人巨细胞病毒检测方法的比较

人巨细胞病毒检测方法的比较 (MedicalJoumM.ftheChinesePeoplesArmedPoliceForces)Vo1.20N..062009-06出版 551 人巨细胞病毒检测方法的比较 郭志强李军综述徐德兴审校(武警北京总队第二医院检验科,北京100037;2广州 军区总医 院检验科,广州510010) 【关键词】人巨细胞病毒检测方法感染状态比较进展 【中国图书分类号】R373.9R392.1 人巨细胞病毒(Humancytomegalovirus,HCMV)是人类 疱疹病毒组中最大的一种病毒,由162个壳粒,正20面体构 成,有典型的疱疹病毒结构.HCMV在人群中感染非常广 泛,在我国成人感染率可达80%,97%.感染者可长期 或间隙地经口腔,生殖道,胎盘,输血或器官移植等多途径, 由唾液,乳汁,血液,尿液,精液,子宫分泌物等多种介质携带 排出病毒进行传播.绝大多数成年感染者通常呈隐性感染, 多无临床症状,但当机体免疫功能低下,如妊娠,多次输血, 器官移植,获得性免疫缺陷等时,病毒可被激活而发生显性 感染.病毒可侵入肺,肝,肾,唾液腺,乳腺等其他腺体,以 及多核白细胞和淋巴细胞,侵袭多个器官和系统可引起严重 疾病,也是器官移植失败的主要原因之一.该病毒在人体内 感染的普遍性,感染后潜伏及再激活感染方式等,都给临床 病毒感染的早期诊断带来了很大困难.下面就目前HCMV 检测方法的灵敏性,特异性及简繁性进行比较. 1病毒的生物学特性 健康个体初次感染HCMV后通常无症状,并可以在宿 主体内终生持续存在.然而,初次感染和潜伏状态的HCMV 的活化,对于处于免疫抑制状态的移植受体和HIV患者而 言则可以导致严重的后果.这也使得许多研究机构研究了 许多的导致HCMV从潜伏到活化的诸多机制,为临床早期 诊断HCMV在人体的感染状态找到更为有效的手段提供帮 助. 1.1结构特点HCMV具有典型的疱疹病毒(HSV)形态, 其DNA结构与HSV的相似,比HSV大5%.具有一个长单 一 序列(u1)和短单一序列(Us).HCMV以等分子浓度的4 个异物体存在,至少编码氨基酸残基数100以上的多肽200 余种,包括原始基因产物,中间产物及终末产物. 12HCMV基因转录的时相性HCMV基因的转录及翻 译受其自身及宿主细胞的调控,并具有时相性,分即刻早期 (IE),早期(E)和晚期(L),整个复制周期48,72h_3J. 作者简介:郭志强,男,1971年出生.硕士研究生,主管技师.主要从 事临床检验工作. (1)IE期:HCMV感染后0—2h,不需预先合成病毒蛋白, 通过细胞RNA多聚酶?,立即转录合成IEP,该期无病毒 DNA复制,编码IEP的基因位于ul区0.66—0.77基因单 位处,少量IEP的基因位于长重复序列0.01—0.035和 0.795—0.825基因单位处及ul的0.2—0.260基因单位 处,HCMVAD169株至少含IE.,IE,IE,三个外显子,编码 四组IEP即IEP】,IEP2,IEP和IEP4.IE1编码68及72 kDu即IEP和IEP2两种蛋白质.MIEP能抑制IE增强子 激活,对自身起负调控作用,但可促进E及L基因的启动 子与病毒DNA多酶及RNA多聚酶?作用,使其产生正调 控作用.(2)E期和L期:HCMV感染后2,4h,病毒 DNA尚未复制,此时为E期,此时病毒的RNA能与DNA的 许多区域发生杂交,最富集的区域位于UL区的0—0.046 基因单位处.早期蛋白(EP)是重要的功能蛋白,其主要作 用之一是与合成病毒DNA多聚酶,诱导病毒DNA复制有 关HCMV感染后36—48h,病毒DNA复制开始并合成晚期 蛋白,该蛋白是形成病毒结构蛋白的主要成分,此时为L 期,该期以大量病毒结构蛋白产生及感染性毒粒释放为其 特征. 1.3基因型的变异性增加了判断检测结果的复杂性HC— MV抗原性是相对稳定的,但在某些基因位点上也易发现变 异』,UL和US的连接点是出现变异的主要部位,并且HC— MV基因片段多,各个保守基因片段连接部分也是HCMV出 现变异的主要部位,HCMV各感染株间的序列同源性为 80%.