗体。结果表明，家兔经重组蛋白免疫后，产生了高滴度的抗重组蛋白抗体，菌体间接免疫荧光和体外杀菌实验的结果表明，家兔经重组蛋白免疫后产生了针对M1、M3、M6型A群链球菌M蛋白的型特异性杀菌抗体，但实验同时发现，三只免疫家兔的免疫前血清中已存在M18型A群链球菌的特异性抗体并具有杀菌活性，因而不能确定重组蛋白免疫后是否产生了针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性的杀菌抗体。 通过重组蛋白免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的间接免疫荧光反应证实，重组蛋白免疫后可产生针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性抗体。但免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的体外杀菌实验的结果不能确定重组蛋白免疫后小鼠产生的针对M18型A群链球菌的型特异性抗体为保护性抗体。 将120只SPF级6周龄的雄性BALB/c小鼠随机分成两组，各60只，一组皮下注射纯化的重组蛋白(与弗氏完全佐剂等体积混合)，50μg/只，并于初次免疫后第14天和第28天加强两次。另一组采用PBS混合弗氏佐剂皮下注射，其它与第一组相同。小鼠末次免疫14天后，将两组小鼠各随机分成5组，10只组，分别用M1、M3、M6、M18、M5五个血清型的GAS腹腔注射感染小鼠，连续/ 统计小鼠的生存率至第10天。结果表明，各血清型A群链球菌攻毒后，重组蛋白免疫组小鼠末期生存率均高于对照组，但仅M1型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间存在统计学差异(P&lt;0.05)，其余各血清型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间均无统计学差异(P&gt;0.05)。以上结果说明，本次实验中小鼠经重组蛋白免疫后似乎对A群链球菌毒株攻击的保护作用并不明显。 将正常小鼠血清和重组蛋白免疫小鼠血清分别与人体心肌进行免疫组化反应。结果发现，正常血清和免疫血清与心肌均未出现明显的特异性染色的痕迹。这表明，重组蛋白与人体心肌无共同抗原存在。 M蛋白是A群链球菌细胞壁中的最重要的蛋白质抗原，根据其抗原特异性的血清分型有150种以上。抗M蛋白抗体为保护性抗体，于链球菌感染后数周至数月内产生，一般可存在1—2年，有的甚至长达10—30年，特异性的抗M蛋白抗体可抵抗同血清型A群链球菌的再感染，但与其它血清型之间无交叉保护。同时，M蛋白与人体心肌和骨骼肌的原肌球蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白和角蛋白等组织蛋白存在共同抗原表位，因而，部分血清型的A群链球菌感染可引起风湿热、风湿性心脏病等自身免疫性疾病。因此，天然M蛋白提取物或M蛋白全分子不能作为A群链球菌疫苗的保护性抗原。 近年来的研究发现，M蛋白是以两条完全相同的α—螺旋结构的多肽链构成的同源二聚体存在于细菌表面，空间结构为线性分子。每一个多肽链从氨基端到羧基端由A、B、C三个重复片段组成，A区为高度变异区，诱导机体产生型特异性保护抗体的抗原决定簇位于该区。B区的变异性比A区低，C区为保守区。M蛋白与人体组织蛋白有交叉反应的抗原表位主要位于B区、B—C区的侧翼、A—B区的侧翼.而在A区和C区中存在着一些与人体组织蛋白无交叉反应同时又可诱导机体产生调理抗体的保护性表位。因此，以M蛋白A区为基础设计针对A群链球菌不同血清型的型特异性疫苗既避开了人体产生交叉反应的区域，又可使机体产生保护性抗体，是A群链球菌疫苗研制的一个可行的方法。 第一部分:从美国疾病预防和控制中心(CDC)数据库获得A群链球菌M1、3、6、18四个血清型M蛋白N端型特异性氨基酸序列，根据文献报道并结合生物信息学的方法筛选每一个血清型特异性序列中与人体组织蛋白无同源性的区段，用这些筛选出的氨基酸序列设计出一个重组蛋白，该重组蛋白按M1—3—6—18型的顺序将氨基酸序列串连拼接，在串联序列的C末端加上 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 了一个大多数血清型GAS所共有的与人体组织蛋白无交叉表位的14个氨基酸的保守序列J14。对设计蛋白与人体组织蛋白进行BlastP比对，亲水性分析，二级结构分析，空间结构分析以及B细胞表位预测。软件分析结果表明，设计蛋白与人体组织蛋白无同源性，亲水性好，与天然M蛋白空间结构相似，四个血清型的氨基酸序列拼接之后原有抗原表位未被改变。采用DNAWORK2.0在线软件设计了一组寡核苷酸引物，采用Overlap PCR方法合成该重组蛋白的编码核苷酸序列。将该序列克隆到pUC18克隆载体上构建克隆质粒pUC18—strep4，并测序。测序结果证实，合成的基因序列与设计序列完全一致，为设计重组蛋白的原核表达奠定了基础。 第二部分:构建表达重组目的蛋白的原核表达载体。以克隆载体PUC18—Strep4为模板通过PCR扩增获得目的基因，回收纯化目的DNA片段，BamH?和Hind?双酶切后，插入原核表达载体PQE30中，并将其转化入大肠杆菌M15中，通过氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选阳性克隆，酶切和测序鉴定。 strep4。重组菌鉴定结果表明，成功构建原核表达载体PQE30— M15/PQE30—strep4经IPTG诱导表达，表达产物经SDS—PAGE分析表明，重组蛋白分子量为24KD?，与预期分子量23.8KD一致，为可溶性表达。采用Nj2+—NTA亲和层析纯化重组蛋白，纯度达90%以上，每升LB培养基获得了9.46mg重组蛋白。 第三部分:对重组蛋白的免疫原性进行初步研究。 以重组蛋白500μg/只的剂量混合等体积的弗氏完全佐剂皮下多点注射，免疫家兔三只。4周和8周后以相同剂量混合不完全弗氏佐剂加强免疫两次，免疫前采集一次血清样品，初次免疫4周后，每两周采集一次血清样品，至12周放血处死。ELISA法检测免 )疫后血清中抗重组目的蛋白抗体滴度的动态变化;菌体间接免疫荧光法(IFA检测免疫血清中型特异性M蛋白抗体;体外杀菌实验检测型特异性抗体是否为杀菌抗体。结果表明，家兔经重组蛋白免疫后，产生了高滴度的抗重组蛋白抗体，菌体间接免疫荧光和体外杀菌实验的结果表明，家兔经重组蛋白免疫后产生了针对M1、M3、M6型A群链球菌M蛋白的型特异性杀菌抗体，但实验同时发现，三只免疫家兔的免疫前血清中已存在M18型A群链球菌的特异性抗体并具有杀菌活性，因而不能确定重组蛋白免疫后是否产生了针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性的杀菌抗体。 通过重组蛋白免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的间接免疫荧光反应证实，重组蛋白免疫后可产生针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性抗体。但免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的体外杀菌实验的结果不能确定重组蛋白免疫后小鼠产生的针对M18型A群链球菌的型特异性抗体为保护性抗体。 将120只SPF级6周龄的雄性BALB/c小鼠随机分成两组，各60只，一组皮下注射纯化的重组蛋白(与弗氏完全佐剂等体积混合)，50μg/只，并于初次免疫后第14天和第28天加强两次。