宁夏回族hlaa，b，drb1基因座遗传多态性和单倍型分析

宁夏回族hlaa，b，drb1基因座遗传多态性和单倍型 宁夏回族HLA A，B，DRB1基因座遗传多态 性和单倍型分析 作者:沈春梅 朱波峰 刘孟黎 张华东 李生斌 【摘要】 目的: 研究宁夏回族自治区地区回族人群HLA A，B，DRB1基因座的等位基因及其组成的单倍型频率分布特征. : 采集宁夏回族122名无关健康个体静脉血，应用聚合酶链反应 序列特异性引物方法对其HLA A，B和DRB1 基因座进行基因分型. 直接计数法统计基因频率，采用最大数学预期值算法计算HLA单体型频率. 结果: 122 名宁夏回族个体的HLA A，B，DRB1基因座分别检出14，29，13个等位基因. 高频等位基因分别为HLA A*02;HLA A*11;HLA A*24;HLA A*03，HLA B*35;HLA B*46;HLA B*13;HLA B*51， HLA DRB1*15;HLA DRB1*09;HLA DRB1*07;HLA DRB1*12. 高频单倍型分别为HLA A*02 B*46; HLA A*11 B*60; HLA A*02 B*51; HLA B*46 DRB1*09; HLA B*13 DRB1*07; HLA B*58 DRB1*17; HLA A*02 B*46 DRB1*09; HLA A*02 B*58 DRB1*17; HLA A*02 B*13 DRB1*12. 结论: 宁夏回族自治区回族人群HLA基因座的等位基因和单倍型具有较高的遗传多态性. HLA A*01 B*37, HLA A*30 B*13, HLA A*02 B*50, HLA B*31 DRB1*10在该民族具有极强的连锁不平衡. 【关键词】 宁夏回族;HLA抗原;单倍型频率;遗传多态性 1 0引言 人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)系统位于6p21.3，是目前所知人类基因组中多态性最高、最为复杂的免疫遗传系统, 其研究已广泛应用于器官移植配型以及疾病相关性研究等领域. 由于HLA基因座具有高度的遗传多态性, 在不同种族、民族、不同地域的人群中, 其等位基因和单倍型的频率存在差异, 因此对于民族起源、进化、迁徙、融合等人类群体遗传学研究具有重要意义, 并且在法医学个体识别中也发挥着重要的作用,1-4,. 我们采用聚合酶链反应 序列特异性引物方法(polymerase chain reaction sequence specific primers, PCR SSP), 对宁夏回族自治区回族人群HLA A，B和DRB1基因座进行分析研究. 1材料和方法 1.1材料宁夏回族自治区122名健康、无血缘关系的回族个体, 其个体3代以上无与其他民族个体通婚史. 采集其外周血各2 mL, EDTA抗凝. HLA A，B，DRB1 分型试剂(美国PEL FREEZ 公司，美国GT公司). PE 9700型PCR仪. 1.2方法 1.2.1基因组DNA制备采用盐析法提取基因组DNA, DNA浓度为50,80 ng/L, 纯度为1.6,1.8. 1.2.2HLA A，B和DRB1基因座基因分型按HLA A，B，DRB1 分型试剂说明进行分型. 对模棱两可的结果采用第二家试剂进行分型，仍不出结果的进行测序分型. 遵循WHO下属HLA系统命名委员会规定, 2 按标准HLA命名法则低分辨判读等位基因, 分析分别得出HLA A，B和DRB1基因座基因型,并按HLA命名委员会公布的HLA 等位基因与其型对应关系将等位基因型转化为相应的表现型. 1.2.3Hardy Weinberg平衡检验采用χ2方法做吻合度检验,通过Arlequin 3.11软件计算χ2和P值, 检验水准设为0.05. 统计学处理:应用直接计数法统计HLA A，B，DRB1基因座基因频率. 采用最大数学预期值算法(expectation maximization, EM), 通过Arlequin 3.11软件计算HLA单体型频率，以频率大于1/1.5N (N为样本量)为观察到有意义单倍型,5,. 依文献,6,计算两基因座连锁不平衡参数，依文献,7,报道有意义两基因座单倍型正连锁不平衡参数. 不同民族HLA B基因座数据源自文献,3-4,8-11,，用Nei,12,方法以HLA B基因座基因频率数据计算不同民族间的遗传距离，将遗传距离导入Mega3.1软件, 根据邻接法构建Neighbor Jioning(NJ)系统发生树. 2结果 2.1HLA A，B和DRB1等位基因频率分布在122名回族个体中HLA A基因座中共检出14个等位基因,基因频率分布在0.004,0.299之间(表1), 其中高频等位基因分别为HLA A*02 (GF=0.299)，A*11 (GF=0.197)，A*24 (GF=0.176); HLA B基因座共检出29个等位基因, 基因频率分布在0.004,0.111之间, 其中高频等位基因分别为HLA B*35 (GF=0.111)，B*46( GF=0.0984)，B*13 (GF=0.082); HLA DRB1基因座共检出13个等位基因, 基因频率在0.0164, 3 0.1393之间,其中高频等位基因分别为HLA DRB1*15 (GF=0.1393)，DRB1*09 (GF=0.1311)，DRB1*07 (GF=0.1066). 