许多研究均发现,gB基因组虽高度保守,但基因组内 定区域在不同毒株间仍存在变异.有学者分别对HCM— VUL55,U157,UIZ6,UL122四个基因在感染人群的变异性和 单个患者体内的变异性进行了PCR和酶切检测,结果显示 人群中UL55基因片段的PCR阳性率和酶切阳性率都较低, 而UL57,UL86,UL122的检出率较高且基本相等,说明HC— MV各基因变异也存在差异.某些基因在单个患者的治疗 过程中也存在较大的变异性,对于单个患者个体来说,在疾 病的进展和治疗过程中,病毒会产生一定的变异,这种变异 的结果可能是病毒对人体免疫攻击的逃避或者是对治疗药 物的抗药性. 552嚣 (MedicalJournaloftheChinesePeople'8ArmedPoliceFolx~s)Vo1.20No.062009-06出版 2检测方法的特点比较 2.1检测病毒感染状态的金是分离培养从临床标本 中分离出HCMV是一种确切的诊断,所有新的检测方法均 须与之比较.HCMV对宿主或培养细胞有高度的种特异性, 只能感染人及在人纤维细胞中增殖.血管系统(内皮细胞和 平滑肌细胞)可能是其主要的潜伏部位,另外循环淋巴细 胞,单核细胞和多形核白细胞,上皮细胞,成纤维细胞都可含 潜伏病毒.病毒增殖非常缓慢,初次分离需1个月才出现细 胞毒,细胞肿大形成巨细胞性细胞,肿大的细胞核内和胞质 内可查见嗜酸性包涵体,在不利条件下巨细胞病毒(CMV) 的感染性迅速减弱,且一些生长迅速的疱疹病毒或真菌会使 单层细胞受损而影响CMV的分离.最好用唾液,尿液,生殖 道分泌物,乳汁和白细胞,接种到人的成纤维细胞内繁殖和 分离,细胞病变效应在1d或数周后出现,经固定和HE染色 后可观察到巨细胞,核内有内包涵体,核周晕圈及嗜酸性胞 浆内包涵体.通过细胞分离培养病毒虽然是诊断金标准,但 是耗时较长,检测灵敏度低,在临床上已经很少使用.为了 快速诊断,可将培养24h的感染细胞固定,用DNA探针进 行原位杂交,检测CMV的DNA. 2.2血清学检测抗原,抗体是广泛应用的经济准确的检测 方法检测抗原,抗体的方法很多,常用的有补体结合试验, 免疫酶试验,间接免疫荧光试验,间接血凝试验等.最常用 血清学诊断方法是ELISA法,技术成熟,成本低,操作简便. IgG抗体反映病毒既往感染可在体内终身持续存在,IgM抗 体与急性感染有关.当单份血清标本已确定既往有CMV感 染时,应当立即留血清标本,以及间隔2周,4周,8周再留血 清标本,结合病毒分离可作原发感染诊断.但HCMV成人 感染率极高,IgG大多数人均为阳性,检测意义不大,且 ELISA法受影响因素较多,特异性不高. 2.3核酸杂交,原位杂交检测结果有较高的临床指导意义 目前,HCMV感染的诊断技术已从生物学病毒分离培养和 免疫学检测抗原抗体,进入到对基因组进行诊断的分子生物 学水平阶段,通过标记的核酸探针用分子杂交方法检测标本 微量的病毒DNA,具有特异性强,灵敏度高的优点.同时, 此法不仅能诊断HCMV的活动性感染,而且还能确证潜伏 感染.用高比活性放射性同位素检测HCMV,DNA克隆 片段及放射自显影检测方法,灵敏度可达0.5pg,特异性可 达100%.如用光敏生物素标记探针检测HCMVDNA,灵敏 度达10—5Opg,由随机引物延伸法和缺口平移法标记的生 物素探针灵敏度分别为10—50pg和10Pg.CMV—pp65蛋 白由CMV—UL83基因编码,具有强免疫原性,可作为病毒 抗原血症快速诊断的靶抗原.应用生物标记法检测患者外 周血自细胞中pp65可以在发病前早期诊断CMV感染,并 可以用于预测CMV病的发生,高水平抗原血症意味着高发 病率.采用核酸基础序列扩增法检测pp67,pp67是晚 期信使核糖核酸编码的CMV基质层蛋白,它不仅与病毒 基因的复制有关,而且是具有完整病毒循环的标志,所以pp 67是CMV活动性感染最可靠的指标.对pp67的监测可以 准确地反映出体内HCMV的活动状况.