栉孔扇贝异精雌核发育四倍体早期胚胎发育的细胞学荧光显微观察

栉孔扇贝异精雌核发育四倍体早期胚胎发育的细胞学荧光显微观察 栉孔扇贝异精雌核发育四倍体早期胚胎发 育的细胞学荧光显微观察 第14卷第2期 2007年3月 中国水产科学 JournalofFisherySciencesofChina Vl01.14No.2 March2O07 栉孔扇贝异精雌核发育四倍体早期胚胎发育的细胞学荧光显微观察 迟长凤1,2杨爱国,王清印2,刘志鸿2,周丽青2 (1.中国海洋大学生命科学与技术学部,山东青岛266003;2.农业部海洋渔业资源可持续发展利用重点实验室,中国水产 科学研究院黄海水产研究所,山东青岛266071) 摘要:用1500/cm2的紫外线照射长牡蛎(Crassostrea甑g)精子60s以进行灭活处理,并使之与栉孔扇贝(Ch/amys )卵子受精,在卵子受精后排出第一极体前用6一DIvIAP(50m~/L)处理受精卵,持续处理35min,抑制第一极体和第 二极体的排放,诱导异精雌核发育四倍体.采用二脒基苯基吲哚(DAPI)荧光染色显微观察法,对灭活的长牡蛎精子诱 导的栉孔扇贝雌核发育四倍体早期胚胎发育过程进行细胞学观察.结果明:经紫外线灭活过的长牡蛎精子进入栉孔 扇贝卵子后发生轻微膨胀;在第一次卵裂中期,精核形成一致密的染色质小体(D(,B),位于两组分开的母本染色体之间, 不参与核分裂;第一次卵裂结束时DCB滞留于两卵裂球的分裂沟上或进入其中一分裂球中;第二次卵裂过程中,DCB的 去向与第一次卵裂时基本一致.6,DMAP处理有效地抑制了第一极体和第二极体的排出,从而使雌核四倍化.对担轮 幼虫染色体倍性分析结果表明,通过本方法可以获得6.25%的四倍体幼虫.本研究 还对灭活的异源长牡蛎精子诱导栉 孔扇贝雌核发育四倍体过程中产生的复杂倍性,核物质分离紊乱及多精附卵现象 进行了观察和分析.[中国水产科学, 2007,14(2):175—182] 关键词:栉孔扇贝;异精雌核发育;四倍体;细胞学;荧光显微观察 中图分类号:Q959.215文献标识码:A文章编号:1005—8737一(20o7)02—0175—08 近年来栉孔扇贝(Chlamysfarr)在养殖中出 现了品种退化,产量降低,品质下降等现象,因此人 工诱导多倍体为改善栉孔扇贝目前的养殖状况提供 了新的思路.栉孔扇贝三倍体在生长,群体产量及 抗病力等方面都表现出明显的优势…1,但是,由于 三倍体扇贝不育,不能自我延续种群,需每年诱导, 操作难度大,培育四倍体是解决这一问题的有效途 径.四倍体与二倍体杂交可产生100%三倍体,该 获取三倍体的方法操作简单,方便实用,避免了理化 处理对胚胎发育的影响,提高了胚胎的孵化率和幼 虫的存活率,适合于产业化应用.因此四倍体扇贝 育种研究对水产养殖具有重大的意义J. 关于栉孔扇贝四倍体的育种研究L3-6]已多有 开展,但尚未见用异源灭活精子诱导栉孔扇贝雌核 发育四倍体的报道.长牡蛎(Crasmstrea5)和 栉孔扇贝同目不同科,亲缘关系较远,但本实验室前 期研究工作结果【J表明,长牡蛎精子在不失活的条 件下能够与栉孔扇贝卵子正常结合,受精率一般在 40%左右,且受精卵可以发育,但发育到担轮幼虫阶 段便全部死亡,即不能形成存活后代,这为雌核发育 的诱导提供可能,且为后代的鉴定提供了方便.但 长牡蛎精子不经过UV处理并不能起到诱导雌核发 育的作用.细胞学观察结果表明,未灭活的长牡蛎 精子入卵后精核发生解凝缩而膨胀形成雄性原核, 而后雌雄原核融合].因此为有效避免外源精子 基因组的干扰,长牡蛎精子必须经过灭活处理.本 研究采用灭活的长牡蛎精子与栉孔扇贝卵子受精, 诱导栉孔扇贝雌核发育成四倍体,其基本原理为遗 传失活的异源精子进入卵子后,采用理化方法抑制 受精卵第一极体和第二极体的排出,使卵内保留4 套染色体,最终发育形成四倍体.Guo等[8]应用这 种方法,诱导获得高达95%的长牡蛎四倍体胚胎. 本研究通过荧光显微镜观察遗传灭活的长牡蛎精子 激发栉孔扇贝卵子受精,第一极体和第二极体的释 收稿日期:2006—04—05;修订日期:2006—08—31. 基金项目:国家自然科学基金资助项目(3o600465);国家高技术研究发展"863" 资助课题(2003AA603022);国家重大基础研究发展规划 "973"资助课题(G1999012009);国家科技攻关计划项目(2004BA526B0103). 