染色体17p13_3肿瘤杂合性缺失区域内外显子的分离

染色体17p13_3肿瘤杂合性缺失区域内外显子的分离 ?新方法? 染色体 171313肿瘤杂合性缺失区域内外显子的分离 p 郭鸣雷, 赵新泰, 万大方, 顾健人 () 文章编号: 100027431 20000420290203 中图分类号: 781 文献标识码: Q A 摘要: 目的 在染色体 171313 杂合性缺失区域内进行 p 作为第一步, 能够发现与肝癌发生与发展相关的基 171313 采用外显子搏获法对位于 表达序列的分离。方法 p 因。 杂合性缺失区域内的 BA C 基因组克隆进行外显子的分离。 结果 在获得的克隆中, 4 个克隆为已知基因的外显子, 另 4材料和方法 (个克隆属于 3 个新外显子 2 个克隆中的外显子片段序列一 )致。 结论 在染色体 171313 杂合性缺失区域内获得了一 p 11 材料 些表达序列。 公 试 剂 盒 购 自 E qon T rapp ing G IBCOL BRL杂合性缺失; 外显子捕获 关键词: 司。限制性核酸内切酶 P stI , N o tI 等, 牛小肠碱性 磷酸酶, 连接酶, 10菌, 氨苄青霉素购 T 4DN A D H B ISOL A T IO N O F EXO NS O N THE LO SS O F 自 公司。I 抽提液, 溶液购自P rom ega TR zo l D E PC HETERO ZY GO S ITY REG IO N O F CHROM O SOM E 171313 2pIN TUM O RS BY EXO N TRA PP ING GU O M ing 细 胞 购 自 中 科 院 细 胞 所; 公 司。 27 S igm a CO S, 2, 2, . leiZ H A O X inta iW A N D af ang et a lS hang ha i C ancer 试 剂, 无 血 清 的 2培 养 液, L ipofect A C E O p t iM EM , I nstitu teT he N a tiona l L abora tory f or O ncog enes and R ela ted 培养液购自 公司。 反应 DM EM G IBCOL BRL PCR )(, . . . 200032G enesS hang ha i PRC h ina : A bstra c tO bjec t ive Iso la t ion of exp re ssion sequence on 试剂盒购自华美公司。 () th e L o ss of H e te rozygo sity LO H reg ion on ch rom o som e 21 方法171313 . . p w a s ca r ied ou tM e thods E xon t rapp ingRe sul ts 1基因组 的制备aBA C DN A , 4 E igh t exon s w e re iso la ted of th em a re exon s of k now n 具 体 过 程 参 见《分 子 克 隆》中 大 量 抽 取 质 粒. gene s and th e o th e r s a re nove lCon c lus ion Som e exon s on 171313 .th e LO H reg ion of ch rom o som e p w e re ob ta ined 的方法。所得 用水溶解后定量, 酶 IDN A DN A N o t 切鉴定。 脉冲场凝胶电泳确定 片段的大小。BA C () ; Key words: E xon L o ss of h e te rozygo sity LO H 1 外显子捕获法bT rapp ing 可分为重组子的制备: 重组子 转染 2DN A CO S 7 细胞; 27 细胞总 的抽提; 逆转录酶多聚 CO SRN A 17 号染色体与多种肿瘤的发生发展有着密切 () 的关系, 著名的 53 基因定位于 171313 区域。近来 酶链反应 2产物的亚克隆及测序几; p p R T PCR PCR 越来越多的文献报道 171313 区域在多种肿瘤中发 p 部分。 具体操作步骤参见《分子克隆》中各章节和外(生 高 频 率 的 杂 合 性 丢 失 L o ss of H eterozygo sity 显子捕获法的。) , 如在成神经管细胞瘤, 星形胶质细胞瘤, 原 LO H 1 序列测定结果的计算机分析 将序列与相应c发 性 外 胚 层 肿 瘤, 乳 腺 癌, 卵 巢 癌, 肾 细 胞 瘤 和 肝 1 的 基因组序列数据库进行BA C 癌。