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免疫性血小板减少症糖皮质激素受体表达调控及其与激素抵抗相关性的研究

2017-12-27 40页 doc 66KB 23阅读

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免疫性血小板减少症糖皮质激素受体表达调控及其与激素抵抗相关性的研究免疫性血小板减少症糖皮质激素受体表达调控及其与激素抵抗相关性的研究 免疫性血小板减少症糖皮质激素受体表达调控及其与 激素抵抗相关性的研究 免疫性血小板减少症糖皮质激素受体表达调控 及其与 激素抵抗相关性的研究 马亮亮 计:学位论文:页 表 格: 个 插 图: 幅 指导教师:方美云教授 申请学位级别:博士学位 专业名称:内科学血液 论文提交日期:年月 论文答辩日期: 年月 学位授予单位:大连医科大学 学位授予日期:年月 评阅人: 答辩委员会主席:独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进...
免疫性血小板减少症糖皮质激素受体表达调控及其与激素抵抗相关性的研究
免疫性血小板减少症糖皮质激素受体达调控及其与激素抵抗相关性的研究 免疫性血小板减少症糖皮质激素受体表达调控及其与 激素抵抗相关性的研究 免疫性血小板减少症糖皮质激素受体表达调控 及其与 激素抵抗相关性的研究 马亮亮 计:学位论文:页 表 格: 个 插 图: 幅 指导教师:方美云教授 申请学位级别:博士学位 专业名称:内科学血液 论文提交日期:年月 论文答辩日期: 年月 学位授予单位:大连医科大学 学位授予日期:年月 评阅人: 答辩委员会主席:独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地 方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 与毛毛 学位论文作者签名: 签字目期: 也年三月兰日目 录 第一部分免疫性血小板减少症患者糖皮质激素受体亚型表达及与激 素抵抗相关性的研究? 中文摘要英文摘要前言? 日舌? 材料与方法? 结果? 讨论 结论? 参考文献第二部分热休克蛋白 及转录因子 、与糖皮质 激素抵抗相关性的研究中文摘要英文摘要前言? 日舌? 材料与方法? 结果? 讨仑 结论? 参考文献??第三部分淋巴细胞功能变化在发病中作用的初步研 究“”中文摘要英文摘要?? 日舌? 材料与方法? 结果??一讨仑 结论? 参考文献综述 一综述正文? 二参考文献 村勇匙 致谢.?免疫性血小板减少症糖皮质激素受体表达调控及其与 激素抵抗相关性的研究 博士生姓名:马亮亮 指导教师:方美云教授 专业名称:内科学血液 第一部分 .弟一首佟分 免疫性血小板减少症患者糖皮质激素受体亚型 表达及与激素抵抗相关性的研究 摘要 目的: 探讨初治成人原发性免疫性血小板减少症患者外周血单个核细胞 糖皮质激素受体亚型仪、、丫和的表达及与糖皮质激素 抵抗的关系,为逆转抵抗及实现的个体化治疗提供线索及依据。 方法: 连续选取年月~ 年月大连医科大学附属一院血液科住院初治 患者例女性例,男性例,中位年龄岁,健康对照者例女 性例,男性例,中位年龄岁为研究对象。其中例患者接受了 治疗,根据疗效分为敏感组例女性例,男性例,中 位年龄岁和抵抗组例女性例,男性例,中位年龄岁。 .采集晨空腹肘静脉血,采用密度梯度离心法分离。应用 实时荧光定量 染料法检测患者和正常人、、脚和 的表达。比较患者组与正常组,组和组亚型表达的差异。分 析患者组和正常组,组和组四种受体亚型总和组间表达差异。 .分析各受体亚型间及与患者病初血小板水平的相关性。 .采用 方法检测患者组例、组例和正常人 组例中和蛋白的表达,并比较组问差异。 结果: 患者组和正常组亚型表达为非正态分布数据,用中位数四分位数间距 表示,其中患者组表达差异大于正常对照组。 .患者组种亚型总和为..?.,显著高于正常人组..?..,其中和 的表达较正常 组有显著升高 尸.,患者组 为....,正常组为....; 为....,正常组为....。组和 患者组 组种受体亚型总和无显著差异。王、小含量较低,在部分患者无法测 表达无显著差异。 出。患者组与正常组?和. 的表达均无显著差异 .组和组、.、和 胗.,但在组为. ...,组为..?.,在 组呈升高趋势;脚在组为..?.,组为..?., 在组呈升高趋势。 .患者.表达与、.与.、.与?表达均呈正 相关尸.,其中与相关性及相关系数最大.,.。 其它受体亚型之间及各受体亚型与病初血小板水平无明显相关性。 .组蛋白显著高于组尸.,组、组分别与 正常组比较无显著差异。.蛋白在组间均未测出。 结论: .患者的受体亚型数据范围较大,而正常人亚型表达相对稳定,数据范 围较小,提示患者的亚型可能受多种因素调控,且是一种异质性疾病。 .