另一组采用PBS混合弗氏佐剂皮下注射，其它与第一组相同。小鼠末次免疫14天后，将两组小鼠各随机分成5组，10只/组，分别用M1、M3、M6、M18、M5五个血清型的GAS腹腔注射感染小鼠，连续统计小鼠的生存率至第10天。结果表明，各血清型A群链球菌攻毒后，重组蛋白免疫组小鼠末期生存率均高于对照组，但仅M1型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间存在统计学差异(P&lt;0.05)，其余各血清型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间均无统计学差异(P&gt;0.05)。以上结果说明，本次实验中小鼠经重组蛋白免疫后似乎对A群链球菌毒株攻击的保护作用并不明显。 将正常小鼠血清和重组蛋白免疫小鼠血清分别与人体心肌进行免疫组化反应。结果发现，正常血清和免疫血清与心肌均未出现明显的特异性染色的痕迹。这表明，重组蛋白与人体心肌无共同抗原存在。 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 M蛋白是A群链球菌细胞壁中的最重要的蛋白质抗原，根据其抗原特异性的血清分型有150种以上。抗M蛋白抗体为保护性抗体，于链球菌感染后数周至数月内产生，一般可存在1—2年，有的甚至长达10—30年，特异性的抗M蛋白抗体可抵抗同血清型A群链球菌的再感染，但与其它血清型之间无交叉保护。同时，M蛋白与人体心肌和骨骼肌的原肌球蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白和角蛋白等组织蛋白存在共同抗原表位，因而，部分血清型的A群链球菌感染可引起风湿热、风湿性心脏病等自身免疫性疾病。因此，天然M蛋白提取物或M蛋白全分子不能作为A群链球菌疫苗的保护性抗原。 近年来的研究发现，M蛋白是以两条完全相同的α—螺旋结构的多肽链构成的同源二聚体存在于细菌表面，空间结构为线性分子。每一个多肽链从氨基端到羧基端由A、B、C三个重复片段组成，A区为高度变异区，诱导机体产生型特异性保护抗体的抗原决定簇位于该区。B区的变异性比A区低，C区为保守区。M蛋白与人体组织蛋白有交叉反应的抗原表位 —C区的侧翼、A—B区的侧翼.而在A区和C区中存在着一些与主要位于B区、B 人体组织蛋白无交叉反应同时又可诱导机体产生调理抗体的保护性表位。因此，以M蛋白A区为基础设计针对A群链球菌不同血清型的型特异性疫苗既避开了人体产生交叉反应的区域，又可使机体产生保护性抗体，是A群链球菌疫苗研制的一个可行的方法。 第一部分:从美国疾病预防和控制中心(CDC)数据库获得 、3、6、18四个血清型M蛋白N端型特异性氨基酸序列，根据文A群链球菌M1 献报道并结合生物信息学的方法筛选每一个血清型特异性序列中与人体组织蛋白无同源性的区段，用这些筛选出的氨基酸序列设计出一个重组蛋白，该重组蛋白按M1—3—6—18型的顺序将氨基酸序列串连拼接，在串联序列的C末端加上了一个大多数血清型GAS所共有的与人体组织蛋白无交叉表位的14个氨基酸的保守序列J14。对设计蛋白与人体组织蛋白进行BlastP比对，亲水性分析，二级结构分析，空间结构分析以及B细胞表位预测。软件分析结果表明，设计蛋白与人体组织蛋白无同源性，亲水性好，与天然M蛋白空间结构相似，四个血清型的氨基酸序列拼接之后原有抗原表位未被改变。采用DNAWORK2.0在线软件设计了一组寡核苷酸引物，采用Overlap PCR方法合成该重组蛋白的编码核苷酸序列。将该序列克隆到pUC18克隆载体上构建克隆质粒pUC18—strep4，并测序。测序结果证实，合成的基因序列与设计序列完全一致，为设计重组蛋白的原核表达奠定了基础。 第二部分:构建表达重组目的蛋白的原核表达载体。以克隆载体PUC18—Strep4为模板通过PCR扩增获得目的基因，回收纯化目的DNA片段，BamH?和Hind?双酶切后，插入原核表达载体PQE30中，并将其转化入大肠杆菌M15中，通过氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选阳性克隆，酶切和测序鉴定。鉴定结果表明，成功构建原核表达载体PQE30—strep4。重组菌 M15/PQE30—strep4经IPTG诱导表达，表达产物经SDS—PAGE分析表明，重组蛋白分子量为24KD?，与预期分子量23.8KD一致，为可溶性表达。采用Nj2+—NTA亲和层析纯化重组蛋白，纯度达90%以上，每升LB培养基获得了9.46mg重组蛋白。 第三部分:对重组蛋白的免疫原性进行初步研究。 以重组蛋白500μg/只的剂量混合等体积的弗氏完全佐剂皮下多点注射，免疫家兔三只。4周和8周后以相同剂量混合不完全弗氏佐剂加强免疫两次，免疫前采集一次血清样品，初次免疫4周后，每两周采集一次血清样品，至12周放血处死。ELISA法检测免疫后血清中抗重组目的蛋白抗体滴度的动态变化;菌体间接免疫荧光法(IFA)检测免疫血清中型特异性M蛋白抗体;体外杀菌实验检测型特异性抗体是否为杀菌抗体。结果表明，家兔经重组蛋白免疫后，产生了高滴度的抗重组蛋白抗体， 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 菌体间接免疫荧光和体外杀菌实验的结果表明，家兔经重组蛋白免疫后产生了针对M1、M3、M6型A群链球菌M蛋白的型特异性杀菌抗体，但实验同时发现，三只免疫家兔的免疫前血清中已存在M18型A群链球菌的特异性抗体并具有杀菌活性，因而不能确定重组蛋白免疫后是否产生了针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性的杀菌抗体。 通过重组蛋白免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的间接免疫荧光反应证实，重组蛋白免疫后可产生针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性抗体。但免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的体外杀菌实验的结果不能确定重组蛋白免疫后小鼠产生的针对M18型A群链球菌的型特异性抗体为保护性抗体。 将120只SPF级6周龄的雄性BALB/c小鼠随机分成两组，各60只，一组皮下注射纯化的重组蛋白(与弗氏完全佐剂等体积混合)，50μg/只，并于初次免疫后第14天和第28天加强两次。另一组采用PBS混合弗氏佐剂皮下注射，其它与第一组相同。小鼠末次免疫14天后，将两组小鼠各随机分成5组，10只组，分别用M1、M3、M6、M18、M5五个血清型的GAS腹腔注射感染小鼠，连续/ 统计小鼠的生存率至第10天。结果表明，各血清型A群链球菌攻毒后，重组蛋白免疫组小鼠末期生存率均高于对照组，但仅M1型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间存在统计学差异(P&lt;0.05)，其余各血清型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间均无统计学差异(P&gt;0.05)。以上结果说明，本次实验中小鼠经重组蛋白免疫后似乎对A群链球菌毒株攻击的保护作用并不明显。 将正常小鼠血清和重组蛋白免疫小鼠血清分别与人体心肌进行免疫组化反应。结果发现，正常血清和免疫血清与心肌均未出现明显的特异性染色的痕迹。这表明，重组蛋白与人体心肌无共同抗原存在。 M蛋白是A群链球菌细胞壁中的最重要的蛋白质抗原，根据其抗原特异性的血清分型有150种以上。