作者简介:迟长I~(1979一),女,博士研究生,主要从事贝类遗传育种研 究.E-mail:amyccft~126.O31TI 通讯作者:王清印.Tel:0532—85822959;F,-mail:qywang~public.qd.sd.cn 176中国水产科学第14卷 放被抑制后染色体的行为变化,探讨了雌核发育四 倍体形成的机理和规律,旨为诱导栉孔扇贝雌核发 育成四倍体的诱导研究提供细胞学依据. 1材料与方法 1.1材料与主要试剂 长牡蛎(C.g/gas)亲贝(壳长8,9锄)于2005 年2月下旬购自山东省青岛市南山水产品市场.栉 孔扇贝(C.)亲贝旱(壳高7,9锄),于2005年 4月取自山东省胶南市育苗厂.6一二甲氨基嘌呤(6一 dimethylaminopurine,6一压AP)和4,6.二脒基苯基吲 哚(4,6'-diamidino-2一phenylindolehydrochloride,DAPI) 均为Sigma公司产品. 1.2方法 1.2.1亲贝暂养与精,卵的获得亲贝取回后用海 水把外壳反复刷洗干净,暂养于实验室水族箱中,分 别缓慢升温至22.5?(长牡蛎)和19?(栉孔扇 贝旱)左右,促使性腺成熟.混合投喂小球藻(Nan. nochloropsisoculata),三角褐指藻(Phaeodactylttm tricornutum),叉鞭金藻(Dicrateriazhanjiangesis) 和螺旋藻粉(Spirulinapowder)等饵料.性腺成熟 后,采用阴干升温法刺激栉孔扇贝产卵,300目和 500目筛绢过滤收集,过滤海水洗卵.人工剖取长 牡蛎精子,性腺剖取液采用500目筛绢过滤,用过滤 海水稀释. 1.2.2紫外线照射精子及授精取稀释后长牡蛎 精液3n置于直径为9cln的塑料培养皿中,轻微 振荡使之平铺于培养皿底部.培养皿放在紫外照射 仪的摇床上,震动频率为60次/min.紫外灭菌灯 (20W,253.7nm)照射60s.用UV-B的紫外辐射 强度仪测得此处紫外辐射强度为1500/cm2. 照射后的精液立即倒人盛有300mL栉孔扇贝卵液 的烧杯中,玻璃棒搅拌均匀,避光30min.授精时的 精卵比例以1个卵子周围附着10个左右精子为宜. 受精卵在22?条件下培养.对照组用未经照射处 理的精子.实验设3个重复,每组精卵的来源亲贝 均为不同个体. 1.2.3雌核发育四倍体的诱导显微镜下观察到 有少数受精卵排出第一极体时即向处理组加入 6-DMAP,使其终质量浓度为50mg/L,持续处理 35min,抑制第一极体和第二极体的排放.处理结 束后过滤海水洗卵3次,移人1000n烧杯中 培养. 1.2.4受精卵早期胚胎发育的细胞学观察6一 DMAP处理前,后每5min取样1次;发育到2细胞 期以后每隔10min取样一次.固定液为过滤海水 配制的2%戊二醛和2.5%多聚甲醛.更换固定液 2,3次,4?保存.荧光显微镜观察前用pH7.4磷 酸缓冲液洗卵3次,DAPI染色,NikonE一800荧光 显微镜365nn-i下观察,数码相机拍照.取处理组担 轮幼虫,热滴片法制备染色体,选取分散好的分裂相 进行计数统计并拍照. 2结果与分析 2.16.DMAP抑制第一极体和第二极体排放的核 行为特征 2.1.1减数分裂过程中的核行为观察表明,经紫 外线灭活的长牡蛎精子人卵后能够激发栉孔扇贝卵 子的发育,只是时间上比对照组迟缓.灭活后的精 核人卵后发生轻微膨胀(图版I一3).经6一DIAP (50rag/L)处理35min后,受精卵的两次减数分裂 受到抑制,即两个极体的排出被抑制,从而形成四倍 性雌核.在此过程中精核并未与雌原核相融合,而 是形成致密的染色质小体(Densechromatinbody, DCB),游离于母本染色体之外(图版I一4a,4b). 2.1.2两次卵裂过程中的核行为第一次卵裂后 期,母本染色体在纺锤丝的牵引下已移向两极,而 DCB则进入其中一个卵裂球的细胞质中(图版I一 5)或滞留于两组母本染色体之间(图版I一6).2 细胞期,DCB位于两个卵裂球之间的卵裂沟上(图 版I一7)或进入其中一个卵裂球的细胞质中(图版 I一8).4细胞期可见DCB位于其中相邻两细胞 的卵裂沟上(图版I一9a,9b)或其中一个细胞内紧 靠卵裂沟处(图版I一10). 2.2雌核发育四倍体诱导及发育过程中出现的其 他倍性 2.2.1雌核发育单倍体第一次卵裂中期,后期, 当雌核分裂为两部分时,观察到停留于其问的 DCB,与极叶相对一端有2个极体,为雌核发育单倍 体胚胎.此时有的精核游离于两个卵裂球之间的卵 裂沟上(图版?一A4)或进入其中一个卵裂球中(图 版II—A2,A3). 