提示此区域内可能含有一个或多个抑癌基因。 本实验室研究已证明了肝癌中染色体 171313 区域 p 比较, 确定有无匹配, 从而证明此序列确实来源于基内存在高频率的 确定了其共同缺失的最小范 , LO H 因组。 用本实验室开放阅读框架寻找工具查找基因 围, 并获得了位于该范围的基因组克隆。在这些工作 序列可能的编码框架。 基础上, 开展该区域内的外显子分离工作。希望以此 结 果 ) 电泳 3, 因此用它进行以下的实验。 为了确定 BA C 克隆外源片段的大小, 首先用 I 内 切 酶 酶 解 、和 4071840 414N o t BA C BA C BA C 克隆。经 018 % 琼脂糖凝胶电泳鉴定是否酶切完全。 ( ) 如图。 可见 酶解后, 载体片段 711 完全I N o t K b 释放出来, 说明酶解完全。酶解样品再经冲场电泳分 离确定每个 的大小。 从图 2 可见, 407 的 BA C BA C 外源片段约为 50 ; 414 的外源片段约为 90K bBA C ; 1840 的外源片段的为 110 。K bBA C K b 图 3 P st I 酶切 BA C DNA 的琼脂糖凝胶电泳 ( : ; 1: 511; 2: 22222 3: 3424; 4: M M a rkerBA C GBA C J BA C P )58611; 5: 12506BA C L BA C 31I 酶切重组子克隆的琼脂糖凝胶电泳 P st 酶解片段与载体连接, 转化。为了验 BA C DN A 证连接效率, 必须对重组子进行鉴定。 挑取克隆, 小 量抽提后, 用 I 内切酶酶切后电泳, 观察有无外 P st 源片段的释放。 如图 4 所示, 每个克隆均有外源片 段。 图 1 琼脂糖凝胶电泳 (): , 1: 407, 2: 414, 3: 1840M M a rkerBA C BA C BA C 图 4 重组子克隆 P st I 酶切后的琼脂糖凝胶电泳 41 总 的甲醛凝胶电泳 RN A 将抽提的混合重组子 转染 27 细胞, DN A CO S 培 养一定时间后, 进行总 的抽提。 如图 5 所 RN A 示, 表明 质量完好, 没有降解。RN A 图 2 脉冲场凝胶电泳 (): , 1: 407, 2: 414, 3: 1840M M a rkerBA C BA C BA C 21酶切 的琼脂糖凝胶电泳 I P st BA C DN A 本 实验的第一步为选择合适的限制性内切酶酶 切 。 因为 的酶解片段要与载 BA C DN A BA C DN A 体 相连接。 为了保证连接效率, 酶解片段不3 P SPL 能太大; 同时酶解片段也不应太小, 从而使其可能包 含的外显子的机率降低。 所以合适的范围为 2, 6 。实验中选择了载体多克隆位点上不同限制性内 K b图 5 总 RNA 的甲醛凝胶电泳 1: 511; 2: 22222; 3: 34724; 4: 58611; 5: BA C GBA C J BA C P BA C L 切酶 , 和分别进行酶切。经过 II I P stE co R B am H 12506; 6: BA C con t ro l ( 比 较, 内 切 酶 的 酶 解 片 段 较 符 合 要 求 如 图I P st 51 逆转录多聚酶链反应后产物的鉴定 51121 的序列的序列。 其它序列不再赘述。 G 先进行逆转录, 再用试剂盒中特定 将总 RN A 的引物进行第一轮和第二轮 PCR , 走琼脂糖凝胶电 泳, 观察有无条带产生。 如图 6 所示, 表明可能有外 显子片段。 61 候选阳性外显子克隆的测序结果 将 含 有 外 显 子 片 段 的 克 隆 培 养, 抽 提 质 粒 定量后用 377 型自动测序仪测序。 本文列出, DN A 51121 的序列:G 图 6 2产物的琼脂糖凝胶电泳 R T PCR GA GGCTCA GA GGA T GCCA CC GA GT GGA CGG A CGT GA GCA G GA CCA CA GA G A CAA CCCA GT GGGA CA CGCA A CA CT GT TCC CAA GA T GT TA GCA GGGGAAA GA GTCGGA CG AAA T GGCGAA GT GT T T GGCA CAAA GAA GA C CAA CAAA T GA CA CA CCAA GC CA GTAAA GA C A CCTCCA C 71 候选阳性外显子克隆序列的计算机分析结 除了大部分认为可能是同一外显子的克隆, 其根据 是它 们 的 产 物 电 泳 时 处 于 同 一 位 置。 