初治患者存在表达上调,以和;.升高为主。 .患者抵抗与蛋白的表达成负相关,可能与脚成正相关。 含量极低,在蛋白水平未检测出,提示患者的抵抗与 .. .无关。 与 市关性及相关系数最大,为正相关,结合 . 在敏感组呈升高趋势,蛋白在敏感组显著升高,推贝.可能介导 效应,有待进一步扩大研究。 关键词:糖皮质激素受体 糖皮质激素抵抗 免疫性血小板减少症 : : :: ,,. ,忱 ,, ?,, . : ,,, . , , . ,,丫 .. . . :., 尸?; 丫 . ,【,.脚 .,【, . ... . .... 丫....?.. ,. ?, ,; ; . . . 伊.,: , .. , . . : 第一部分 弟一剖分 免疫性血小板减少症患者糖皮质激素受体亚型 表达及与激素抵抗相关性的研究 月 吾 成人原发性免疫性血小板减少症 ,为血液系统 的常见病,发病率约为?/万人口,多见于青年女性,是一种自身免疫性疾病, 由于机体对血小板相关抗原发生免疫反应,产生血小板抗体,导致单核巨噬 细胞 系统吞噬破坏血小板过多,从而引起血小板减少的出血性疾病。病因与机体 免疫 内环境平衡紊乱密切相关。 糖皮质类固醇激素,是治疗的首选药物,%一%患者 通过治疗能够取得满意疗效,但%.%患者表现出对反应不敏感,称 为抵抗。因为治疗常引起较多的不良反应,如骨质疏松、股骨头坏死、高 血糖等,对于抵抗的患者,如果盲目加大剂量、延长疗程,不仅无效而且副作 用加大。因此,研究抵抗的发生机制,对探索抵抗型患者的个体化治疗是 十分重要的。 需要与受体 ,结合,才能发挥其生物学效 应。近年来研究发现及其亚型表达的差异可能影响效应。基因位于人 号染色体的长臂.,具有个高度保守的外显子,其中编码区是~号 外显子。目前已经发现的亚型有种:、、、研、和 ?。对外显子选择性的剪接生成 和,并翻译成两种不 同的受体蛋白和。与 在一级结构氨基酸同源,之 后存在差异。 【区域由外显子 【编码, 则由外显子 编码。年等描述了另一种亚型:。由于可变剪接, 到号外显子与部分号内显子组成剪接体,合成的产物即为,该亚 型不含有配体结合域。 年等峙艮道在号与号外显子之间插入一 个编码子可合成另一受体,占的%左右,认为它可以降低 的转录活性。除了可变剪接产生的亚型之外,等发现可变翻译也可产 生不同的亚型。由于核蛋白体的扫描机制缺陷,将同一的转染进 一细胞,可分别从第位甲硫氨酸和第位甲硫氨酸密码子开始翻译,这种 和 可变翻译的结果是分别产生 ,二者含量相等,而后者的激活转录作 用高于前者倍,而抑制炎性转录因子转录活性的效果相似。 图 矾耵斌泊 翻转姻 懒赢洒 静 斟鳓谢。啦嘴 嫡 宰啦。耐腿蝴敢丫 ./娥 一鞠 ? 铸譬:。 殛酌漱 靛扪蝴 :嫩哟 图:基因剪接及亚型示意图摘自文献 普遍存在于除红细胞以外的各种细胞中,具有低结合容量、高亲和力、可 饱和性及可逆性的特性。有个主要结构域:氨基端的免疫原反应区,含有主要 的反式激活功能区,为非保守区域;中间较短部分高度保守,是与靶基因的糖 皮 质激素反应元件 ,结合的结合区 ,,也参与受体二聚体形成;羧基端为配体结合区 ,,在结构上高度保守,可结合,并在结合之前与热休克蛋白 等伴侣分子结合,以维持的稳定性和与配体的高亲和力【、。 与的结合是发挥抗炎和免疫抑制作用的前提条件,因此对于抵抗 机制的研究,近年来研究的热点集中在上,在多种疾病的研究中发现亚型表 达量的异常与效应相关,但结果并不完全相同。报道较多的为和,多 认为占主导地位,占的%左右,是介导作用的主要成分, 仅占总 的.%左右,但在某些疾病状态下表达增加,它位于细胞核, 不具备与结合的能力,多认为是效应的负调控因子【?。等四对儿童急 性淋巴细胞白血病 ,骨髓及细胞系研究发 现 、蛋白在前.组明显升高, 降低, 与?组比较有显著差异。蛋白在各组问无差异。体外将醋酸泼尼松与原代 培养的细胞或细胞系共培养后检测细胞凋亡,发现/与凋亡细胞 数成负相关,提示、/的异常与抵抗密切相关。部分对支气管哮喘 的研究发现和/或/与抵抗呈正相关,与抵抗无明显相关 。 等 采用普通方法检测了例敏感例抵抗的系统性红斑 狼疮 ,患者 发现敏感组表达 显著高于抵抗组。 但也有研究认为抵抗与、表达量或两者比值无关。等【?、 等【对患儿研究均未发现、及总蛋白与抵抗相关。 年等对例哮喘患者的研究也未发现抵抗与、及 /【有关【,与等报道相刚。 和脚于世纪年代末发现,关于它们与抵抗相关性研究近几年才 有少数报道。.等【】对多发性骨髓瘤 ,敏感 细胞株.和耐药细胞株. 检测发现, 与抵抗呈正相关。等【应用流式细胞仪检测细胞系的凋亡,发现 与凋亡细胞数呈正相关。但应用实时荧光定量.检钡患儿 表达,未发现与效应相关。因此推提高敏感性的作用可能 具有细胞特异性。等检测例敏感和例抵抗患儿骨髓单个核细 胞脚的表达,发现敏感组表达显著减少。而有学者 用同样的方法检测 例患儿骨髓单个核细胞丫,未发现与抵抗具有相关性。 