抗M蛋白抗体为保护性抗体，于链球菌感染后数周至数月内产生，一般可存在1—2年，有的甚至长达10—30年，特异性的抗M蛋白抗体可抵抗同血清型A群链球菌的再感染，但与其它血清型之间无交叉保护。同时，M蛋白与人体心肌和骨骼肌的原肌球蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白和角蛋白等组织蛋白存在共同抗原表位，因而，部分血清型的A群链球菌感染可引起风湿热、风湿性心脏病等自身免疫性疾病。因此，天然M蛋白提取物或M蛋白全分子不能作为A群链球菌疫苗的保护性抗原。 近年来的研究发现，M蛋白是以两条完全相同的α—螺旋结构的多肽链构成的同源二聚体存在于细菌表面，空间结构为线性分子。每一个多肽链从氨基端到羧基端由A、B、C三个重复片段组成，A区为高度变异区，诱导机体产生型特异性保护抗体的抗原决定簇位于该区。B区的变异性比A区低，C区为保守区。M蛋白与人体组织蛋白有交叉反应的抗原表位主要位于B区、B—C区的侧翼、A—B区的侧翼.而在A区和C区中存在着一些与人体组织蛋白无交叉反应同时又可诱导机体产生调理抗体的保护性表位。因此，以M蛋白A区为基础设计针对A群链球菌不同血清型的型特异性疫苗既避开了人体产生交叉反应的区域，又可使机体产生保护性抗体，是A群链球菌疫苗研制的一个可行的方法。 第一部分:从美国疾病预防和控制中心(CDC)数据库获得A群链球菌M1、3、6、18四个血清型M蛋白N端型特异性氨基酸序列，根据文献报道并结合生物信息学的方法筛选每一个血清型特异性序列中与人体组织蛋白无同源性的区段，用这些筛选出的氨基酸序列设计出一个重组蛋白，该重组蛋白按M1—3—6—18型的顺序将氨基酸序列串连拼接，在串联序列的C末端加上了一个大多数血清型GAS所共有的与人体组织蛋白无交叉表位的14个氨基酸的保守序列J14。对设计蛋白与人体组织蛋白进行BlastP比对，亲水性分析，二 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 级结构分析，空间结构分析以及B细胞表位预测。软件分析结果表明，设计蛋白与人体组织蛋白无同源性，亲水性好，与天然M蛋白空间结构相似，四个血清型的氨基酸序列拼接之后原有抗原表位未被改变。采用DNAWORK2.0在线软件设计了一组寡核苷酸引物，采用Overlap PCR方法合成该重组蛋白的编码核苷酸序列。将该序列克隆到pUC18克隆载体上构建克隆质粒pUC18—strep4，并测序。测序结果证实，合成的基因序列与设计序列完全一致，为设计重组蛋白的原核表达奠定了基础。 第二部分:构建表达重组目的蛋白的原核表达载体。以克隆载体PUC18—Strep4为模板通过PCR扩增获得目的基因，回收纯化目的DNA片段，BamH?和Hind?双酶切后，插入原核表达载体PQE30中，并将其转化入大肠杆菌M15中，通过氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选阳性克隆，酶切和测序鉴定。鉴定结果表明，成功构建原核表达载体PQE30—strep4。重组菌 M15/PQE30—strep4经IPTG诱导表达，表达产物经SDS—PAGE分析表明，重组 —NTA蛋白分子量为24KD?，与预期分子量23.8KD一致，为可溶性表达。采用Nj2+亲和层析纯化重组蛋白，纯度达90%以上，每升LB培养基获得了9.46mg重组蛋白。 第三部分:对重组蛋白的免疫原性进行初步研究。 以重组蛋白500μg/只的剂量混合等体积的弗氏完全佐剂皮下多点注射，免疫家兔三只。4周和8周后以相同剂量混合不完全弗氏佐剂加强免疫两次，免疫前采集一次血清样品，初次免疫4周后，每两周采集一次血清样品，至12周放血处死。ELISA法检测免疫后血清中抗重组目的蛋白抗体滴度的动态变化;菌体间接免疫荧光法(IFA)检测免疫血清中型特异性M蛋白抗体;体外杀菌实验检测型特异性抗体是否为杀菌抗体。结果表明，家兔经重组蛋白免疫后，产生了高滴度的抗重组蛋白抗体，菌体间接免疫荧光和体外杀菌实验的结果表明，家兔经重组蛋白免疫后产生了针对M1、M3、M6型A群链球菌M蛋白的型特异性杀菌抗体，但实验同时发现，三只免疫家兔的免疫前血清中已存在M18型A群链球菌的特异性抗体并具有杀菌活性，因而不能确定重组蛋白免疫后是否产生了针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性的杀菌抗体。 通过重组蛋白免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的间接免疫荧光反应证实，重组蛋白免疫后可产生针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性抗体。但免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的体外杀菌实验的结果不能确定重组蛋白免疫后小鼠产生的针对M18型A群链球菌的型特异性抗体为保护性抗体。 将120只SPF级6周龄的雄性BALB/c小鼠随机分成两组，各60只，一组皮下注射纯化的重组蛋白(与弗氏完全佐剂等体积混合)，50μg/只，并于初次免疫后第14天和第28天加强两次。另一组采用PBS混合弗氏佐剂皮下注射，其它与第一组相同。小鼠末次免疫14天后，将两组小鼠各随机分成5组，10只/组，分别用M1、M3、M6、M18、M5五个血清型的GAS腹腔注射感染小鼠，连续统计小鼠的生存率至第10天。结果表明，各血清型A群链球菌攻毒后，重组蛋白免疫组小鼠末期生存率均高于对照组，但仅M1型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间存在统计学差异(P&lt;0.05)，其余各血清型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间均无统计学差异(P&gt;0.05)。以上结果说明，本次实验中小鼠经重组蛋白免疫后似乎对A群链球菌毒株攻击的保护作用并不明显。 将正常小鼠血清和重组蛋白免疫小鼠血清分别与人体心肌进行免疫组化反应。结果发现，正常血清和免疫血清与心肌均未出现明显的特异性染色的痕迹。这表明，重组蛋白与人体心肌无共同抗原存在。 M蛋白是A群链球菌细胞壁中的最重要的蛋白质抗原，根据其抗原特异性的血清分型有150种以上。抗M蛋白抗体为保护性抗体，于链球菌感染后数周至数月内 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 产生，一般可存在1—2年，有的甚至长达10—30年，特异性的抗M蛋白抗体可抵抗同血清型A群链球菌的再感染，但与其它血清型之间无交叉保护。同时，M蛋白与人体心肌和骨骼肌的原肌球蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白和角蛋白等组织蛋白存在共同抗原表位，因而，部分血清型的A群链球菌感染可引起风湿热、风湿性心脏病等自身免疫性疾病。因此，天然M蛋白提取物或M蛋白全分子不能作为A群链球菌疫苗的保护性抗原。 近年来的研究发现，M蛋白是以两条完全相同的α—螺旋结构的多肽链构成的同源二聚体存在于细菌表面，空间结构为线性分子。每一个多肽链从氨基端到羧基端由A、B、C三个重复片段组成，A区为高度变异区，诱导机体产生型特异性保护抗体的抗原决定簇位于该区。B区的变异性比A区低，C区为保守区。M蛋白与人体组织蛋白有交叉反应的抗原表位主要位于B区、B—C区的侧翼、A—B区的侧翼.而在A区和C区中存在着一些与人体组织蛋白无交叉反应同时又可诱导机体产生调理抗体的保护性表位。