2.2.2雌核发育二倍体第一次卵裂中,后期雌核 发生分离时,可观察到游离于其间的DCB,与极叶 相对一端见到只有1个极体排出(图版?一BI,B2, B3,136),为雌核发育二倍体胚胎.发育至2细胞 第!鞫迟长风等:带扎扇舁精雌蒋赞育四倍圳旺}育的细胞学姨光丑微察177 时.仍能看到1个设件和位于巾】卜印裂球中的 lx'B(圈版?B4B5) 2.3核物质分离紊乱与多精附卵现象 雌恢发育册倍性的雌恢与精核移动和分离过 中垃生紊乱t版Uc1c2,3)观察过程}』 发现一定比例的受精卵呈罔版?(4状态.推测,1I 能为情棱进^掇iIf或肯形成?_细胞4细胞期雌 核分离吐程巾发生蒙乱(图版?【)1观察程 萤现普遍存在多精附卵现象(罔版?E) 2.4雌核发育胚胎的倍性比例 处理组中扣轮幼山的惰性组成包括倍体, 倍怍,二倍休四储体和大量的非整储体,其叱例依 次为R33%,l354%.52I%,625%和67‰ 各倍性担轮幼虫丹裂相如版m所示 图版I栉L扇贝雌核发育四倍体诱导殛卵裂过程中的核行为变化(x500) I:末受精成熟r;2耕于附印.3精了^;如,扎5o:第哪袈后]:7:2细胞柏(精核位J卵裂铷ll:8:: 刿胞期(柚卡戋址^1印裂球中).%,:4细胞(精枝位于即裂淘上);10:4胞期(批栈进八个裂球ft1 C染包体.FI:雌梅,MP:雄性;S:精干 PlateINuclearbehaviorsinfertilizedallog)'n(~eneticletraploidy ofChlamys如rrenduringinduclionandcleavage,x500\ I:【nfLnIL…:2:sI…aLt}utlt咄;3:?IIlrl,ln"'4al_,5nI,lIclT "…职;7:2e【1pl(f……【…rI.d腿vrurl~1w),8:2cdl1)lil'11llucin…l}fthetw【l, lm…):9a,:4Ih(I…【rlLLlLl?vg0fu…).10:ll'ha*(p…I1.iclcu~_J1I?et】『lhL)? l}I"一r) 【"h"1…1;FP…l【【f'1tI_?IcleLl,.Mf:f1Iak??1LcIIJ.s:IKnn 碚14巷 慧曼至 一曩一 第2期避K凤等:栉孔扇吼异精雌棱发育四倍体期肿眙垃育的纲胞学荧光显微观察 ' , 礤, . , IC 图版皿栉孔扇贝异精雌核发育四倍体诱导过程中产生的担轮幼虫的染色体倍性 检测(×lIH)0) A:单倍体fIIg};B:倍体f2=38):(,:二倍件门=57j;1):四倍休c4,f=76J:卜F:忙俏件(4 Plate?VariedphJidyoftrochophoresinducedduringtheprocessIJf allog~nogenetictetraploidinductionofChlamys扫r【Xl000】 A:haplnidy(,=19);抖:dil~loidy(2.:38j;【':Iri[—idy(3"57);D:tclraphfidy(4sJ76);.F:? 1ltuploidy(364q) 3讨论 3.1栉孔扇贝雌核发育四倍体的诱导 人工诱导雌棱发育四倍l本是通过精子的遗传失 活和卵子染色体四倍化两个步骤来实现的采用灭 活的}乏牡蛎精子来激发栉孔扇贝卵子的发育是在实 验室前期工作川的基础上选择确定的一栉孔扇贝 和长牡蛎都是重要的海水养殖贝类,两者分属不同 科,亲缘关系较远,但栉孔扇贝的卵子与长牡蛎的精 子可以正常识别受精使本实验成为可能任建 峰等对栉L扇贝(旱)×长牡蛎()受精过程进 行r荧光显微观察,为探讨异源精子诱导栉L扇贝 雌核发育的技术路线提供了依据选择和确定精于 遗传失活的适宜处理参数,既使精子有效失活叉保 证其具有良好的激发卵子发育的能力进而获得高比 率的雌桉单倍体,是成功诱导雌核发育阴倍体的先 决条件.紫外线照射法因其易于操作,价廉高教,照 射后精桉染色体碎片少等优点而被广泛应用于 精于染色体的遗传失活处理中本实验中长牡蛎精 子遗传失活的参数是在参考李雅娟等10的实验结 果的基础上,通过单倍体诱导实验的结果选择确定 的,紫外强度为I500W/era.照射6Os 与cB相比,6DNt&P价格便宜,低毒,易溶于 水,诱导率高__,它作为一种蛋白激酶抑制剂,可通 过对磷酸化融酶的抑制,使蛋白质发生去磷酸化作 用,从而最终抑制极体形成【12J.近年束已被广泛用 于贝类多倍体诱导研究中本实骑通过用6-DMAP 阻止1栉孔赢『』!印子'j灭活的长牡蛎精子受精后第一 极体和第二极傩的排出.使卵子雌核四倍化..