2.2Hardy Weinberg平衡检验通过Arlequin 3.11软件进行HLA A，B和DRB1的吻和度检验, 其相应P值分别为0.9073，0.0800和0.3742. 表明本研究的回族群体的基因分布符合Hardy Weinberg平衡定律. 表1宁夏回族HLA A，B，DRB1基因座等位基因频率 2.3HLA A，B，DRB1单倍型频率及连锁不平衡参数可观察到163种HLA A B单倍型, 占单倍型理论总数的40.15%(163/406); 可观察到206种HLA B DRB1单倍型, 占单倍型理论总数的54.64%(206/377);可观察到588种HLA A B DRB1单倍型, 占单倍型理论总数的11.14%(588/5278). 观察到50，56，49种HLA A B，B DRB1，A B DRB1有意义的单倍型，表2为部分高频单倍型(HF?1.5%). 有39条HLA A B单倍型和52条HLA B DRB1单倍型正连锁不平衡, 其中HLA A*01 B*37, HLA A*30 B*13, HLA A*02 B*50, HLA B*31 DRB1*10具有极强的连锁不平衡(表3). 2.4聚类分析从系统发生树(图1)可见，回族与汉族的遗传距离最近，这两个民族先聚为一类后，再和蒙古族、维吾尔族、藏族、鄂温克族等少数民族聚为一大类.表2宁夏回族HLA常见单倍型及其频率(HF?1.5%)表3宁夏回族常见HLA单倍型及其连锁不平衡参数 3讨论 我们运用PCR SSP技术方法对宁夏回族人群的HLA A，B， 4 DRB1基因多态性进行分析, HLA A，B，DRB1基因座分别检出14，29，13个等位基因. HLA A基因座个体识别力为0.948, 多态信息含量为0.81,非父排除率为0.652; HLA B基因座个体识别力为0.985, 多态信息含量为0.94, 非父排除率为0.917; HLA DRB1基因座个体识别力为0.975, 多态信息含量为0.89, 非父排除率为0.816. 研究结果显示该民族的HLA基因座具有较高的遗传多态性. 以江西、广东、安徽、湖北汉族为南方汉族的代表,13-16,，以山东、甘肃、新疆、河南汉族为北方汉族的代表,17-18,，比较宁夏回族与不同地区汉族HLA基因座高频基因及基因频率的差异，其中HLA A基因座的高频基因及基因频率相差不大;HLA B基因座中高频等位基因HLA B*35 (GF=0.111)与不同地区汉族均有显著性差异; HLA DRB1基因座中DRB1*07 (GF=0.1066)与南方汉族差异较大. 我们共观察到50种HLA A B有意义的单倍型, 高频单倍型依次为HLA A*02 B*46 (HF=9.42%)，HLA A*11 B*60 (HF= 4.07%)，HLA A*02 B*51 (HF=3.83%);观察到56种HLA B DRB1有意义单倍型, 高频单倍型依次为HLA B*46 DRB1*09 (HF=6%)，HLA B*13 DRB1*07(HF=4%)，HLA B* 52 DRB1*15 (HF=2.90%), HLA B* 58 DRB1*17 (HF=2.90%); 观察到49种HLA A B DRB1有意义单倍型,高频单倍型依次为HLA A*02 B*46 DRB1*09 (HF= 5.32%)，HLA A*02 B*58 DRB1*17 (HF=2.46%)，HLA A*02 B*13 DRB1*12 (HF=2.38%). 但因缺乏其他民族HLA基因座单倍型的资料，尚无法运用单倍型进行民族起源与进化的研究. 5 连锁不平衡是HLA系统的遗传特征之一, HLA在不同种族中分布的差异，除表现在基因频率方面外，还表现在具有显著连锁不平衡的单倍型方面. 在本研究中HLA A*01 B*37(HF=0.82%, RLD=99.99%)，HLA A*30 B*13(HF=2.46%, RLD=99.99%), HLA A*02 B*50(HF=1.72%, RLD=99.99%), HLA B*31 DRB1*10(HF=0.80%, RLD=99.99%)在宁夏回族具有极强的连锁不平衡. 其中HLA A*01 B*37，HLA A*30 B*13, HLA A*02 B*50与南方汉族(江西汉族、安徽汉族),13-14,、北方汉族(山东汉族),17,、北美高加索人、北美黑人,19,相比均具有显著性差异. 我们用不同民族的HLA B基因座等位基因频率数据构建系统发生树，显示回族与汉族具有较近的遗传关系，我们认为这与历史上回族的形成有关. 我们的结果从分子生物学的角度印证了回族在形成独立民族的过程中与汉族发生大量的交融. 我们的结果表明宁夏回族人群HLA基因座的等位基因和单体型具有较高的遗传多态性,而且具有自身特点. 研究回族人群HLA单倍型资料为了解该民族的遗传背景、进化、起源提供帮助, 同时也丰富了中华民族的基因信息资源. 