以上研究结果存在差异,提示抵抗与亚型关系在不同疾病中以及同一疾 病的不同状态可能存在不同。目前对的研究多集中在儿童、哮喘和等 疾病,国内有少数几篇关于亚型与患者抵抗相关性的报道,但病例数较 少,且只涉及和两种亚型,并且采用的是普通和免疫组化的方法,研 究发现抵抗与呈相关,与表达量无关【、引。阐明患者抵抗的 分子机制具有重要意义:可预测患者对的敏感性,有助于开展个体化治疗。 有助于判断预后。为逆转抵抗与开发新的治疗途径提供线索与依据。因此 本研究拟应用?的方法检澳敏感组和抵抗组患者 、、 和 的,应用 方法检测【和蛋白表达,旨在从分子 和蛋白水平揭示患者亚型表达及其与治疗效应的相关性。 材料和方法 .研究对象 例初发患者均为我院年月~年月住院病例,诊断均符 合 年成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识川。其中例患者 接受了治疗,根据疗效分为敏感组组例和抵抗组 组例。定义:醋酸泼尼松足量治疗周治疗剂量..~.。后, 血小板/;定义:醋酸泼尼松足量治疗周治疗剂量..。 .。后,血小板/。正常对照组例均来自大连市中心血站健康献血 者。患者组和正常组,组和组年龄、性别构成无显著差异尸.。 所有的患者及正常人在检测前周,无感染性病灶,并未服用过糖皮质激素或 其 它免疫抑制剂。研究对象基本特征见表、。 表:患者和健康对照者基本特征 注:年龄和血小板数均以中位数范围表示。 表:组和组患者临床特征 注:年龄和血小板数均以中位数范围表示。 .外周血单个核细胞的分离 抗凝收集患者及健康志愿者晨空腹肘静脉血,采用密度梯度 离心法当日分离,具体操作如下: . 离心,收集血浆,分装于管中,每管,.。冻 存,留待后续检测。 .加入对倍稀释剩余血标本。 .离心管中加入淋巴细胞分离液,将稀释血以:的体积比沿管壁缓慢 加入到 分离液液面。 . 离心,小心吸出中间白膜层,转移至新离心管中。 .加入,吹打混匀,离心。 .弃上清,再加入混匀,离心洗涤次。 .细胞计数后,分装于管中,每管个细胞左右,.?冻存备 用。 .实时荧光定量检测、、和 .总提取所有用具均需经.%的水?浸泡以上并 ?高压灭菌,液体试剂由.%的处理水配制。 。 细胞离,? 弃上清,加入 后,反复吹吸至裂解液中无明显沉淀,室温放置 , 使其充分裂解。 加入氯仿,盖紧离心管盖,用手剧烈震荡秒混匀,待溶液充分乳 化后无分相现象后,再室温放置。 ?离心. 小心取出离心管,吸取无色上清液,转移至另一新的管中,约。 。 向上清中加入等体积的异丙醇颠倒混匀,室温下静置 。离心,弃上清,可见无色透明的沉淀。 缓慢沿离心管壁加入 %乙醇,轻轻转动洗掉管壁的异丙醇。 。 离心,小心尽量除弃乙醇。 室温干燥. 加入适量的处理的水溶解沉淀,必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀,使 沉淀完全溶解。 检测浓度和纯度:取“样品在紫外分光光度仪上测和 吸光度值值,并根据/吸光度比值鉴定纯度/在.. 之问,较纯。读取浓度。所提取的总经.%琼脂糖电泳鉴定,应 见明显的、条带。 . 合成 按反转录 试剂盒说明操作。 配置的反应体系在冰上进行。分别加入以下试剂: 木固. 补齐至总体积 反转录: ?;?秒。产物置于一?保存.实时荧光定量. 按 试剂盒说明操作。 引物设计及合成、、和丫引物设计参照文献, 引物为大连宝生物公司设计,所有的引物均为大连宝生物公司合成 表:扩增、、、和内参引物序列和产物片段长度 配置反应体系在冰上进行,具体如下: 灭菌蒸馏水 上游引物 下游引物 .模板 ? 避光 混匀后离心秒,上机应用实时荧光定量仪进行扩增及检测。 扩增程序 。 秒 预变性: ?/秒 反应:?秒 ?/秒 ?秒 ?/秒 熔解曲线分析:?秒 ?/秒 ? ?/秒 ?秒.?/秒 冷却:? 结果分析 反应结束后确认 的熔解曲线和扩增曲线,分辨目的产物与非特 异产物及引物二聚体,并取 产物和“的×上样缓冲液混合后上样,于.% 琼脂糖凝胶上电泳验证。反应结束后,电脑自动分析荧光信号并将其转换为 值。 目的基因 的相对定量用。??‘表示待测标本目的基因的值一待测标 本内参基因的值.品目的基因的值一标准品内参基因的值 每一标本的检测各重复两孔,取两复孑检测的平均值,同时做阴性对照,质 控监测,保证实验准确。 . 方法检测外周血的和蛋白 .外周血总蛋白提取 取约×个,加入裂解液,加,使的 终浓度为。 用移液枪反复吹打,使裂解液和细胞充分接触。冰上裂解,每隔, 漩涡振荡器剧烈振荡秒。 。 ,小心吸取上清转移至另一管中,即为细胞总 离心 蛋白样品。试剂盒测定蛋白浓度具体见试剂盒说明。取蛋白和 上样缓冲液以:体积混合后煮沸使蛋白变性,待冷却后可用于加样。剩余 蛋白冻存于.?。 . .凝胶电泳 组装电泳槽模具。 配置分离胶和浓缩胶。 表: %的分离胶和%浓缩胶配制 将分离胶灌注进两层玻璃板之间的夹层,轻轻在分离胶上覆盖一层无水乙醇 压平。凝胶聚合.