[doc] 人乳头瘤病毒高通量分型检测研究进展

[doc] 人乳头瘤病毒高通量分型检测研究进展 人乳头瘤病毒高通量分型检测研究进展 国外医学临床生物化学与检验学分册2003年第24卷第2期 综述 ? 微生物学? 人乳头瘤病毒高通量分型检测研究进展 张菊高艳娥苏振兴综述阎小君审校 (第四军医大学全军基因诊断研究所,西安710032) 摘要:人乳头瘤病毒的存在与多种皮肤粘膜的良,恶性增生特别是泌尿生殖系癌的发生发展密切相关,其各型序列与其生 物学行为存在着高度相关性,因此人乳头瘤病毒及其分型的高通量检测对判断感染者预后,指导治疗具重要临床价值.近年,在 各套通用引物系统基础上的高通量分型检测技术得到较大的发展,有望进入临床检测. 关键词:人乳头瘤病毒;PCR高通量检测;诊断 中图分类号:R446.61文献标识码:A文章编号:1006—3730(2003)02—0074—02 人乳头瘤病毒(HPV)的存在与多种皮肤粘膜的良,恶性 增生,泌尿生殖系癌特别是宫颈癌的发生发展相关,其早期发 现对细胞学检查正常或核异变期泌尿生殖系癌症的早期诊断, 预防及治疗极为重要.HPV是小分子双链DNA病毒,据基 因片段序列的多态性分型,目前已有1O0余型被确定l】j. HPV各型序列与其生物学行为存在着高度相关性,不同型别 HPV可致人体不同部位的不同反应及疾病,有不同的致病危 害性.依据各基因型别在高,低危病变中分布的研究,将其分 为高,低危群.对多种型别HPV存在的检测,对了解病情,判 断预后及指导治疗有重要价值.目前对HPV感染的诊断, 主要依赖分子生物学手段对病毒DNA组检测,杂交捕获,斑 点杂交,狭线杂交,特异型探针等已广泛应用于HPV研究,但 由于只能检测到有限数量的基因型,需多重杂交反应;对同一 样本中多种基因型检测的敏感性不高,需要应用多重PCR;涉 及大量PCR产物分离及对每例临床标本的多次分析,不能常 规应用..通用引物系统可高通量检测广谱HPV型,具有广 泛用途,并在近年得到较大发展. 1MY09/ll—PCR系统 1989年,ManosMMl4等根据对各型HPVL1区序列的 分析,设计并应用了HPV通用引物MY09/ll,它能扩增多型 HPVL1保守区域的450bp片段,可用于对广谱HPV的检测. 但对临床标本的检出效率,敏感性偏低,因此在临床诊断中的 应用受到限制.但它为多种敏感度更高,扩增片段更短的通用 引物系统的发展奠定了基础. 2GP5/6一PCR和GP5/6PCR系统 1990年,SnijdersPJ等对各型HPV各区开放阅读框 (ORF)序列分析,发现各型序列的最保守区位于E和LORF 区,特别是两个20bp序列在L0RF中既高度保守又存在型间 差异.他们据此设计出两套通用引物:GP5/6和GPll/12一两 对2O个bp的引物;以此两套引物在中度严谨条件下退火,继 之以较高的温度或低Mg”浓度以减少背景,它能特异扩增L 保守区,即使在引物与靶DNA间存在3个错配碱基,也不影 响分析效率.该两套引物成功地用于对宫颈癌细胞系和临床 标本广谱HPV的检测,并且在低严谨条件下,仍具较强特异 性,与载体DNA无交叉反应.对不同细胞系CaSKi,Siha,He— la,C一1检测结果表明该两套引物可检测到 0.035-3.5copies/cellHPVDNA,敏感率达亚pg水平.除了 HPV一6b,一ll,一16,一18,一31和一33型,GP5/6还可检测到HPV一 13,一3O,一32型,适用于泌尿生殖道相关各型HPV检测;GP11/ 12则可成功地扩增HPV一1a,一2a和8型,更适用于皮肤相关各 型HPV检测.同年,又在此基础上发展了两步PCR法:GP/ TPCR以准确检测广谱HPV,GP—PCR中度严谨条件下预扩 增后,T~PCR引物混合物高严谨条件下扩增,产物与[a一P] dCTP标记的HPV探针杂交,确定检测结果.该法能在2h内 处理120个标本,是一种简便,快捷,敏感及特异性的高通量检 测方法,但检测型别有限. 1995年Ana—MariadeRodeHusrnanl6发现GP5/6引物 3端加上高度保守的3个碱基:GP5/6一PCR系统,对HPV 的检测更广谱,敏感性增加10—1OO倍,背景信号强度大大降 低,HPV阳性率从GP5/6的39%增加到GP5/6的43,并 且以型特异引物对GP5/6一PCR系统检测阴性而GP5/6一 PCR系统检测阳性的标本检测显示GP5/6覆盖HPV型别 的范围也增加至45型.