因此，以M蛋白A区为基础设计针对A群链球菌不同血清型的型特异性疫苗既避开了人体产生交叉反应的区域，又可使机体产生保护性抗体，是A群链球菌疫苗研制的一个可行的方法。 第一部分:从美国疾病预防和控制中心(CDC)数据库获得A群链球菌M1、3、6、18四个血清型M蛋白N端型特异性氨基酸序列，根据文献报道并结合生物信息学的方法筛选每一个血清型特异性序列中与人体组织蛋白无同源性的区段，用这些筛选出的氨基酸序列设计出一个重组蛋白，该重组蛋白按M1—3—6—18型的顺序将氨基酸序列串连拼接，在串联序列的C末端加上了一个大多数血清型GAS所共有的与人体组织蛋白无交叉表位的14个氨基酸的保守序列J14。对设计蛋白与人体组织蛋白进行BlastP比对，亲水性分析，二级结构分析，空间结构分析以及B细胞表位预测。软件分析结果表明，设计蛋白与人体组织蛋白无同源性，亲水性好，与天然M蛋白空间结构相似，四个血清型的氨基酸序列拼接之后原有抗原表位未被改变。采用DNAWORK2.0在线软件设计了一组寡核苷酸引物，采用Overlap PCR方法合成该重组蛋白的编码核苷酸序列。将该序列克隆到pUC18克隆载体上构建克隆质粒pUC18—strep4，并测序。测序结果证实，合成的基因序列与设计序列完全一致，为设计重组蛋白的原核表达奠定了基础。 第二部分:构建表达重组目的蛋白的原核表达载体。以克隆载体PUC18—Strep4为模板通过PCR扩增获得目的基因，回收纯化目的DNA片段，BamH?和Hind?双酶切后，插入原核表达载体PQE30中，并将其转化入大肠杆菌M15中，通过氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选阳性克隆，酶切和测序鉴定。鉴定结果表明，成功构建原核表达载体PQE30—strep4。重组菌 M15/PQE30—strep4经IPTG诱导表达，表达产物经SDS—PAGE分析表明，重组蛋白分子量为24KD?，与预期分子量23.8KD一致，为可溶性表达。采用Nj2+—NTA亲和层析纯化重组蛋白，纯度达90%以上，每升LB培养基获得了9.46mg重组蛋白。 第三部分:对重组蛋白的免疫原性进行初步研究。 以重组蛋白500μg/只的剂量混合等体积的弗氏完全佐剂皮下多点注射，免疫家兔三只。4周和8周后以相同剂量混合不完全弗氏佐剂加强免疫两次，免疫前采集一次血清样品，初次免疫4周后，每两周采集一次血清样品，至12周放血处死。ELISA法检测免疫后血清中抗重组目的蛋白抗体滴度的动态变化;菌体间接免疫荧光法(IFA)检测免疫血清中型特异性M蛋白抗体;体外杀菌实验检测型特异性抗体是否为杀菌抗体。结果表明，家兔经重组蛋白免疫后，产生了高滴度的抗重组蛋白抗体，菌体间接免疫荧光和体外杀菌实验的结果表明，家兔经重组蛋白免疫后产生了针对M1、M3、M6型A群链球菌M蛋白的型特异性杀菌抗体，但实验同时发现，三 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 只免疫家兔的免疫前血清中已存在M18型A群链球菌的特异性抗体并具有杀菌活性，因而不能确定重组蛋白免疫后是否产生了针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性的杀菌抗体。 通过重组蛋白免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的间接免疫荧光反应证实，重组蛋白免疫后可产生针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性抗体。但免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的体外杀菌实验的结果不能确定重组蛋白免疫后小鼠产生的针对M18型A群链球菌的型特异性抗体为保护性抗体。 将120只SPF级6周龄的雄性BALB/c小鼠随机分成两组，各60只，一组皮下注射纯化的重组蛋白(与弗氏完全佐剂等体积混合)，50μg/只，并于初次免疫后第14天和第28天加强两次。另一组采用PBS混合弗氏佐剂皮下注射，其它与第一组相同。小鼠末次免疫14天后，将两组小鼠各随机分成5组，10只/组，分别用M1、M3、M6、M18、M5五个血清型的GAS腹腔注射感染小鼠，连续统计小鼠的生存率至第10天。结果表明，各血清型A群链球菌攻毒后，重组蛋白免疫组小鼠末期生存率均高于对照组，但仅M1型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间存在统计学差异(P&lt;0.05)，其余各血清型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间均无统计学差异(P&gt;0.05)。以上结果说明，本次实验中小鼠经重组蛋白免疫后似乎对A群链球菌毒株攻击的保护作用并不明显。 将正常小鼠血清和重组蛋白免疫小鼠血清分别与人体心肌进行免疫组化反应。结果发现，正常血清和免疫血清与心肌均未出现明显的特异性染色的痕迹。这表明，重组蛋白与人体心肌无共同抗原存在。 M蛋白是A群链球菌细胞壁中的最重要的蛋白质抗原，根据其抗原特异性的血清分型有150种以上。抗M蛋白抗体为保护性抗体，于链球菌感染后数周至数月内产生，一般可存在1—2年，有的甚至长达10—30年，特异性的抗M蛋白抗体可抵抗同血清型A群链球菌的再感染，但与其它血清型之间无交叉保护。同时，M蛋白与人体心肌和骨骼肌的原肌球蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白和角蛋白等组织蛋白存在共同抗原表位，因而，部分血清型的A群链球菌感染可引起风湿热、风湿性心脏病等自身免疫性疾病。因此，天然M蛋白提取物或M蛋白全分子不能作为A群链球菌疫苗的保护性抗原。 近年来的研究发现，M蛋白是以两条完全相同的α—螺旋结构的多肽链构成的同源二聚体存在于细菌表面，空间结构为线性分子。每一个多肽链从氨基端到羧基端由A、B、C三个重复片段组成，A区为高度变异区，诱导机体产生型特异性保护抗体的抗原决定簇位于该区。B区的变异性比A区低，C区为保守区。M蛋白与人体组织蛋白有交叉反应的抗原表位主要位于B区、B—C区的侧翼、A—B区的侧翼.而在A区和C区中存在着一些与人体组织蛋白无交叉反应同时又可诱导机体产生调理抗体的保护性表位。因此，以M蛋白A区为基础设计针对A群链球菌不同血清型的型特异性疫苗既避开了人体产生交叉反应的区域，又可使机体产生保护性抗体，是A群链球菌疫苗研制的一个可行的方法。 第一部分:从美国疾病预防和控制中心(CDC)数据库获得A群链球菌M1、3、6、18四个血清型M蛋白N端型特异性氨基酸序列，根据文献报道并结合生物信息学的方法筛选每一个血清型特异性序列中与人体组织蛋白无同源性的区段，用这些筛选出的氨基酸序列设计出一个重组蛋白，该重组蛋白按M1—3—6—18型的顺序将氨基酸序列串连拼接，在串联序列的C末端加上了一个大多数血清型GAS所共有的与人体组织蛋白无交叉表位的14个氨基酸的保守序列J14。对设计蛋白与人体组织蛋白进行BlastP比对，亲水性分析，二级结构分析，空间结构分析以及B细胞表位预测。软件分析结果表明，设计蛋白与人体组织蛋白无同源性，亲水性好，与天然M蛋白空间结构相似，四个血清型 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 的氨基酸序列拼接之后原有抗原表位未被改变。采用DNAWORK2.0在线软件设计了一组寡核苷酸引物，采用Overlap PCR方法合成该重组蛋白的编码核苷酸序列。