但基于方法学上 的特殊,完成全过程受诸因素影响,包括标本须在采集的当 天处理,固定剂的选择以及单克隆抗体细胞株的特异性,并 且对镜检人员的技术要求较高,方法上很难做到高通量检 测,抗污染能力也不强.并且试剂多为进口试剂,成本昂贵, 难以在中小医院普及. 2.4聚合酶链式反应(PCR)灵敏性,特异性高,但尚未用于 临床诊断单纯的PCR法检测HCMV,灵敏度为0.15fg,敏 感性,特异性均为100%.检测时只需5的临床尿样标本 和血液标本.目前常用的PCR技术如:RT—PCR,套式PCR, 多重PCR,real—timePCR等在HCMV检测中都有应用.HC— MV的IE基因,E基因和L基因是PCR引物设计的靶基因. PCR方法检测CMV—DNA所需的标本少,敏感性高,5—50 个基因片断就可检出,并且快速简便,4—6h即可出结果,外 周血白细胞,血浆,血清等均可以用于检测.血浆和血清检 测更适合活动性CMV感染的诊断.E基因和L基因是PCR 引物设计的靶基因,对HCMV的IE各功能基因DNA的扩 增,及对IE—mRNA,PP65,PP67,PP150蛋白的RT-PCR,通 过凝胶电泳条带分析,可判断病毒隐性一显性感染状态[121. CMV即刻早期基因(IE—mRNA)是调节基因,病毒感染后l h即可被检出,故RT-PCR检测IE—mRNA可以达到早期诊 断目的.套式PCR是在普通PCR基础上改建和发展起 来的新技术,是在同一PCR反应体系中分别加入一对外引 物和一对内引物,进行两次PCR扩增,较好地提高了检测的 敏感性和特异性.实时荧光定量PCR方法弥补病毒抗原,抗 体检测的部分不足,首先它极大的缩短了检测的窗口期(7 d),可以做到早期检测.另外,其检测灵敏度也优于抗体 的检测.实时荧光定量PCR检测过程基本自动化,排除了 检测中人为因素对结果的干扰.除此之外,实时荧光PCR 技术对病毒检测可以量化,因此,该结果用来检测病毒的活 动性,评价抗病毒疗效有着重要的意义.从目前的PCR检 测结果得出,单用一对PCR引物可引起假阴性,主要原因可 能是临床标本中HCMV毒株的不同或病毒基因组中极微小 变异(及病毒拷贝数太低)所致.此外,即使引物设计所选 的序列针对HCMV同一基因的不同部位,其PCR扩增结果 也有明显差异.因为市场上尚无商品化的HCMV的PCR 试剂盒,方法上尚需标准化. 3现状与展望 HCMV基因转录的时相性,基因型的变异性以及病毒感 染的潜伏与活化的可逆性,对检测结果的临床诊断意义提出 了更高地要求.病毒培养法仅可提供HCMV含量的估计 值,灵敏度低,耗时长,不能用于HCMV感染的早期检测. 而且标本的稳定性差,使其在临床应用中受到限制,近年来 已被直接抗原检测及DNA检测法所取代.通常情况下,人 体感染CMV产生CMV.IgG并达到可检测滴度需要l2,l7 周,而机体感染CMV以后3—5d即可出现CMV-IgM抗体, 嚣豳(MedicalJournal.ftheChinesePeoplesArmedPollceForces)Vo1.20N..062009-06出 版553 CMV-IgM抗体在血液仅存在12—16周,因此CMV—lgM阳性 是诊断近期感染的可靠指标.有研究发现肾移植患者发生 CMV病之前IgG抗体显着升高的占39%,而IgM抗体检出 率仅14%,ELISA法检测CMV特异性IgM抗体可用于免疫 功能正常的CMV活动性感染或CMV病的诊断,但其阳性率 低,在严重免疫抑制患者可缺乏抗体反应或抗体延迟出现. 可见血清学抗体检测不能作为CMV感染的早期诊断依据. 但CMV的IgM和IgG抗体可以反映机体的免疫反应状 态16].NASBA法是一种引物依赖连续扩增核酸的技术,具 有简便,快速的特点,可以在2h内使RNA产生100万倍的 扩增,由于整个过程都是恒温的,就解决了DNA同时扩增的 问题.pp67可用于监测抗病毒药物的疗效,可以早期判断 抗病毒药物的耐药性,判断是否需抗病毒治疗.但其成本昂 贵,普及率不高,临床开展较少. 