当 然 PCR 果 产物处于同一位置的克隆其外显子也有可能 PCR 将所得序列与计算机里的序列数据库进行比较 不一样, 对此, 作者也挑选进行测序。 然而结果是全 附表 外显子克隆序列的计算机分析结果 )部来源于载体的同一序列。 由此推测, 在整个转化 外显 所得的克隆中, 载体来源的假阳性外显子比例将达 外显子性质 BA C 克隆 子数 70 %, 80 % 。假阳性率太高, 不能令人满意。经仔 细研究了载体的序列后, 发现在 2的内含 肌球蛋白外显子; 磷脂酰肌醇激酶外显子, H IV TA T 4 BA C 407 I21: 新基因外显子, 空载体 新基因外( 子中, 多克隆位点的右侧, 有一隐蔽剪切位点 包括 显子, 载体来源, 空载体 新基因外) 受体和供体, 长度约为 110, 它可以发生类似外 bp 3 BA C 5G11: 显子, 载体来源 2 源外显子的剪切, 逃避 的降解作用, 强烈地 I 34724: B stX BA C P 基因外显子, 载体来源T au 4 22222: BA C J 2 干扰正常的捕获过程, 使假阳性率大大提高。另外 基因外子, 载体来源1 OV CA 12506:BA C 2 有一些克隆测不出序列, 显示为混合克隆。原因可能 BA C 586L 11: 1 载体来源 是挑取培养的过程中, 操作失误, 导致克隆的相互污 染, 然而检查其 产物却只有一条带, 说明污染 PCR 的可能性不大; 也可能此克隆在扩增的过程中发生 3 讨 论 突变, 导致序列的不一致。 空载体产生的原因则是 ? 酶切处理不完全。B st () 外 显子捕获法 的原理是根据 E xon T rapp ing 2 前体在转录后发生内含子剪切而设计。把 m RN A 一段基因组序列克隆入合适的载体中。 该载体含有 发生剪切序列所必须的剪切信号。 若这段基因组序 参考文献 列含有完整的外显子, 在转录后就能发生剪切。该方 法已被多家实验室采用, 已生产出专用的试剂盒, 使1 Saxena A , C la rk W C , S ta rk M , et a l. E v idence fo r the invo lvem en t 17 of a po ten t ia l second tum o r supp resso r s on ch rom o som e d ist inct 用较为方便。 文献报道, 此方法的灵敏度为 20, 80 f rom p 53 in m a lignan t a st rocy tom a s〔J 〕. Cancer R es, 1992, 52: 6716 4 范围内可以捕获一个外显子。本实验总共获取k b 卢大儒, 邱信芳, 薛京伦. 医学分子遗传学〔M 〕. 上海: 复旦大学出 2 版社, 1997: 69 8 个外显子片段, 而原始 克隆覆盖的杂合性缺BA C , , , . Chu rch DM S to ler CJ Jones D et a lIso la t ion of genes f rom 失范围约为 450 , 因此灵敏度与报道相符。 获取 k b3 com p lex sou rces of m amm a lian genom ic DNA u sing exon ( ) 的 8 个外显子片段 代表 7 个外显子中有 6 个与 〔〕. , 1994: 98: 6am p lif ica t ionJ N a tu re Genet 17数据库有高度匹配, 说明它们确实来自缺失区 p , , , . 2B u rn TC Conno r s TD B erd A P et a lIncrea sed exont rapp ing 4 域内。而的 基因的外显子片段经证 22222 BA C J T au 3 〔〕. eff iciency th rough m od if ica t ion s to the P SPL sp licing vecto rJ 实不在 17内。 原因可能是此 克隆为嵌合克p BA C , 1995, 161: 183Gene ( ) 收稿日期: 1999210214; 修回日期: 2000201217 隆, 其基因组片段由两部分组成。 作者简介: 郭鸣雷, 男, 硕士, 实习研究员。 从结果可看出, 有相当一部分为同一载体为源