后,侵斜倒出,滤纸吸干,注入浓缩胶。干净的梳子插 入凝胶内,室温放置?。 将制好的胶连同其装置放入电泳槽内,在电泳槽内加入电泳缓冲液,小心 拔出梳子,电泳液冲洗梳孔。用微量加样器缓慢加入蛋白样品和蛋白。 将电压调至,当染料进入分离胶后,将电压调至,继续电泳直 到溴酚蓝到达分离胶底部,断开电源停止电泳。整个电泳过程在冰上进行。 .转膜 转膜缓冲液。预冷备用。电泳近结束时,剪张与凝胶尺寸相近的滤纸、 张膜,膜浸泡在 盛有甲醇的平皿中约秒后,和滤纸、海绵垫浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒 中。 电泳结束后,小心取下凝胶,浸泡于转膜缓冲液中,在转膜缓冲液中将转 膜夹子打开,从负极到正极按照海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵垫顺 序铺垫。将膜与凝胶对齐,注意清除各层的气泡。 将夹子夹紧。放入电转槽中。使夹子的黑面对槽的黑面,夹子的白面对槽 的红面。缓慢倒入约转膜缓冲液。 将电转槽放在冰水盒中。接上电源。根据蛋白分子量来调节工作电流和转 膜时间。 转膜结束后,断开电源,拆卸转膜夹子,逐一掀去各层。将膜用×丽春红 染色,用水冲洗次,观察蛋白转印是否完全。 .免疫反应 封闭:用镊子将膜移至含有封闭液的平皿中,用脱色摇床室温缓慢摇 匀。 一抗孵育:根据预染显示的分子量,在相应的范围内,将含有目的 蛋白的区域剪下,放入预先准备好的含一抗的杂交袋中,封闭液稀释兔抗人 单克 隆抗体:,,,或兔抗人单克隆抗体:, ,,,封好袋口,置于平皿上,。过夜。 次日室温下用在摇床上洗次,每次。 在封闭液中按:比例加入标记的山羊抗兔:,北京 中杉金桥,将膜置于其中,室温下摇床缓慢摇匀.。 室温下用在摇床上洗次,每次。 .显影和定影 避光下,将 显色液的液和液在管内等体积混合,根据膜 的大小来确定显色液的量,将膜与显色液充分接触。 反应后,吸去膜上残余液,将膜转移至一干净保鲜膜上,包好,放入 压片夹中。 暗室中剪一张比膜尺寸稍大的光片,打开压片夹,将光片放在膜上。 关上压片夹,开始计时。 根据荧光强弱调整曝光时间。曝光结束后,打开压片夹,将光片迅速 。 浸入备好的显影液中 。 显影结束后,用水冲洗光片,放到定影液中 用水冲洗去底片上残留的定影液,晾干。 根据条带颜色的深浅及其与内参的相对比值判断蛋白的表达量。将胶片进 行拍照及灰度扫描,用凝胶图像处理系统测定目的条带的相对光密度值 ,,进行组间统计学分析。 .统计学分析 采用.统计软件进行分析,符合正态分布,方差齐性的数据采用单因 素方差分析,结果以均数士标准差?表示。对于非正态分布数据,采用 . 非参数检验,结果以中位数%一%表示。对于非正态分 布数据,行相关分析。以值.为具有统计学意义的标准。 结果 .纯度和完整性的鉴定 提取的经.%琼脂糖凝胶电泳鉴定,可见明显的 矛 条带,即 保持良好的完整性图。紫外分光光度法检测结果显示,待测样 品/的比值为.?.之间,提示提取的较纯。 ? ? 图:电泳图 .产物的鉴定 扩增产物均为单一特异性产物。熔解曲线示单峰,无引物二聚体生成图。 .%的琼脂糖凝胶电泳可见产物在目标位置,无杂带生成图。?, 日?,‘?\? 娜曲船嘲 ??盘,???\々 &自藩 :、、 熔解曲线图 口 印 如柏如加巧? 图:产物的琼脂糖凝胶电泳图 :;:参基因;:;:;:;;:性对照 . 的表达水平 患者与正常人中、、?和 由表、图可见患者组受体亚型表达个体差异较大,而正常组差异较小。 的表达均高于正常组,差 为主要受体亚型。患者组 和 异有统计学意义尸.。、、含量较低,患者组例中有例, 脚有例,有例未测出,正常人组例中有例,丫有例, 有例未测出。患者组与正常组脚和?表达量无统计学差异。 表达水平比较 表:患者和正常人、、和 木为组问有显著差异尸.。 注:结果以中位数%~%表示, ? .. ? 苎 ?..?? 兰 《叱一比 患者组 正常组 , 一 。兰时 ? 兰们 ;竺《叱 芷。 :.《叱叱 患者组 正常组 患者组 正常组 图: 患者组和正常组、、脚和 的相对表达量。:;:; :脚;:,其中、组间有统计学差异。横线代表中位数。 的表达与患者抵抗的关系 .、、和 的表达均无显著差异.。 组和组、、脚、 但由表、图可见 的表达在组呈升高趋势,脚在组呈 降低趋势。的表达水平比较 表组和组、、聊和 注:结果以中位数%~%表示 量 . 船 上 竺 ? ?? ? .《世 。孵一。《叱?叱 组 组 叱 组 组 ?柏 ..? ?协. 上 .. 约 ?? 。?一.《叱 里《叱 叱 组 组 叱 组 组 图:组和组、、和 的相对表达量。:;.; :;:,组间均无统计学意义。横线代表中位数。.四种受体亚型总和比较 将患者种受体亚型相对定量值相加,比较发现患者组受体亚型总和显著 高于正常人组尸.。组和组无显著差异。 