但上述方法尚不能对检测到的多型 HPV进行明确的分型. 1995年.JacobsMV等在GP5/6一PCR基础上,发展 了一种高,低危群分型检测技术.从扩增区域中选出19个 HPV基因型的3O个寡核苷酸特异探针.所有探针均与其它 型别有6个碱基以上的不配对.GP5/6._PCR系统在低严 谨条件下预扩增,PCR产物与r-PdTP标记的HPV基因型 的寡核苷酸探针混合物杂交,所有探针均与相应型别的HPV DNA有特异性反应,无型间交叉反应,敏感性随HPV型别变 化:易扩增的HPV型如HPV一16,一18可达fg水平,不易扩增 的HPV型如HPV一39,一51可达pg水平,该套寡核苷酸探针无 论单独应用或混合应用都能达到较高敏感度,但操作较烦琐. l997年,jacobsMVL8发展了PCREIA法:生物素标记 GP6+引物,GP5/bio6一PCR产物被链酶亲和素包被的微孔 板捕获,与地高辛标记的探针杂交,在不同时间间期检测 405nm的0D值,该法能快速检测14个高危及6个低危型 HPV,依HPV不同类型敏感度从1fg到Pg,与放免法比较,符 合率达96%,并且以单独一型HPV感染的光密度值做参照, 可检测多重感染,且OD值随着病毒拷贝数的增加呈线性增 加,可半定量检测. 2001年,HartKWlg在GP5/6-PCR系统基础上,设计 了一种称之为实时PCR基础上的VESPA(viralevaluationu— singself-probingamplicons)法.该技术的关键在于各HPV型 “蝎子”引物的设计应用:该引物的两端互补整个引物形成茎环 结构,5端标记六羟基荧光素(FAM),3端携带荧光猝灭及封 闭成分,在紧靠茎环尾部含GP6+通用引物序列,茎环主干区 则含有可与GP5/6一PCR系统扩增DNA序列中互补的各 型HPV特异探针序列.GP5/6+_PCR系统预扩增后,”蝎 子”引物的茎环主干区中各型HPV特异探针序列与扩增产物 中相应靶序列特异互补杂交,六羟基荧光素集团与荧光猝灭及 封闭成分分离,解除荧光封闭,激发荧光,得到检测.对108例 石蜡切片,宫颈刷片等标本的检测表明,该技术具快速,自动, 特异,敏感,高通量的特点,并能用于估计每个细胞病毒载量, 有助于细胞病毒载量与疾病分级关系的研究,但显然”蝎子”引 物的合成及储存需较高的成本及条件. 2002年,Van—Den—BruleAJ又对常见37型HPV的 GP5/6一PCR产物设计出一种简单,快速,非放射反向狭线 杂交检测法.以平行线的模式加入37型HPV寡核苷酸做探 针并斑点固定于羧基包被,EDAC激活的尼龙膜上,与生物素 标记的PCR产物杂交,以链酶亲和素复合物处理,印膜,冲洗 国外医学临床生物化学与检验学分册2003年第24卷第2期 判断结果.该方法能同时检测42个PCR产物的HPV分型, 每膜能反复使用15次而不影响结果,与PCR—EIA敏感性相 同,高特异,无型间交叉,实验成本较低,已初步具备小型生物 芯片的规模. 3SPF—PCR系统 PCR检测DNA的敏感度与扩增片段长度成反比,特别当 检测福尔马林固定,石蜡包埋的组织切片时,提取DNA的质 量较差,不易扩增,使得PCR效率降低.为进一步提高敏感 度,1998年KleterB等_1设计了又一套通用引物,该套引物仅 扩增L1区域内65bp短片段,与GP5/6一PCR和MYo9/l1一 PCR系统扩增的较大目的的片段150bp和450bp相比,更易 扩增,敏感性更高.他们采用标记生物素的SPF—PCR通用引 物系统,扩增各型HPVL区中65bp目的片段,然后采用多种 方法检测标记上生物素的PCR产物:1杂交捕获:PCR产物于 亲和素包被的微孔板中与地高辛标记的HPV核苷酸探针杂 交后.加碱性磷酸酶结合的地高辛抗体,底物显色.2South— ern-blot杂交:PCR产物电泳分离,转移至尼龙膜,与P标记 的HPV核苷酸探针杂交,放射自显影.该SPF—PCR系统可 用于细胞刮片,石蜡切片等多种标本类型,检测至少43个基因 型.