将该序列克隆到pUC18克隆载体上构建克隆质粒pUC18—strep4，并测序。测序结果证实，合成的基因序列与设计序列完全一致，为设计重组蛋白的原核表达奠定了基础。 第二部分:构建表达重组目的蛋白的原核表达载体。以克隆载体PUC18—Strep4为模板通过PCR扩增获得目的基因，回收纯化目的DNA片段，BamH?和Hind?双酶切后，插入原核表达载体PQE30中，并将其转化入大肠杆菌M15中，通过氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选阳性克隆，酶切和测序鉴定。鉴定结果表明，成功构建原核表达载体PQE30—strep4。重组菌 M15/PQE30—strep4经IPTG诱导表达，表达产物经SDS—PAGE分析表明，重组蛋白分子量为24KD?，与预期分子量23.8KD一致，为可溶性表达。采用Nj2+—NTA亲和层析纯化重组蛋白，纯度达90%以上，每升LB培养基获得了9.46mg重组蛋 第三部分:对重组蛋白的免疫原性进行初步研究。 以重组蛋白500μg/白。 只的剂量混合等体积的弗氏完全佐剂皮下多点注射，免疫家兔三只。4周和8周后以相同剂量混合不完全弗氏佐剂加强免疫两次，免疫前采集一次血清样品，初次免疫4周后，每两周采集一次血清样品，至12周放血处死。ELISA法检测免疫后血清中抗重组目的蛋白抗体滴度的动态变化;菌体间接免疫荧光法(IFA)检测免疫血清中型特异性M蛋白抗体;体外杀菌实验检测型特异性抗体是否为杀菌抗体。结果表明，家兔经重组蛋白免疫后，产生了高滴度的抗重组蛋白抗体，菌体间接免疫荧光和体外杀菌实验的结果表明，家兔经重组蛋白免疫后产生了针对M1、M3、M6型A群链球菌M蛋白的型特异性杀菌抗体，但实验同时发现，三只免疫家兔的免疫前血清中已存在M18型A群链球菌的特异性抗体并具有杀菌活性，因而不能确定重组蛋白免疫后是否产生了针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性的杀菌抗体。 通过重组蛋白免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的间接免疫荧光反应证实，重组蛋白免疫后可产生针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性抗体。但免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的体外杀菌实验的结果不能确定重组蛋白免疫后小鼠产生的针对M18型A群链球菌的型特异性抗体为保护性抗体。 将120只SPF级6周龄的雄性BALB/c小鼠随机分成两组，各60只，一组皮下注射纯化的重组蛋白(与弗氏完全佐剂等体积混合)，50μg/只，并于初次免疫后第14天和第28天加强两次。另一组采用PBS混合弗氏佐剂皮下注射，其它与第一组相同。小鼠末次免疫14天后，将两组小鼠各随机分成5组，10只/组，分别用M1、M3、M6、M18、M5五个血清型的GAS腹腔注射感染小鼠，连续统计小鼠的生存率至第10天。结果表明，各血清型A群链球菌攻毒后，重组蛋白免疫组小鼠末期生存率均高于对照组，但仅M1型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间存在统计学差异(P&lt;0.05)，其余各血清型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间均无统计学差异(P&gt;0.05)。以上结果说明，本次实验中小鼠经重组蛋白免疫后似乎对A群链球菌毒株攻击的保护作用并不明显。 将正常小鼠血清和重组蛋白免疫小鼠血清分别与人体心肌进行免疫组化反应。结果发现，正常血清和免疫血清与心肌均未出现明显的特异性染色的痕迹。这表明，重组蛋白与人体心肌无共同抗原存在。 M蛋白是A群链球菌细胞壁中的最重要的蛋白质抗原，根据其抗原特异性的血清分型有150种以上。抗M蛋白抗体为保护性抗体，于链球菌感染后数周至数月内产生，一般可存在1—2年，有的甚至长达10—30年，特异性的抗M蛋白抗体可抵抗同血清型A群链球菌的再感染，但与其它血清型之间无交叉保护。同时，M 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 蛋白与人体心肌和骨骼肌的原肌球蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白和角蛋白等组织蛋白存在共同抗原表位，因而，部分血清型的A群链球菌感染可引起风湿热、风湿性心脏病等自身免疫性疾病。因此，天然M蛋白提取物或M蛋白全分子不能作为A群链球菌疫苗的保护性抗原。 近年来的研究发现，M蛋白是以两条完全相同的α—螺旋结构的多肽链构成的同源二聚体存在于细菌表面，空间结构为线性分子。每一个多肽链从氨基端到羧基端由A、B、C三个重复片段组成，A区为高度变异区，诱导机体产生型特异性保护抗体的抗原决定簇位于该区。B区的变异性比A区低，C区为保守区。M蛋白与人体组织蛋白有交叉反应的抗原表位主要位于B区、B—C区的侧翼、A—B区的侧翼.而在A区和C区中存在着一些与人体组织蛋白无交叉反应同时又可诱导机体产生调理抗体的保护性表位。因此，以M蛋白A区为基础设计针对A群链球菌不同血清型的型特异性疫苗既避开了人体产生交叉反应的区域，又可使机体产生保护性抗体，是A群链球菌疫苗研制的 )数据库获得一个可行的方法。 第一部分:从美国疾病预防和控制中心(CDCA群链球菌M1、3、6、18四个血清型M蛋白N端型特异性氨基酸序列，根据文献报道并结合生物信息学的方法筛选每一个血清型特异性序列中与人体组织蛋白无同源性的区段，用这些筛选出的氨基酸序列设计出一个重组蛋白，该重组蛋白按M1—3—6—18型的顺序将氨基酸序列串连拼接，在串联序列的C末端加上了一个大多数血清型GAS所共有的与人体组织蛋白无交叉表位的14个氨基酸的保守序列J14。对设计蛋白与人体组织蛋白进行BlastP比对，亲水性分析，二级结构分析，空间结构分析以及B细胞表位预测。软件分析结果表明，设计蛋白与人体组织蛋白无同源性，亲水性好，与天然M蛋白空间结构相似，四个血清型的氨基酸序列拼接之后原有抗原表位未被改变。采用DNAWORK2.0在线软件设计了一组寡核苷酸引物，采用Overlap PCR方法合成该重组蛋白的编码核苷酸序列。将该序列克隆到pUC18克隆载体上构建克隆质粒pUC18—strep4，并测序。测序结果证实，合成的基因序列与设计序列完全一致，为设计重组蛋白的原核表达奠定了基础。 第二部分:构建表达重组目的蛋白的原核表达载体。以克隆载体PUC18—Strep4为模板通过PCR扩增获得目的基因，回收纯化目的DNA片段，BamH?和Hind?双酶切后，插入原核表达载体PQE30中，并将其转化入大肠杆菌M15中，通过氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选阳性克隆，酶切和测序鉴定。鉴定结果表明，成功构建原核表达载体PQE30—strep4。重组菌 M15/PQE30—strep4经IPTG诱导表达，表达产物经SDS—PAGE分析表明，重组蛋白分子量为24KD?，与预期分子量23.8KD一致，为可溶性表达。采用Nj2+—NTA亲和层析纯化重组蛋白，纯度达90%以上，每升LB培养基获得了9.46mg重组蛋白。 第三部分:对重组蛋白的免疫原性进行初步研究。 以重组蛋白500μg/只的剂量混合等体积的弗氏完全佐剂皮下多点注射，免疫家兔三只。4周和8周后以相同剂量混合不完全弗氏佐剂加强免疫两次，免疫前采集一次血清样品，初次免疫4周后，每两周采集一次血清样品，至12周放血处死。