在诱 导雌核发育成四倍体的过程中,决定染色体加倍的 主要因素有诱导时机,6DIvbM的浓度和处理时间 等..本研究结果表明.栉孔扇贝雌核发育四倍体的 诱导.在授精后显微镜下观察到个别卵子排出第一 极体时以5()n喂/L的6一I]MAP处理受精卵35miI] 能够诱导出一定比例的雌梭发育旧倍体+但比率较 低,诱导条件有待进一步优化. 3.2精核的命运 观察结果显示,uv照射处理的}乏牡蛎精子入 卵唇能够激发栉孔痢l印子的发育,精子不能形成 雄性原核,与雌性原核融合,在第一次有丝分裂时 形成一致密的染色质l,J,体(DCB),游离于雌性原按 形成的两组染色体之外.这与诱导长牡蛎fCra一 sr~streagigas)I,皱纹盘鲍(Ha/iotis"hart一 ,"i)14],贻贝(Mytilusedu/is)15],侏懦蛤(Mull? [atera/is)雌核发育中的精核行为相似,与Pan 等….诱导栉孔扇贝雌核发育.fS体的观察结果一 致经uV处理后的精子,核DNA失活,核蛋自遭 受部分破坏,精子人卵后不能形成具正常功能的雄 180中国水产科学第14卷 原核,受精卵由母本染色体控制发育,形成雌核发育 个体. 对于遗传失活的精核在雌核发育卵子中的最终 去向和作用,至今尚无定论.本研究采用荧光显微 技术对栉孔扇贝雌核发育四倍体第二次卵裂结束前 的精核去向进行连续跟踪观察.结果显示,其第二 次卵裂中精核的去向与第一次卵裂时的去向一致, DCB游离于卵裂沟上或进入其中一个卵裂球中,胚 胎仍能正常发育.对4细胞期以后DCB去向,尚需 新的方法进行研究观察. 3.3诱导雌核发育四倍体过程中出现的复杂倍性 通过荧光显微镜观察和染色体倍性研究,在处 理组中发现单倍体(图版?一A),二倍体(图版?一 B),三倍体(图版?一C),四倍体(图版?一D)和大 量的非整倍体(图版?一E,F),证实了诱导雌核发 育四倍体过程中复杂倍性的存在.推测起关键作用 的因素为受精卵第一极体和第二极体的排出受到抑 制,从而导致减数分裂过程中染色体分离复杂化,发 生多极分离,产生大量的非整倍体.在雌核发育四 倍体的诱导过程中,精子遗传失活的程度和6一 儿处理是否成功,以及受精卵发育是否同步也 是很重要的因素. 3.4多精附卵与核物质分离紊乱现象 栉孔扇贝普遍存在着多精受精现象.荧光观察 结果发现精卵混合后发生严重的多精附卵现象,但 是观察结果并未观察到多精受精现象.分析其原因 可能为大部分遗传失活的长牡蛎精子虽然能够附着 栉孔扇贝卵子但不具备进入卵内激发卵子的能力, 也可能是长牡蛎精子虽然经过紫外线灭活但对于栉 孔扇贝卵子来说仍为异源精子,可能存在某种保护 屏障机制. 同时处理组中产生一定比例的核物质分离紊乱 现象,可能是紫外线照射引起精核染色体部分失活 所致【t8I1.受精卵第一极体和第二极体的抑制导 致减数分裂过程中染色体分离复杂化,发生多极分 离,可能为核物质发生紊乱分离的重要原因之一. 参考文献: [1]杨爱国,王清印,张岩,等.栉孔扇贝三倍体与二倍体的生长 比较[J】.海洋科学,2000.24(8):21—23. 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TheworkresultsofourlabbeforeshowedthatspermofCrassostreagigascouldattachChlamysfar一 ,'ereggrapidlyandpenetrateintoitafterinsemination,andspermnucleusdiffusedandformedmalepronu— cleus.EggofCh/amysfaresunledmeiosis.releasedpolarbodyandformedfemalepronucleuswhenit wasactivatedbytheheterogenoussperms.Atlast,maleandfemalepronucleifusedandfertilizedeggbegan thefirstcleavage.Thechromosomecouldnotbedistributedequallyintotwocellsinmostofthezygotedur.. ingthefirstcleavage,whichresultedinthatthehybridsbetweenZhikongscallopandPacificoysterarenot