【doc】地高辛标记探针用于人白细胞基因定位

【doc】地高辛标记探针用于人白细胞基因定位 地高辛标记探针用于人白细胞基因定位 移一辩溶纪 地高辛标记探针用芋人白细胞基因定位 隋正虹 基因定位可称为基因的功能解剖学", Zj诤) 现了基因定位,有助于深入了解基因的结构, 功能与调节及基因间的相互关系,揭示本质与 象的关系.近十几年来,它对阐明癌变机 理I及近一步的肿瘤治疗更是起到了推动作 用,基因定位在自然科学研究申的重要作用勿 庸质疑.而基因定位中探针标记也经历了由放 射性同位素到非放射性标记的过程,非 放射性标记技术的出现解决了稳定性,安全性 的问.1988年Heiles等t发展了用地高辛 标记DNA探针的方法,使非放射性标记的方 法在灵敏度稻特异性方面得到了很大的提高. 本文介绍了我们用地高辛标记探针在人白细胞 制片上进行基因定位的工作,并就影响基因定 位效果的因素进行了探讨. 材料和方法 1.材料 RI~MI1640(日本进口),PHA(协和遗传室),5_ 澳脱氧球嘧啶按苷(中科院生物物理所),秋水仙素, 地高辛标记检测试剂盘及抗地高辛-FLUORESCEIN 荧光抗体(德国童棒曼公司),蛆织凝集素基因片段(法 国CANNY教授惠赠) 2.蜘胞培葬和期片 人外周血细胞经PHA刺激培养60小时后加八 5-淡脱氧尿嘧啶棱苷f终浓度为5Olig/m1),在作用7 — 8小时后,再加A秋水仙索(终浓度为0.02Ug/m1), 2小时后收集细胞,并用0.075tool/L氧化钾低渗处 理20分钟后制片. 5.靠针标记 以随机引物法用1)Ig-II-dUTP标记组织撮集素 基困片段.待标记基因片段于100~C加热10分钟后, 立即于冰水中冷却,依次加八2L六聚接簧酸混台物? 2仙LdNTP眙标记底物,用双蒸球补至19一体积 (0.2mol/L,pH8..)终止反应,再加2llL4MLiCI, 7595%乙醇,一70?半小时后,10,000rpm离心 10分钟,洗涤沉淀,空气干燥,溶于TE.(详见试剂 盒操作说睨) 4.屎位杂变豆燕矗 4片先用RNaseA(100pg/m1)37~C诮化40分钟, 用2xssC冲洗后梯度乙醇脱水,空气干燥.于变性液 (70甲酰胺,2xSSCpH7.0),70'C90秒后立即子 冰乙醇梯度中脱东,空干后,每片加4OHI杂交液 (50甲酰胺,2×SSCpH7.0}5×DenhardUsl 500pg/ml鱼精DNAjlo%葡聚糖硫酸盐l30g变 性标记探针)盖上盖玻片,Parafilm膜封片,42'C杂 交过夜. 杂交结束后先用100ml2×SSC,0.1SDS洗 涤30分钟三次,再用100ml0.1×SSC,0.1SDS 42?冲洗30分钟三次,用2xSSC冲洗10分钟两次 后显色.或先于5o甲酰胺,2xSSC39~C--~j2~C洗 涤1o分钟三捷,后于2×SSC39"C--42"C冲洗10分 钟三次,再于2×SSC冲10分钟两次后显色.详见 GRrson{法. 5.杂交后置色 (1)酶法显色按试剂盒揉作说明. (2)荧光显色l玻片上谪加PBS-BSA稀释的羊 抗地高辛-FLUORESCEIN荧光抗体(终浓度为 50g/mJ),盖上盖玻片371C30分钟后PBS洗涤5分 钟,置于0.01磷酸缓冲液(pH7.0)稀释的吖啶橙中 染色1小时. 6.R置带 按文献…稍加改动,将水俗温度改为42?,其余 处理相同. 7.Gim?染色按常艴. 结果与讨论 用地高辛标记探针经杂交,洗涤后,以两 94'细胞生物学杂志1996年 种方法显示杂交结果一酶法或荧光方法.经酶 显色后在相差显微镜下可见蓝紫色圆点,确定 染色体条数>44的作为一个统计分裂相,拍 照,记录位于染色体上的杂交点,位置及点 数,再经R显带的Giemsa染色步骤,确定杂 交点所在染色体区带位置.图为酶显色同一分 裂相杂交后,显带后照片,比较下可见杂交点 位于10q112区. 共分析了102个分裂相,共有267个位于 染色体上的杂交点,其中11.6的杂交点位 于特异位置10q112区,且位于这一区的杂交 点数远远高于其他位置上的点三倍以上,符合 阳性点的确定原则,因此可以确定10112为 基因特异结合位置.统计结果见表1 襄1基田定位两种噩示方洼统计培暴(其中—涪为三次平均荧光涪为两次平均苗 果) 异杂交分裂相10q112区点特异杂交点数 I总分裂相数总杂交点随机分布率 方法f——_—————————一平均本底特异点随机分布率一 酶法I3O/lO229.431/26711.6%267/1622.626713110.2931/6.8636 荧光法l2216931.922/11119.8111/691.67m/3110.182216.3661.1 另外还用荧光方法显示了杂交信号,结果 见表l.用荧光显色在荧光显微镜下可见完黄 色杂交点,同理共分析了69个分裂相,其中 19.8的点位于同一特异区域.证实了酶显色 结果.由表1可见,荧光显示系统的阳性率为 l9.8,高于酶显示系统I1.6的阳性率, 而平均本底低,荧光显示系统的显示效率高于 酶显示系统,而特异性较高.由于荧光易褪色, 故相比酶显色结果它不易保存.但这并不影响 短期内的观察.所以这两种方法中以荧光法为 佳.但我们使用的是抗探针标记物抗体直接显 示荧光方法,即FLu0REsCEIN连在抗地高辛 的抗体上,若能采用当前文献报道的荧光级联 显示法,可能会得到更好的结果(可达50), 这也说明了基因定位效果不但决定于探针与基 因的同源性,还取决于显示体系的效率. 