ELISA法检测免疫后血清中抗重组目的蛋白抗体滴度的动态变化;菌体间接免疫荧光法(IFA)检测免疫血清中型特异性M蛋白抗体;体外杀菌实验检测型特异性抗体是否为杀菌抗体。结果表明，家兔经重组蛋白免疫后，产生了高滴度的抗重组蛋白抗体，菌体间接免疫荧光和体外杀菌实验的结果表明，家兔经重组蛋白免疫后产生了针对M1、M3、M6型A群链球菌M蛋白的型特异性杀菌抗体，但实验同时发现，三只免疫家兔的免疫前血清中已存在M18型A群链球菌的特异性抗体并具有杀菌活性，因而不能确定重组蛋白免疫后是否产生了针对M18型A群链球菌M蛋白的特 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 异性的杀菌抗体。 通过重组蛋白免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的间接免疫荧光反应证实，重组蛋白免疫后可产生针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性抗体。但免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的体外杀菌实验的结果不能确定重组蛋白免疫后小鼠产生的针对M18型A群链球菌的型特异性抗体为保护性抗体。 将120只SPF级6周龄的雄性BALB/c小鼠随机分成两组，各60只，一组皮下注射纯化的重组蛋白(与弗氏完全佐剂等体积混合)，50μg/只，并于初次免疫后第14天和第28天加强两次。另一组采用PBS混合弗氏佐剂皮下注射，其它与第一组相同。小鼠末次免疫14天后，将两组小鼠各随机分成5组，10只/组，分别用M1、M3、M6、M18、M5五个血清型的GAS腹腔注射感染小鼠，连续统计小鼠的生存率至第10天。结果表明，各血清型A群链球菌攻毒后，重组蛋白免疫组小鼠末期生存率均高于对照组，但仅M1型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间存在统计学差异(P&lt;0.05)，其余各血清型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间均无统计学差异(P&gt;0.05)。以上结果说明，本次实验中小鼠经重组蛋白免疫后似乎对A群链球菌毒株攻击的保护作用并不明显。 将正常小鼠血清和重组蛋白免疫小鼠血清分别与人体心肌进行免疫组化反应。结果发现，正常血清和免疫血清与心肌均未出现明显的特异性染色的痕迹。这表明，重组蛋白与人体心肌无共同抗原存在。 M蛋白是A群链球菌细胞壁中的最重要的蛋白质抗原，根据其抗原特异性的血清分型有150种以上。抗M蛋白抗体为保护性抗体，于链球菌感染后数周至数月内产生，一般可存在1—2年，有的甚至长达10—30年，特异性的抗M蛋白抗体可抵抗同血清型A群链球菌的再感染，但与其它血清型之间无交叉保护。同时，M蛋白与人体心肌和骨骼肌的原肌球蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白和角蛋白等组织蛋白存在共同抗原表位，因而，部分血清型的A群链球菌感染可引起风湿热、风湿性心脏病等自身免疫性疾病。因此，天然M蛋白提取物或M蛋白全分子不能作为A群链球菌疫苗的保护性抗原。 近年来的研究发现，M蛋白是以两条完全相同的α—螺旋结构的多肽链构成的同源二聚体存在于细菌表面，空间结构为线性分子。每一个多肽链从氨基端到羧基端由A、B、C三个重复片段组成，A区为高度变异区，诱导机体产生型特异性保护抗体的抗原决定簇位于该区。B区的变异性比A区低，C区为保守区。M蛋白与人体组织蛋白有交叉反应的抗原表位主要位于B区、B—C区的侧翼、A—B区的侧翼.而在A区和C区中存在着一些与人体组织蛋白无交叉反应同时又可诱导机体产生调理抗体的保护性表位。因此，以M蛋白A区为基础设计针对A群链球菌不同血清型的型特异性疫苗既避开了人体产生交叉反应的区域，又可使机体产生保护性抗体，是A群链球菌疫苗研制的一个可行的方法。 第一部分:从美国疾病预防和控制中心(CDC)数据库获得A群链球菌M1、3、6、18四个血清型M蛋白N端型特异性氨基酸序列，根据文献报道并结合生物信息学的方法筛选每一个血清型特异性序列中与人体组织蛋白无同源性的区段，用这些筛选出的氨基酸序列设计出一个重组蛋白，该重组蛋白按M1—3—6—18型的顺序将氨基酸序列串连拼接，在串联序列的C末端加上了一个大多数血清型GAS所共有的与人体组织蛋白无交叉表位的14个氨基酸的保守序列J14。对设计蛋白与人体组织蛋白进行BlastP比对，亲水性分析，二级结构分析，空间结构分析以及B细胞表位预测。软件分析结果表明，设计蛋白与人体组织蛋白无同源性，亲水性好，与天然M蛋白空间结构相似，四个血清型的氨基酸序列拼接之后原有抗原表位未被改变。采用DNAWORK2.0在线软件设计了一组寡核苷酸引物，采用Overlap PCR方法合成该重组蛋白的编码核苷酸序列。 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 将该序列克隆到pUC18克隆载体上构建克隆质粒pUC18—strep4，并测序。测序结果证实，合成的基因序列与设计序列完全一致，为设计重组蛋白的原核表达奠定了基础。 第二部分:构建表达重组目的蛋白的原核表达载体。以克隆载体PUC18—Strep4为模板通过PCR扩增获得目的基因，回收纯化目的DNA片段，BamH?和Hind?双酶切后，插入原核表达载体PQE30中，并将其转化入大肠杆菌M15中，通过氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选阳性克隆，酶切和测序鉴定。鉴定结果表明，成功构建原核表达载体PQE30—strep4。重组菌 M15/PQE30—strep4经IPTG诱导表达，表达产物经SDS—PAGE分析表明，重组蛋白分子量为24KD?，与预期分子量23.8KD一致，为可溶性表达。采用Nj2+—NTA亲和层析纯化重组蛋白，纯度达90%以上，每升LB培养基获得了9.46mg重组蛋白。 第三部分:对重组蛋白的免疫原性进行初步研究。 以重组蛋白500μg/只的剂量混合等体积的弗氏完全佐剂皮下多点注射，免疫家兔三只。4周和8周后以相同剂量混合不完全弗氏佐剂加强免疫两次，免疫前采集一次血清样品，初 ELISA法检测免次免疫4周后，每两周采集一次血清样品，至12周放血处死。 疫后血清中抗重组目的蛋白抗体滴度的动态变化;菌体间接免疫荧光法(IFA)检测免疫血清中型特异性M蛋白抗体;体外杀菌实验检测型特异性抗体是否为杀菌抗体。结果表明，家兔经重组蛋白免疫后，产生了高滴度的抗重组蛋白抗体，菌体间接免疫荧光和体外杀菌实验的结果表明，家兔经重组蛋白免疫后产生了针对M1、M3、M6型A群链球菌M蛋白的型特异性杀菌抗体，但实验同时发现，三只免疫家兔的免疫前血清中已存在M18型A群链球菌的特异性抗体并具有杀菌活性，因而不能确定重组蛋白免疫后是否产生了针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性的杀菌抗体。 通过重组蛋白免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的间接免疫荧光反应证实，重组蛋白免疫后可产生针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性抗体。但免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的体外杀菌实验的结果不能确定重组蛋白免疫后小鼠产生的针对M18型A群链球菌的型特异性抗体为保护性抗体。 