viable.Inordertopreventanygeneticpaternalcontamination,spermofCrassostreagigasmustbegenetical— lyinactivated.Thisstudyaimstoinduceallogynogenesistetraploidwith6-DMAPbyinhibitingtherelease ofthefirstandthesecondpolarbodies,andobservecytologicalprocessoffertilizationandtheearlyembro developmentofallogynogenetictetraploid,whichcanprovideussomeevidenceforinducingallogynogenetic tetraploidandfindingitsmechanism. AllogynogenetictetraploidyofscallopChlamysfarreriwasinducedbyU— irradiatedheterogenous spermsofPacificoysterCrassostreagigas.Theinductionwasattemptedbyblockingreleaseofthefirstand secondpolarbodiesfromfertilizedeggswith6-dimethylaminopurine(6-DMAP,50rng/L,35min),which wasappliedjustbeforethefirstpolarbodywasgoingtobeexpelledfromthefertilizedeggs.Heterogenous spermswereultraviolet— irradiatedfor60satanintensityof1500/cm2.Thecytologicalprocessoffertil— izationanddevelopmentofearlyembryosofgynogenetictetraploidywereinvestigatedunderfluorescentmi— croscopewithDAPIstained.Cytologicalobservationrevealedthatnucleusofultraviolet— irradiatedspermex— pandedafterpenetratingintoeggsofChlamysfarr.Atmetophaseofthefirstcleavage.malepronucleus becameadensechromatinbody(DCB),whichdidnotparticipatedinkaryokinesisandlocatedbetweenthe twomaternalchromosomes.Atcompletionofthefirstcleavage,DCBwasobservedeitherinregionofthe firstcleavagefurroworinoneofthetwoblastomeres.Duringthesecondcleavage,theexperienceofDCB wasfundamentallyidenticaltothatthefirstcleavage's.Treatmentwith6-DMAPeffectivelvblockedreleaSe ofthefirstandsecondpolarbodies,andresultedinbigtetraploidfemalepronucleus. PercentageoftetraploidsproducedinthestudywasmuchlowerthanthatDr_0ducedwithothermethods 中国水产科学第14卷 thoughwedidgettheallogynogenetictetraploids.Levelsofallogynogenetictetraploidsineggstreatedwith 6一D, Lmaybeduetofourfactors.Thefirstfactorwasinactivationofheterogenousspermwhichinvolved intensityofirradiation,concentrationofspermandirradiationtime.Thesecondonewastreat