表、图 表: 总和组问比较 、、脚和 注:结果以中位数%~%表示,木为组问有显著差异.。.... ‘兰仂 疗 丘 :舭 × ‘【 ‘ 匕 口匕目 自 匕 口匕 组 组 。 患者组 正常组 图: 四种亚型受体总和组间比较,患者组与正常组有统计学差异.。 横线代表中位数。 亚型之间及与病初血小板水平相关性分析 .、、脚和 均呈正相 患者与 、与 、与 关尸.。其中与相关性及相关系数最大.,.。其它受体 表 亚型之间及各受体亚型与病初血小板水平无明显相关性。 】表: 患者组各亚型之间及与病初血小板水平相关性分析 注:结果以相关系数/值表示, 奉为组间有显著差异氏.。 . 方法检测外周血的和蛋白的表达 患者和正常人 与蛋白表达相关。检测例敏感患者、 例抵抗患者和例正常人和蛋白,结果显示蛋白在 组、 组表达为.士.,组为.:.,正常组为.:.。 正常组蛋白均显著高于组沪.。组和正常组蛋白表达无 图 明显差异。蛋白未检测出。 正常 敏感 抵抗 【 内参 图:仅蛋白的表达 讨论 在对、、哮喘【、、、、溃疡性结肠炎网、克罗恩病‘明和、 删等许多需要以为主要治疗药物的疾病研究中发现抵抗与亚型失衡有 关。大多数研究发现为介导作用的主要成分,与位于细胞质的 结合后,迅速转位进入细胞核,作用转录因子直接或间接调控靶基因的转录, 从 而发挥其抗炎、免疫抑制等生物学效应,则位于细胞核,不具备与结合 的能力,有抑制活性的负性调节作用。但也有部分研究认为抵抗与 亚型无关。是治疗的一线药物,患者抵抗的机制目前并 不明确,是否也与亚型失衡有关国外尚无报道。国内有少数几篇关于、 与患者抵抗相关性的研究发现抵抗与呈正相关,而与 无明显相关性、。我们的研究发现患者组和组和 的表达均无统计学差异,但组 的表达呈上升趋势。在蛋白水 平的检测发现蛋白在组的表达较组显著升高.。提示患者的抵抗与密切相关。 分子水平未发现统计学差异推测可能与两组 研究病例数不同及翻译蛋白的过程中可能还存在很多调控机制影响蛋白 表达较低,患者组例/例,正常组 的表达有关。本组研究发现 例/例均未检测出。蛋白水平未能检测出蛋白。提示可能与患 仅占的.%【。等【、 者的抵抗无关。有报道 含量仅为 的/./。等 掣、掣发现 。应用 方法 【在过敏性皮炎患者中也未检测出 等【 在患者,】在骨骼肌细胞中均未检测出蛋白。因此推测 由于含量极微,可能与患者的抵抗无相关性。 关于丫和与抵抗的相关性研究较少且主要集中在,研究结果并不 一致。有研究认为丫可能降低【的转录活性【。等【】发现敏感组 患儿骨髓单个核细胞脚减少。掣对例初发儿童研究中则 发现 ,蛋白、 ,/与抵抗无关,但 与抵抗有关。等【用同样的方法研究患儿,未发现?与抵抗具 有相关性。本组研究发现组组的患者丫虽无显著差异,但组 呈升高趋势。提示患者的抵抗可能与脚有关。 在敏感组患儿中 占 %左右【】。等报道 明显高于抵抗组。而等】同样对儿童研究中未发现敏感和抵抗组间 与 表达的差异。我们的研究结果与后者一致,未发现 抵抗具有相关性。但患者种亚型相关性分析显示与、与 均呈正相关尸.。其中与相关性及相关系数 、和 最大.,.。结合 在敏感组呈升高趋势,蛋白在敏感 组显著升高尸.,推贝可能介导效应。未发现统计学差异可能与 组病例数较少有关。由于目前尚无商业化的?单抗出售,因此无法从蛋白 水平验证。 本组研究发现患者组 水平显著高于正常人组,且 和 患者组种受体亚型总和也明显升高伊.,这与部分学者在类风湿关节炎、、 鼻息肉 和患者的检测一致,认为它可能参与了的发病过程。有学者用 放射性配体检例重症肌无力患者,发现治疗前数越高,疗效越好。研究 、.等可通过活化转录因子,包括.、. 发现某些促炎细胞因子. 等,作用于基因上游的转录因子结合位点而上调表达水平,因此患者水 平可能高于正常。患者很可能在发病后表达升高,使生理剂量的发挥更 大作用,引起淋巴细胞凋亡增加。在对的研究中发现,作用后会下 调 蛋白的表达,的这一负反馈调节可以保护机体免受激 、、 。 素过度作用 本组资料显示初治的成人患者种受体亚型表达的个体差异较大, 数据范围较广,而正常人亚型表达相对稳定,个体差异较小,提示患者的 亚型可能受多种因素调控及是一种异质性的疾病,临床上需要个体化治疗。 综上所述,我们的研究发现,患者病初受体,尤其是和较正 常人明显升高;患者对的抵抗与表达下调有关,可能与脚表达上调, 表达下调有关,与表达无明显相关性,该现象值得进一步扩大深入研究, 有助于了解的发病机制、抵抗机制,为的早期预警、治疗预后分析及 逆转抵抗提供线索。抵抗是一个多因素影响的复杂现象,可能还存在其他机 制,与的结合力、的基因突变以及基因多态性、炎性细胞因子的改变 等均会影响靶器官或靶细胞对的敏感性。而不同疾病或者同一疾病的不同阶 段, 可能其中的一个或几个因素占主导地位,不能一概而论。因此,对不同疾病患 者 抵抗机制的研究,将最终有助于耐药问题的解决。 】结论 .患者受体亚型表达个体差异较大,而正常人亚型表达相对稳定,个体差异 较小,提示患者的亚型可能受多种因素调控,且是一种异质性的疾病。 