将120只SPF级6周龄的雄性BALB/c小鼠随机分成两组，各60只，一组皮下注射纯化的重组蛋白(与弗氏完全佐剂等体积混合)，50μg/只，并于初次免疫后第14天和第28天加强两次。另一组采用PBS混合弗氏佐剂皮下注射，其它与第一组相同。小鼠末次免疫14天后，将两组小鼠各随机分成5组，10只/组，分别用M1、M3、M6、M18、M5五个血清型的GAS腹腔注射感染小鼠，连续统计小鼠的生存率至第10天。结果表明，各血清型A群链球菌攻毒后，重组蛋白免疫组小鼠末期生存率均高于对照组，但仅M1型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间存在统计学差异(P&lt;0.05)，其余各血清型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间均无统计学差异(P&gt;0.05)。以上结果说明，本次实验中小鼠经重组蛋白免疫后似乎对A群链球菌毒株攻击的保护作用并不明显。 将正常小鼠血清和重组蛋白免疫小鼠血清分别与人体心肌进行免疫组化反应。结果发现，正常血清和免疫血清与心肌均未出现明显的特异性染色的痕迹。这表明，重组蛋白与人体心肌无共同抗原存在。 M蛋白是A群链球菌细胞壁中的最重要的蛋白质抗原，根据其抗原特异性的血清分型有150种以上。抗M蛋白抗体为保护性抗体，于链球菌感染后数周至数月内产生，一般可存在1—2年，有的甚至长达10—30年，特异性的抗M蛋白抗体可抵抗同血清型A群链球菌的再感染，但与其它血清型之间无交叉保护。同时，M蛋白与人体心肌和骨骼肌的原肌球蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白和角蛋白等组织蛋白存在共同抗原表位，因而，部分血清型的A群链球菌感染可引起风湿热、风 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 湿性心脏病等自身免疫性疾病。因此，天然M蛋白提取物或M蛋白全分子不能作为A群链球菌疫苗的保护性抗原。 近年来的研究发现，M蛋白是以两条完全相同的α—螺旋结构的多肽链构成的同源二聚体存在于细菌表面，空间结构为线性分子。每一个多肽链从氨基端到羧基端由A、B、C三个重复片段组成，A区为高度变异区，诱导机体产生型特异性保护抗体的抗原决定簇位于该区。B区的变异性比A区低，C区为保守区。M蛋白与人体组织蛋白有交叉反应的抗原表位主要位于B区、B—C区的侧翼、A—B区的侧翼.而在A区和C区中存在着一些与人体组织蛋白无交叉反应同时又可诱导机体产生调理抗体的保护性表位。因此，以M蛋白A区为基础设计针对A群链球菌不同血清型的型特异性疫苗既避开了人体产生交叉反应的区域，又可使机体产生保护性抗体，是A群链球菌疫苗研制的一个可行的方法。 第一部分:从美国疾病预防和控制中心(CDC)数据库获得A群链球菌M1、3、6、18四个血清型M蛋白N端型特异性氨基酸序列，根据文献报道并结合生物信息学的方法筛选每一个血清型特异性序列中与人体组织蛋白无同源性的区段，用这些筛选出的氨基酸序列设计出一个重组蛋白，该重组蛋 —3—6—18型的顺序将氨基酸序列串连拼接，在串联序列的C末端加上白按M1 了一个大多数血清型GAS所共有的与人体组织蛋白无交叉表位的14个氨基酸的保守序列J14。对设计蛋白与人体组织蛋白进行BlastP比对，亲水性分析，二级结构分析，空间结构分析以及B细胞表位预测。软件分析结果表明，设计蛋白与人体组织蛋白无同源性，亲水性好，与天然M蛋白空间结构相似，四个血清型的氨基酸序列拼接之后原有抗原表位未被改变。采用DNAWORK2.0在线软件设计了一组寡核苷酸引物，采用Overlap PCR方法合成该重组蛋白的编码核苷酸序列。将该序列克隆到pUC18克隆载体上构建克隆质粒pUC18—strep4，并测序。测序结果证实，合成的基因序列与设计序列完全一致，为设计重组蛋白的原核表达奠定了基础。 第二部分:构建表达重组目的蛋白的原核表达载体。以克隆载体PUC18—Strep4为模板通过PCR扩增获得目的基因，回收纯化目的DNA片段，BamH?和Hind?双酶切后，插入原核表达载体PQE30中，并将其转化入大肠杆菌M15中，通过氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选阳性克隆，酶切和测序鉴定。鉴定结果表明，成功构建原核表达载体PQE30—strep4。重组菌 M15/PQE30—strep4经IPTG诱导表达，表达产物经SDS—PAGE分析表明，重组蛋白分子量为24KD?，与预期分子量23.8KD一致，为可溶性表达。采用Nj2+—NTA亲和层析纯化重组蛋白，纯度达90%以上，每升LB培养基获得了9.46mg重组蛋白。 第三部分:对重组蛋白的免疫原性进行初步研究。 以重组蛋白500μg/只的剂量混合等体积的弗氏完全佐剂皮下多点注射，免疫家兔三只。4周和8周后以相同剂量混合不完全弗氏佐剂加强免疫两次，免疫前采集一次血清样品，初次免疫4周后，每两周采集一次血清样品，至12周放血处死。ELISA法检测免疫后血清中抗重组目的蛋白抗体滴度的动态变化;菌体间接免疫荧光法(IFA)检测免疫血清中型特异性M蛋白抗体;体外杀菌实验检测型特异性抗体是否为杀菌抗体。结果表明，家兔经重组蛋白免疫后，产生了高滴度的抗重组蛋白抗体，菌体间接免疫荧光和体外杀菌实验的结果表明，家兔经重组蛋白免疫后产生了针对M1、M3、M6型A群链球菌M蛋白的型特异性杀菌抗体，但实验同时发现，三只免疫家兔的免疫前血清中已存在M18型A群链球菌的特异性抗体并具有杀菌活性，因而不能确定重组蛋白免疫后是否产生了针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性的杀菌抗体。 通过重组蛋白免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的间接免疫荧光反应证实，重组蛋白免疫后可产生针对M18型A群链球菌M蛋白的特 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 异性抗体。但免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的体外杀菌实验的结果不能确定重组蛋白免疫后小鼠产生的针对M18型A群链球菌的型特异性抗体为保护性抗体。 将120只SPF级6周龄的雄性BALB/c小鼠随机分成两组，各60只，一组皮下注射纯化的重组蛋白(与弗氏完全佐剂等体积混合)，50μg/只，并于初次免疫后第14天和第28天加强两次。另一组采用PBS混合弗氏佐剂皮下注射，其它与第一组相同。小鼠末次免疫14天后，将两组小鼠各随机分成5组，10只/组，分别用M1、M3、M6、M18、M5五个血清型的GAS腹腔注射感染小鼠，连续统计小鼠的生存率至第10天。结果表明，各血清型A群链球菌攻毒后，重组蛋白免疫组小鼠末期生存率均高于对照组，但仅M1型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间存在统计学差异(P&lt;0.05)，其余各血清型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间均无统计学差异(P&gt;0.05)。以上结果说明，本次实验中小鼠经重组蛋白免疫后似乎对A群链球菌毒株攻击的保护作用并不明显。 将正常小鼠血清和重组蛋白免疫小鼠血清分别与人体心肌进行免疫组化反应。