mentofredu— plicationwhichincludedthedurationof6一D, Ltreatment.treatmentopportunityandconcentrationof6一 DMAP.Thethirdonewasconditionofcultivationwhichwasalsoveryimportant.Andthefourthfactorwas whetherdevelopmentoftreatedeggswassynchronizedornot.Synchronizationofeggdevelopmentin zhikongscallopwasgreatlyaffectedbyfemaleconditionandotherenvironmentalfactors.Theresultsmay suggestthatalongerdurationof6一 DMAPmayproducemoretetraploidsthanashorterduration.Further studiesareneededtodefineoptimumconditionfortheinductionofallogynogenetictetraploidsinthefuture. Manyresultsofgynogeneticcytologicalobservationprovedthatspermnucleuswasincondensationaf— terpenetratingintoegganddidnotdisperse.Resultsofcytologicalobservationdocumentedthatduringthe secondcleavage,experienceofDCBwasfundamentallyidenticaltothefirstcleavage'SinwhichDCBwas observedeitherintheregionofthefirstcleavagefurroworinoneofthetwoblastomeres.Fateoftheirradi. ationmalepronucleusafter4一 cellstagewasunknownwhichneedanewway.Inaddition.theembryoswith variedpolyploid,irregulardivisionofnuclearmaterialsandmultiheterogenousspermsattachingtotheeggs wereobservedanddiscussedinthepaper.[JournalofFisherySciencesofChina,2007,14(2):175—182] Keywords:heterogenoussperm;Chlamysfarreri;allgynogenetictetraploid;cytologicalobservation C眦pIingauthor:WANGQing-yin.E-mail:qywang@public.qd.sd.cn 书讯 由中国工程院院士,我国着名鱼类生理学家林浩然教授和他的助手刘晓春博士编着的《鱼类生理学实 验技术和方法》一书已于2006年12月由广东高等教育出版社正式出版发行. 该书以中山大学生命科学学院水生经济动物研究所鱼类生理学研究室教学工作中编写的实验课教材 和科学研究中使用的技术方法为基础,吸收当前国内外鱼类生理学研究的一些新技术综合整理编写而成. 全书包括营养,消化,吸收,血液和血液循环,排泄,渗透压调节,生殖,内分泌,神经和感觉等鱼类生理学各 个主要方面的实验技术与方法共42个.除了保留一些经典性的实验方法外,着重介绍当前国内外鱼类生理 学研究中较常用的新技术.书末还有6个附录,介绍鱼类生理学实验和研究的常用操作方法和基本技能. 该书可供综合性大学,师范院校,水产院校和农业院校的生物学专业,动物学专业,鱼类学专业,水产学 专业,海洋生物学专业以及其他有关专业的大专,本科学生和研究生作为实验课教材,也可供从事动物生理 学,鱼类生理学,比较生理学,环境生理学,比较内分泌学,生物工程学,水产养殖学,海洋生物学等研究工作 的专业科技人员参考. 目前,该书已开始发行,定价:38元.需要购书者可与广东高教出版社联系(地址:广州市天河区林和西 横路,邮编:510500).亦可直接与刘晓春博士联系(广州市新港西路135号,中山大学生命科学学院,邮编: 510275,E—mail:lsslxc@mail.sysu.edu.cn).