与 .患者病初显著升高,以【和升高为主, 脚和 正常人无显著差异。 的表达在组 .分子水平检查虽然未发现、、和 和组有统计学差异,但在组表达呈升高趋势,在组表达呈 下降趋势,提示抵抗可能与、脚有关。 .抵抗与蛋白表达下降有关,提示与效应成正相关。 含量极低,在蛋白水平未检测出,提示患者的抵抗与 . 可能无关。 .患者的与、与、与脚均成正相关。。其中 在 与 关性及相关系数最大.,.,结合 敏感组呈升高趋势,蛋白在敏感组显著升高,推可能介导效应,值 得进一步扩大深入研究。 参考文献 . ? , , , ? . ?.; :., , . , . ; . : . . , : ? .; : . . , , , .. ; , , : .. . . , , , . ;:?. . . , , , ?. ; :?.. , , . “” ..; :? . , . : . . ;: , ,? , . , , , ..? . ,;: , , , , . , , . . ;:?.. . , , , , . ;: ?. , . , , , , . .;:?. .钱小顺,朱元珏,许文兵,等.哮喘患者外周血单个核细胞中热休克蛋白和糖 皮质激素受体 的表达.中华结核和呼吸杂志;:... . , , , ,. ;:?. . , , , , , . , . ? . ; : . , , . , 【: . ;:?. . . , , , , . ; :?.. . , , ,,. ; :?. . . . , , ;:?. . . , , , , , . ; : ?. . , , ,.? .; :?.,, , . . 币;:?. . .赵艳红,周晋,李晓霞,等。糖皮质激素受体与特发性血小板减少性紫癜者激 素抵抗的相关性. 中华内科杂志;:?. .朱琦,程益敏,叶为德,等.特发性血小板减少性紫癜患者激素敏感性与糖皮 质激素受体亚型 的关系研究.血栓与止血学;:?. .侯明等.成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识修订版.中华血 液学杂志 ;:?. . . , , , , ,. ?. ; :? . . , , , , , , . ? . ; : . , , , , , . .? ; :?. . , , , , . ’., ; :?. . , , , , , , . . ;:?. . . , , , . ::?., , , . , .: ?. . ; , , . , , , , . . . ; :? . . , , , . ;:?. . , , , , , , . ? . ;:?. .朱晓华,高恰,杨毅.糖皮质激素自我诱导在白血病细胞激素耐药中的作用. 中华血液学杂志 ;:?. .李波,白祥军,王海平.地塞米松对人单核细胞糖皮质激素受体蛋白表达的 影响.中华急诊医 :.. 学杂志; 第二部“ 弟一矧 热休克蛋白及转录因子 、与糖皮质 激素抵抗相关性的研究 摘要 目的: 探讨原发免疫性血小板减少症患者糖皮质激素受体分子伴侣热休克蛋 . 白、核转录因子一 和激活蛋白..表达特点及 与激素疗效、部分临床指标的相关性。 方法: 连续选取年月 年月大连医科大学附属一院血液科住院初治 患者例,健康对照者例为研究对象。 .抽取晨空腹肘静脉血,采用密度梯度离心法分离单个核细胞。 , 采用实时荧光定量方法检测患者外周血单个核细胞 比较组问差异。将患者按糖皮质激素治疗效应分为敏感组和 抵抗组,再按年龄、性别、病程和病情进行分亚组比较。 .例患者和例正常人前期已进行 检测,其中组 例、组例,分析 /在患者组和正常组间的差异及与效应 的相关性。 .分析患者 表达量与病初血小板数、骨髓巨核细胞数及血小 板抗体的相关性。 .应用 方法检测例敏感患者、例抵抗患者和例 正常人核蛋白/. 和./.蛋白表达,比较组间差异。 结果: .例患者 中位数为....,例正常人为 ..?.,正常人表达较患者有升高趋势,但两组无统计学差异胗.。 .成人急性患者 表达显著高于慢性患者尸.。 组表达较组有升高趋势,但无统计学差异尸.。再按性别、年龄和病 情分组比较,可见女性较男性患者,年龄?岁较年龄岁患者,轻型较重型 患者, 均有升高趋势,但亦无统计学差异尸.。 .患者组较正常组 呈升高趋势,/呈下降趋势 尸.。组和组 的表达和/均无显著差异 .,但/在组呈升高趋势。 .患者 表达量与病初血小板数、骨髓巨核细胞数及血小板抗 体无明显相关性。 ./. 在组表达显著高于组俨.,在正常人组的表 达亦显著高于组.,组和正常人组的表达无显著差异。?蛋 白的表达组问无显著差异。 结论: .患者 表达较正常人组呈下降趋势,结合第一部分研究患 者 表达显著高于正常组,提示 可能介导效应。 . 与患者病程密切相关,急性期患者表达下降,且男性、 高龄、重型、慢性患者较女性、低龄、轻型患者 表达均有下降趋势, 而前者均易发生抵抗,提示与疗效可能成正相关。 .. 高表达与抵抗有关。一可能不介导的效应。 关键词:热休克蛋白 核转录因子. 激活蛋白一 糖皮质激素抵抗 免疫性血小板减少症. ., ? .: , ’.?. .. . : . ,,, ,.. /? ./一 , : / .. / .户..; ; ., . .. 护.,.. : . . 【 . /. .,?/ .? : 一第二部分 弟一首分 热休克蛋白及转录因子 、与糖皮质 激素抵抗相关性的研究 刖 舌 热休克蛋白 ,是细胞质内最活跃的分子伴 侣,通常和其它分子伴侣、等形成蛋白复合体并作用于靶蛋白,在 存在条件下,作为复合体的核心促进靶蛋白活化或稳定其构型。此外, 还能参与细胞信号转导、周期调控和蛋白质的降解及转运等。它以分子伴侣 的形式与糖皮质激素受体 ,结合,在细胞信号转导中起 重要作用。目前已经发现的伴侣蛋白除外,还有、、 、 一一 、一一 一 、一和。但 / 、、一 是含量最高也是最主要的一种。 有两个富含负电荷区域:一个位于中央铰链区,参与和等靶蛋白 的结合,该区还有核定位信号,可能参与的胞浆.胞核穿梭;另一个位于.末 端区,这一区域的电荷分配与双螺旋中的磷酸基团相似,可以 与及一些结合蛋白相互作用。一末端功能区有二聚化区域及钙 调蛋白结合,该区也参与和及肌动蛋白的结合。在没有糖皮质激素 ,作用时,、等伴侣蛋白与胞浆内结合,使其 形成“袋状”结构,此时的虽然不能与细胞核内的结合来调节转录,但 可以让其维持在一个能以高亲和力与结合的状态中,作用后 可促进活化的向核内转运;在核内与解离后,后者方能与糖皮质激素反应 元件 ,结合,介导发挥相应的作用如 图所示。 馥 \、 ‖ 匦 岭\瞒 国姒 争 啦 。研,. ?:呶嘲 哟 一。? 图:等伴侣分子与的结合与效应摘自文献 鉴于在.复合物的形成和功能发挥等方面起重要作用,推测其 可能介导的药理效应。因此与抵抗的关系成为近几年研究的热点。 已报道在哮喘、肾病综合症等疾病的发生、发展过程中发挥重要作用。 、 欧阳涓等【引、刘同强等【均报道抵抗的肾病综合征患者 蛋白较敏感患者表达明显增高。掣发现家族性抵抗患 者表达增高。在对多发性肌炎/皮肌炎患者【的研究中也发现敏感和抵 抗组 显著高于正常对照,并且抵抗组显著高于敏感组。以 上研究提示高表达可能会干扰与的结合,影响患者对的治疗 反应,是治疗失败的原因。 但也有研究认为,的水平与效应无明显相关性。国外学者对急性 淋巴细胞白血病患儿、、哮喘患者的研究中均未发现表达与 抵抗具有相关性。 还有报道认为表达的相对不足是抵抗的原因。钱颐等桫对哮喘 具有正相关性。抵抗哮喘组、 患者研究发现与 表达最高,敏感哮喘组、 表达也升高,但低于抵 抗组。依赖哮喘组、 表达最低,低于正常组,各组问均有显 著差异。其中抵抗组/比值最低,提示升高的程度比小,因 此表达的相对不足才是抵抗的原因。 以上研究结果并不相同,可能与不同研究纳入的病例数不同及不同病种有 关。 目前国内、外尚无患者表达的相关报道。鉴于与之间的密切关系,深入研究 的表达及与效应之间的关系乃至调节机制有助于揭 示发病的本质并有望改善临床治疗效果。因此本研究拟采用.方法 检测患者和健康志愿者的,从分子水平探讨患者、 /表达特点及与疗效的相关性。 核因子出 .,一心和活化蛋白 .,一 是介导细胞内信号转导的重要转录因子,参与调节机体的免疫炎症反应。它 与 .复合物通过蛋白.蛋白的相互作用来相互制约。 ?.蛋白质家族包括../ 、../ 、、 和.等五种亚单位,通常以同源或异源二聚体形式存在,最常见的为 /组成的二聚体,发挥..的主要生理功能。.一般与其抑制剂心紧密 结合,主要以非活性形式存在于细胞质中。多种刺激物质,如.、.【、 等能引起细胞内的一系列级联反应,激活细胞质内出激酶,导致的磷酸化和 泛素化并被蛋白酶降解,从而释放..。游离的。进转位至细胞核,启动 一系列炎症基因的转录,包括.、?、?、一和等【】。 等报道, 【通过与之间直接的蛋白。蛋白相互作用,阻断..与其 应答元件的结合,进而抑制?.信号通路的传导。 .是由两个分属于家族和家族的蛋白通过亮氨酸拉链形成的同源或 异源二聚体。?/.是细胞中最普遍的一存在形式。炎症细胞因子通过诱 导 端激酶磷酸化.,促进家族矛:家族形成二聚体,形成活化的 一。与抑锘一心转录活性相类似, 【通过与.亚单位之间直接的蛋白 【 一蛋白相互作用,也以同样的方式抑制一的转录活性。研究表明,活化的 以其配体结合域与直接结合,使.复合物解离,抑制通过磷酸 化方式激活?,使.不能被磷酸化,导致.活化下游基因转录能力显著 下降引。孙丽等【应用超凝胶滞留实验分析、.和.亚单位组成;用 方法检测组成这些转录因子亚单位的核内蛋白水平。发现.主要为 ./?二.聚体,..由和组成,的活性成分为。原发性肾 病综合征患者治疗前后,禾?的核内蛋白水平在抵抗组均显著高于 敏感组,的核内蛋白水平在激素治疗前后无显著变化,治疗后,. 