结果发现，正常血清和免疫血清与心肌均未出现明显的特异性染色的痕迹。这表明，重组蛋白与人体心肌无共同抗原存在。 M蛋白是A群链球菌细胞壁中的最重要的蛋白质抗原，根据其抗原特异性的血清分型有150种以上。抗M蛋白抗体为保护性抗体，于链球菌感染后数周至数月内 2年，有的甚至长达10—30年，特异性的抗M蛋白抗体可产生，一般可存在1— 抵抗同血清型A群链球菌的再感染，但与其它血清型之间无交叉保护。同时，M蛋白与人体心肌和骨骼肌的原肌球蛋白、波形蛋白、层粘连蛋白和角蛋白等组织蛋白存在共同抗原表位，因而，部分血清型的A群链球菌感染可引起风湿热、风湿性心脏病等自身免疫性疾病。因此，天然M蛋白提取物或M蛋白全分子不能作为A群链球菌疫苗的保护性抗原。 近年来的研究发现，M蛋白是以两条完全相同的α—螺旋结构的多肽链构成的同源二聚体存在于细菌表面，空间结构为线性分子。每一个多肽链从氨基端到羧基端由A、B、C三个重复片段组成，A区为高度变异区，诱导机体产生型特异性保护抗体的抗原决定簇位于该区。B区的变异性比A区低，C区为保守区。M蛋白与人体组织蛋白有交叉反应的抗原表位主要位于B区、B—C区的侧翼、A—B区的侧翼.而在A区和C区中存在着一些与人体组织蛋白无交叉反应同时又可诱导机体产生调理抗体的保护性表位。因此，以M蛋白A区为基础设计针对A群链球菌不同血清型的型特异性疫苗既避开了人体产生交叉反应的区域，又可使机体产生保护性抗体，是A群链球菌疫苗研制的一个可行的方法。 第一部分:从美国疾病预防和控制中心(CDC)数据库获得A群链球菌M1、3、6、18四个血清型M蛋白N端型特异性氨基酸序列，根据文献报道并结合生物信息学的方法筛选每一个血清型特异性序列中与人体组织蛋白无同源性的区段，用这些筛选出的氨基酸序列设计出一个重组蛋白，该重组蛋白按M1—3—6—18型的顺序将氨基酸序列串连拼接，在串联序列的C末端加上了一个大多数血清型GAS所共有的与人体组织蛋白无交叉表位的14个氨基酸的保守序列J14。对设计蛋白与人体组织蛋白进行BlastP比对，亲水性分析，二级结构分析，空间结构分析以及B细胞表位预测。软件分析结果表明，设计蛋白与人体组织蛋白无同源性，亲水性好，与天然M蛋白空间结构相似，四个血清型的氨基酸序列拼接之后原有抗原表位未被改变。采用DNAWORK2.0在线软件设计了一组寡核苷酸引物，采用Overlap PCR方法合成该重组蛋白的编码核苷酸序列。将该序列克隆到pUC18克隆载体上构建克隆质粒pUC18—strep4，并测序。测序结果证实，合成的基因序列与设计序列完全一致，为设计重组蛋白的原核表达奠 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 定了基础。 第二部分:构建表达重组目的蛋白的原核表达载体。以克隆载体PUC18—Strep4为模板通过PCR扩增获得目的基因，回收纯化目的DNA片段，BamH?和Hind?双酶切后，插入原核表达载体PQE30中，并将其转化入大肠杆菌M15中，通过氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选阳性克隆，酶切和测序鉴定。鉴定结果表明，成功构建原核表达载体PQE30—strep4。重组菌 M15/PQE30—strep4经IPTG诱导表达，表达产物经SDS—PAGE分析表明，重组蛋白分子量为24KD?，与预期分子量23.8KD一致，为可溶性表达。采用Nj2+—NTA亲和层析纯化重组蛋白，纯度达90%以上，每升LB培养基获得了9.46mg重组蛋白。 第三部分:对重组蛋白的免疫原性进行初步研究。 以重组蛋白500μg/只的剂量混合等体积的弗氏完全佐剂皮下多点注射，免疫家兔三只。4周和8周后以相同剂量混合不完全弗氏佐剂加强免疫两次，免疫前采集一次血清样品，初次免疫4周后，每两周采集一次血清样品，至12周放血处死。ELISA法检测免 )疫后血清中抗重组目的蛋白抗体滴度的动态变化;菌体间接免疫荧光法(IFA检测免疫血清中型特异性M蛋白抗体;体外杀菌实验检测型特异性抗体是否为杀菌抗体。结果表明，家兔经重组蛋白免疫后，产生了高滴度的抗重组蛋白抗体，菌体间接免疫荧光和体外杀菌实验的结果表明，家兔经重组蛋白免疫后产生了针对M1、M3、M6型A群链球菌M蛋白的型特异性杀菌抗体，但实验同时发现，三只免疫家兔的免疫前血清中已存在M18型A群链球菌的特异性抗体并具有杀菌活性，因而不能确定重组蛋白免疫后是否产生了针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性的杀菌抗体。 通过重组蛋白免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的间接免疫荧光反应证实，重组蛋白免疫后可产生针对M18型A群链球菌M蛋白的特异性抗体。但免疫后小鼠血清与M18型的A群链球菌的体外杀菌实验的结果不能确定重组蛋白免疫后小鼠产生的针对M18型A群链球菌的型特异性抗体为保护性抗体。 将120只SPF级6周龄的雄性BALB/c小鼠随机分成两组，各60只，一组皮下注射纯化的重组蛋白(与弗氏完全佐剂等体积混合)，50μg/只，并于初次免疫后第14天和第28天加强两次。另一组采用PBS混合弗氏佐剂皮下注射，其它与第一组相同。小鼠末次免疫14天后，将两组小鼠各随机分成5组，10只/组，分别用M1、M3、M6、M18、M5五个血清型的GAS腹腔注射感染小鼠，连续统计小鼠的生存率至第10天。结果表明，各血清型A群链球菌攻毒后，重组蛋白免疫组小鼠末期生存率均高于对照组，但仅M1型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间存在统计学差异(P&lt;0.05)，其余各血清型攻毒后，重组蛋白免疫组和PBS组之间均无统计学差异(P&gt;0.05)。以上结果说明，本次实验中小鼠经重组蛋白免疫后似乎对A群链球菌毒株攻击的保护作用并不明显。 将正常小鼠血清和重组蛋白免疫小鼠血清分别与人体心肌进行免疫组化反应。结果发现，正常血清和免疫血清与心肌均未出现明显的特异性染色的痕迹。这表明，重组蛋白与人体心肌无共同抗原存在。 《《《特别提醒》》》:正文内容由PDF文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 。如还不能显示，可以联系我q q 1627550258 ，提供原格式文档。我们还可提供代笔服务，价格优惠，服务周到，包您通过。 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 " 垐垯櫃 换烫梯葺铑? endstream endobj 2 ? 跦??ǜ?l, 墀VGi?o嫅#^4K錶c&伣嘰呐q 虻U節鉡c姥 ?x滌甸??*U躆 ?BL偤7.X 哖?]驳疗" g讍` l/<5蔍`7sQ\I vs疖 ?S [J%J v I雓1傀 7鑥 伍妰遠Y 魥 靤 /W鐼E 霯q聊湝 ECu?knb?.:?澍羈 7?坋:;俐hEan[2 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 P6?!八帊/=櫕貵`Wp?U脞姦%?qj ?颬 儼噃I V 壂 G邊??Vг忣鏕裚?靈模? ?慞 擭昄X?;萕屄P,' 枍U霩R嚵蝆RC`珵墂锬襵")焟滫?ob#噡滴覇羘幥d Peブt?Pf臕?m稅盠?恁 【精品】毕业论文 优秀毕业论文 本科论文 专业学术论文 参考文献资料 v_關lm ,OMK?^'vOp牯V睟艶頛4. ?鮠4l 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