随着PCR技术的不断普及进步,对IE,PP54,PP65, PP67,PP150等蛋白组合进行RT—PCR,可较为准确判断HC— MV的感染状态17],相信不久商品化的HCMV早期诊断 PCR试剂盒就会上市推广,HCMV检测将为临床相关治疗提 供更为有力的依据.基因芯片,纳米技术等在灵敏度和精确 度上并没有明显优势,有待进一步研究. 参考文献 [2] [3] [4] [5] [6] WangPS,EvansAS.PrevalanceofantibodiestoEpsteinBarrVi- ILlSandcytomegMovirusinserafromagroupofchildreninthe People'sRepubicofChina[J].InfectDis,1986,153:150 MorrisDJ.Cytomegaloviruspneumoniaconsequenceofimmuno- suppressionandpre?-existinglungdamageratherthanimmunopa?? thology[J].RespirMed,1993,87:345 StantonR,WilkinsonGW,FoxJDeta1.AnalysisofHumanHer- pesvirus-6IEISequenceVariationinClinicalSamples[J].JMed Viral,2003,71(4):578 HertelL,ChouS,MocarskiES.ViralandCellCycle—Regulated KinasesinCytomegalovirus?-InducedPseudomitosisandReplica- tion[J].PLoSPathog,2007,3(1):e6 NozawaN,YamamotoY,FukuiYeta1.Identificationofa1.6kb genomelocusofguineapigcytomegalovirusrequiredforefficient viralgrowthinanimalsbutnotincellculture[J].Virology, 2008,379(1):45 DasS,VasanjiA,PellettPE.Three—dimensionalstructureofthe humancytomegaloviruscytoplasmicvirionassemblycomplexin— cludesareorientedsecretoryapparatus[J].Virul,2007,81: ll861 [7]BaleJFJr,PetheramSJ,RobertsonMeta1.Humaneytomegalov. iresasequenceandUL144variabilityinstrainsfrominfected children[J]MedVirol,2001,65(1):90 [8]MelnickJL,HuC,BurekJeta1.CytomegalovirustDNAinarte— rialwailsofpatientswithatherosclerosis[J].MedVirol,1994, 42:170 [9]PauleauAL,LarochetteN,GiordanettoFeta1.Structure.function analysisoftheinteractionbetweenBaxandthecytomegalovinls— encodedproteinvMIA[J].Oncoqene,2007,26(50):7067 [1O]JenkinsC,GarciaW,GodwinMJeta1.ImmunomodulatoryProp— eniesofaViralHomologofHumanInterleukin一10Expressedby HumanCytomegalovirusduringtheLatentPhaseofInfection[J]. 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