的核内蛋白水平有较明显的下降。提示敏感性与./.和/.核内蛋 白水平密切相关。任法新等 采用 法检例段抬高型心肌梗死患 者急诊经皮冠脉介入治疗术后无复流患者?.、.矛的核内蛋白水平变化, 发现无复流组患者/一、?/一的蛋白表达水平显著高于复流组;无 复流组患者的蛋白表达水平显著低于复流组,提示为?、。活性的 强有力抑制剂,表达降低,则?、一活性增强,更加重了局部心肌组织 的炎症反应,同时也减弱了内源性皮质激素抑制局部炎症反应的效果,加剧 了局 部炎症反应。有报道活动期患者.活性显著低于正常对照组,而缓解期 与正常对照组无明显差异。 以上研究提示转录因子一出和.与自身免疫性疾病的发病以及治疗效 应密切相关。和.分别是、.的主要成分,因此本研究拟通过 方法检贝患者核内和.蛋白的表达,探讨其与疗效 的关系,进而从转录调控的水平探讨患者抵抗的机制。 材料和方法 .研究对象 年月年月我科收治的初发患者例,其中女性例, 男性例,中位年龄岁~岁,诊断和分型均符合年成人原发性 免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识【,。抽取患者病初晨空腹肘静脉 血, 进行后续检测。其中例接受了激素治疗,分组:激素敏感组 例:血小板中位数.×./,醋酸泼尼松足量治疗周, 治疗剂量..一.~,血小板/;激素抵抗组例:血小板 中位数.~./,醋酸泼尼松足量治疗周,治疗剂量. .~.~,血小板/。健康对照组例均来自大连市中心血站健康献血 者,其中女性例,男性例,中位年龄一岁,在检测前周,无 感染性病灶,并未服用过糖皮质激素或其他免疫抑制剂。 .外周血单个核细胞的分离、总提取和合成 具体方法同前所述。 .实时荧光定量扩增按 试剂盒说明操作。 .引物设计及合成 物设计参照文献【】,弓物为大连宝生物 公司设计,所有引物均由大连宝生物公司合成。 表:扩增和内参引物序列和产物片段长度 基因 引物序列’一’ 产物长度 上游:下游: 上游: 下游: 具体如下: .配置反应体系在冰上进行, 灭菌蒸馏水 上游引物 下游引物 肛 ?模板 避光 肛 混匀后离心秒,上机应用实时荧光定量仪进行扩增及检测。 .扩增程序 预变性:。 秒 。/秒 反应:?秒 ?/秒 ?秒 ?/秒 熔解曲线分析:?秒 ?/秒 ? /秒 ?秒.?/秒 ? 冷却: .结果分析反应结束后确认 的扩增曲线和溶解曲线,分辨 目的产物与非特异产物及引物二聚体,并于.%琼脂糖凝电泳验证。反应结束 后, 电脑自动分析荧光信号并将其转换为值。通过。?方法对目的基因进行相对 定 量,待测样品目的基因值一待测样品内参基因值卜标准品目的 基因值.标准品内参基因值。每一标本的检测各重复两孔,取两复孔检测 的平均值。同时做阴性对照,质控监测,保证实验准确。 . 方法检测/.和./.核蛋白表达 . 核蛋白的提取 参照核蛋白抽提试剂盒说明 使用前 取个管约×个细胞,加入约预冷的 每 加入 , ,斗蛋白酶抑制剂,吹打均匀后 最大转速漩涡剧烈振荡秒,放置冰上。 加入 冷的 ,最大转速漩涡剧烈振荡秒,放置冰上. 再次最大转速漩涡剧烈振荡秒, 离心。 尽快将上清转入另一预冷的洁净管内,置于冰上,即为胞浆蛋白。 在离心沉淀物中加入预冷的 使用前每 加入, ,山蛋白酶抑制剂,反复吹打 后最大转速漩涡剧烈振荡。 冰上裂解,每隔,漩涡剧烈振荡秒。 离心,尽快将上清转移至另一管中,即为胞核蛋白。 试剂盒测定胞核蛋白浓度具体见试剂盒说明。分别取核蛋白和 上样缓冲液以:体积混合后煮沸使蛋白变性,待冷却后可用于加样。剩余 蛋白分装冻存于.。,避免反复冻融。 . 凝胶电泳、转膜 具体方法同前所述。 .免疫反应 封闭液稀释.的一抗为:、.的.一抗为:。 二抗浓度:。步骤同前。 .显影和定影 具体方法同前所述。 .统计学分析 .统计软件进行分析,符合正态分布,方差齐性的数据作单因素 采用 方差分析,结果以均数标准差?表示。非正态分布数据,作? 非参数检验,结果以中位数%%表示。非正态分布数据,相关分 析采用相关分析。以值.为具有统计学意义的标准。 结果 .临床资料分析 例患者中位年龄?岁,其中女性例,男性例,女:男为.: 。血小板中位数.××/。例行骨穿检查,其中例。% 骨髓增生活跃,.%明显活跃,例.%增生活跃偏低。骨髓涂片 巨核细胞中位数.个,其中例.%巨核细胞增多。积分 中位数.,阳性率%%.%。例行抗核抗体检测, 例.%阴性,例.%阳性。例行血小板抗体检测,例血小板少, 测不出,其余例中例伴有血小板抗体丢/或并/或升高。 .患者和正常人、 与/的比较 产物和内参扩增良好,无引物二聚体生成,见图。.%的琼脂糖凝胶电泳可 表达高于组, 见产物在目标位置,无杂带生成,见图。正常组 但无统计学意义胗.,见表、图。其中例患者、例正常人前期已行 呈升高趋势,/呈下降趋 检测,可见患者组较正常组 势.。
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