鉴于HLA单倍型遗传的特点，而目前国内少数民族HLA研究缺乏单倍型资料的现状，研究国内少数民族HLA基因座及单倍型多态性将是我们今后工作的重点. 【参考文献】 ,1, Shankarkumar U, Sridharan B, Pitchappan RM. HLA diversity among Nadars, a primitive Dravidian caste of south 6 India,J,. Tissue Antigens, 2003, 62(6): 542-547. ,2, Ivanova M, Rozemuller E, Tyufekchiev N, et al. HLA polymorphism in Bulgarians defined by high resolution typing methods in comparison with other populations,J,. Tissue Antigens, 2002, 60(6): 496-504. ,3, 康龙丽,张洪波, 高放, 等. 西藏珞巴族人群HLA A、B基 因座多态性研究,J,. 中华医学遗传杂志， 2005， 22(2):227-228. ,4, 张洪波, 高放, 康龙丽,等. 西藏门巴族人群HLA A、B和 DRB1基因座多态性,J,. 中华医学遗传杂志， 2005, 22(3): 344-346. ,5, Schipper RF, Oudshoorn M, D’Amaro J, et al.Validation of larger data sets, an essential prerequisite for data analysis: An analytical survey of the bone marrow donors worldwide,J,. Tissue Antigens， 1996,47(3):169-178. ,6, Lee J. The HLA system: A new approach,M,. New York: Springer Verlag，1990:141-151. ,7, Müller CR, Ehninger G, Goldmann SF. Gene and haplotype 7 frequencies for the loci HLA A, HLA B, and HLA DR based on over 13000 German blood donors,J,. Hum Immunol, 2003, 64(1): 137-151. ,8, 沈春梅，朱波峰，李生斌.内蒙古地区蒙古族HLA A,B, DRB1基因多态性研究,J,.遗传,2008,30(2):164-168. ,9, 康龙丽,高放,张洪波,等. 西藏珞巴族HLA DRB1基因多 态性,J,，中南大学学报:医学版, 2005,51(2):135-139. ,10, Chen SW, Hu QS, Xie Y， et al. Origin of Tibeto Burman speakers: Evidence from HLA allele distribution in Lisu and Nu inhabiting Yunnan of China,J,. Hum Immunol, 2007,68: 550-559. ,11, 邱小萍， 谭云， 左泽华，等. 湖北土家族人群HLA A、 B等位基因及单倍型多态性的分布,J,. 中华医学遗传杂志， 2006, 23(2), 219-221. ,12,Nei M. Molecular Evolutionary Genetics,M,. New York: Columbia University Press, 1987:197,210. 8 ,13, 程良红,吴国光,李兴茂,等. 2210例江西籍汉族骨髓供者的HLA A、B、DRB1等位基因和单倍型频率,J,.临床输血与检验，2006, 8(1):5-9. ,14, 高素青, 吴国光, 李兴茂, 等. 安徽汉族HLA A、B、 DRB1 基因多态性和单倍型的分布特征,J,. 临床输血与检验, 2005, 7(3):161-165. ,15, 朱远雁,尹平,沈钢, 等. 湖北汉族人群HLA A、B、DRB1 基因多态性研究,J,.公共卫生与预防医学,2006,17(6):11-13. ,16, 马红京,肖露露,郭坤元, 等. 广东汉族人群HLA ABDR 基因频率分析,J,. 广东医学,2005,26(3):324-326. ,17, 宋永红,马春红，吕红娟, 等. 中国北方汉族人群HLA 基 因多态性研究,J,. 山东大学学报:医学版, 2007,45(6):546-549. ,18, 赵磊, 张伯伟, 马茹, 等. 河南、甘肃及新疆造血干细胞捐献者HLA基因频率,J,. 中国输血杂志, 2007,20(1):26-29. ,19, 谭建明, 周永昌, 唐孝达. 组织配型技术与临床应用,M,.北京: 人民卫生出版社, 2002:680-695. 9