在细胞正常和非典型增生患者人群中,病毒载量低,SPF- PCR系统能够检测到MYo9/11一PCR,GP5/6一PCR,GP5/6一 PCR系统检测不到,低拷贝的HPVDNA,对细胞核异常群的 HPV检出率达98.4,GP5/6一PCR仅63.6%(中度异常)和 82.6(严重异常),GP5/6一PCR则为71,76(中度异 常)及86,94(严重异常).近年,vanDoornLJ等在此 系统的基础上,以反向探针杂交线分析法检测和确定HPV 型.他们对SPF—PCR片段直接序列分析证实引物区域内持续 特定的序列改变,可用于识别不同的基因型.据此合成25个 HPV基因型的特异探针,平行线性固化干Nc膜上,与标记生 物素的PCR产物杂交,加入碱磷酶标记的链霉亲和素复合物 孵育,底物显色.该检测技术对25型HPV都具较高敏感度. 其中细胞学检查正常及非典型增生组HPVDNA检出阳性率 达83.7,低危群HPV型感染率为24,细胞核变异组,检出 阳性率达98.4%,缺少或无低危型HPV感染,所有病例均检 出高危型HPV,石蜡包埋官颈癌切片,检出阳性率达100. 4发展趋势 HPV是一种在人群中极易传播扩散的DNA病毒,可通 过直接或间接接触交叉传染,其感染部位隐蔽,发病隐匿,不易 早期发现,可致多种增生性病变:良性,癌前性及癌性病变.在 女性生殖系统最常见的恶性肿瘤官颈癌,99以上的患者存在 HPVDNA感染,在世界范围内,每年约有50万妇女新发宫颈 癌,8O的患者在确诊时已经发展为浸润癌.近5O年来国内 外普遍应用脱落细胞防癌筛查,但在仅查到细胞学改变的患 者,50已存在侵袭性宫颈癌.特别是近年,我国每年新增 宫颈癌病人15万人左右,且由于HPV感染增加,患者年轻化 趋势明显.高危型HPV持续存在与官颈上皮新生物高度相 关,某些类型的HPV感染很有可能最终致官颈癌变,从一般 的宫颈癌前病变发展成官颈癌约需10年的过程.定期进行 HPV分型检测对细胞学正常及非典型增生群,对预警官颈细 胞癌变倾向,及时发现和预防,治疗早期官颈癌极为关键. HPV检测的研究一直受到国内外学者的高度重视. HPV各型在标本中的确认,取决于所用方法,直接杂交法检出 率低.综上所述的各类通用引物系统能够检测HPV,但有各 自的局限性及特殊要求,无法满足在临床检测中短时间内,高 通量获得患者感染的HPV病毒类型及机体反应的大量相关 信息.由于诊断技术方法的限制.目前对该类病毒感染相关疾 病的诊断,预后判断,治疗措施的应用均存在较大的滞后和盲 目性.因此发展一种快速,可靠,敏感,特异及简单的HPV检 测方法并应用于临床检测,用于指导患者的治疗,并监测,预警 75 患者的病情发展及患相关病变特别是癌症的可能迫在眉睫,生 物芯片技术的发展也为其提供了充足的技术支持. 参考文献 1ChanSY.DeliusH,HalpernAL,eta1.Analysisofgenomic sequencesof95papillomavirustypes:unitingtyping?phy— 3083. logeny,andtaxonomy[J].JVirol,1995,69(5):3074— 2HagmarB.ChristensenJJ,JohanssonB,eta1.Implications ofhumanpapillomavirustypeforsurviva1incervicalsqua— mouscellcarcinoma[J].IntJGynecolCancer,1995,5(5): 341—345. 3CastlePE.LorinczAT,Mielzynska—LohnasI,eta1.Results ofhumanpapillomavirusDNAtestingwiththehybridcap— ture2assayarereproduc|b1e[J].JClinMicrobiol,2002,40 (3):1088—1090. 4ManosMM,TingY,WrightDK.eta1.Theuseofpolymer— asechainreactionamplificationforthedetectionofgenita1 humanpapillomavirus[J].CancerCells,1989,7(1):209— 214. 5SnijdersPJ,Var卜Den-BruleAj,SchrinemakersHF.eta1. 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