地高辛标记探针进行基因定位,只需在载 玻片上进行简单的操作,省却了放射性显示所 需的感光及安全防护等复杂,不安全因素,而 且地高辛探针较稳定,操作周期短|相比生物 素探针.又没有内源性因素影响,因此地高辛 标记探针无论在基因定位或组织细胞定位中均 有很好的应用价值. 基因定位申有许多因素影响最终效果,其 中之一是显带,由于在定位过程中要经过高温 杂交,杂交后洗涤等较剧烈的处理,染色体的 形态易受破坏,因此长久以来,人们一直在寻 找重复性好,带型清晰的显带方法,我们经过 反复摸索,找到了--一种R显带方法,能满足 基因定位的需要,在这一方法中只需对制片进 行一次紫外照射和Giemsa染色处理条件温 和,能维持染色体形态的稳定性,而且显带带 型清晰,可重复性强,增加了基因定位的准确 性和可信性.但这,次照射在杂交前和杂交后 效果不同,杂交前用紫外照射的显带效果比杂 交后的要好.采用杂交前的紫外照射大大提高 了基因定位中的可分析分裂相率. 另外有关杂交后洗涤,文献上多采用 50甲酰胺,2xSSC条件,采用甲酰胺是为 了降低杂交温度,使染色体少受高温损伤,但 由于甲酰胺是一种强去垢剂,对染色体形态影 响还是很大,常导致染色体变形.我们改用作 用较温和的0.1SDS代替甲酰胺,取得了较 好的效果,结果见表2.由表2可见,以O.1 SSC,2xSSC洗涤,可分析分裂相率大大提高 (P<0.05),说明SDS比甲酰胺更能较好地维 持染色体的形态,而且只要洗涤充分,用这一 方法得到的杂交结果(平均本底2.6)与文献报 道的相当,说明它能较有效地洗脱背景.经过 这些改进,使杂交后可计数的分裂相增多,且 第18卷第2期细胞生物学杂志 裹'2洗濠景件的比较 实验次数可分析分裂相率(46条染色体中>50分带好的分裂相数/观察分裂相 敦) 50酰胺,2xSSC0.t%SDS,2×SSC 带型精晰,能够准确指示杂交点的位置,因此定 可以得到更多的数据,节省时间,又能得到较 好的定位效果,增加了定位结果的可信性. 因此我们提出用地高辛标记探针进行的基 因定位中能取得较好基因定位效果的技术路 线:人白细胞制片一紫外照射制片一地高辛标 记探针在制片上杂交一sDs洗涤一荧光显示一 记录~Giemsa染色一记录 摘要 用地高辛标记探针在人染色体上进行了基 因定位.使用了酶显色和荧光显色,两者得到 了相同的定位结果,特异区阳性率分别为 l1.6%和19.8,荧光显色特异性较高,说明 基因定位效果受显示系统效率的影响,地高辛 标记探针用于基因定位有比放射性探针,生物 素探针更多的优越性.又讨论了几个影响效果 的因素,提出以SDS代替甲酰胺洗涤l紫外 照射于杂交前R显带方法能取得较好的基因 基因定位 赦 [1]Mukusick.V+A.1980,J.Hered.,71t 370. [2]Groffen,J.eta1..1983,J.酞p.Med.. 158'9. [3]Mamanway.ME.,eta1.1990.L{. 335I808. [4]Zischler.H..eta1..1989.H"m.Genet.. 82l227. [5]Hopman.A.H.N..eta1..1986.His? tochemistry,84i169. [6]Viegas-Pequignot.E.,eta1..1986,Cy- tOgenetCe"Genet42l1O5. [7]HeiIes,B.J..eta1..1988,Biotechni? ques,8I978. [8]GarsonL.A..eta1..1987.Nucleic AcidsR嚣.,15:4761. [9]晏炬,1985,中华医学检验学杂志,8(1). 55. DIG0?GENIN—LABELLEDPR()BEAPPUEDINGENEL0一 CALZAT【0N0FI正UCoCYTE0FHIMANBEING SuiZheng-hon8JiangPan-hongZhangXue--cheng (BiologyDepartment.OceanUiveityo,0d口o266008) ABSTRACT WeappliedDigoxigenin-1abelledprobeingenelocalizationonhumanchromosomes. Using enzymaticandFluorescentmethodtoshow,allofthemshowedthesameresult.Thepositivera te ofspecificregionwas11.6andl9.8respective王y.whileFluorescentmethodwasmore specificwhichindicatedthattheeffectofgenelocalizationwasinflueneedbytheefficiencyof showingsystem.Digoxigenin-IabelIedprobewassuperiortoisotopicandbiotinylatedprobe s jn8eneIocalization.Thenwediscussedsomefactorsinfluencingtl1e1oealizationeffect.It wassuggestedthatusingSDSinplaceofformamideinwashingandR-bandingofUV—expo. sllrebeforehybridizationgjveusbetterresults. KeywordslDigoxigen-labeHedprobeGeneloealleation