犬冠状病毒YS1株人工感染犬试验

犬冠状病毒YS1株人工感染犬试验 犬冠状病毒YS1株人工感染犬试验 三口f21 0J一上 天冠状病毒YS1株人工感染犬试验一余春l 犬冠状病毒YSI株人工感染犬试验l朔.22 , 夏成&盎牲黄邱啸环lI魏国庆4姗弓 (1.解放军军需大学军事兽医研究所,吉林长春130062;2.成都军区后勤部军事医学研究所,四川成都610000 3.吉林农业大学动科系.吉林长春130018;4.黑龙江省武警总趴警犬基地.黑龙江哈尔滨150036) 廒置 关键词:g各三盎基;墨易敉牺与悭眄, 摘要:使用从菔泻犬体内分离获得的犬冠状藕毒YS1第5代CRFK钿胞培养物(毒价为1o5TCID50/0.ImL).以不同 荆量人工感染50只2--3月龄健康动犬,结果14d内计有16只天发藕,其中l4只耐过,2只死亡,发病率为32%,死亡 卓为125%.惠犬粪便经电镜检查和RT—PCR检剥.前者见有CCV样病毒.后者扩增出CCV特异核酸片段.48只试 验犬血清对谊藕毒的SN抗体皴价随接毒量的不同分别平均为1:310,1:245,1:185,1:115和1:86.妁为相近量美国犬 冠状病毒NL一18株免疫犬的SN抗体效价的2倍.表明YS1是一株免疫原性强的CCV强毒抹. TheExperimentalInfectionStudyonthePupswith CanineCoronavirusYS1Strain YUChun.XIAXian—zhuetal (TheMilharyVeterinaryInstituteQuartermasterUniversityofPLA.Changchun130062.Ch ina) KeyWords:CCV;experimentalinf~tion;canine Abstract:FiftyCanineCoronavirus(CCV)susceptiblepupsweinducedtoirdectthefifthpassagecultureinCRFKceltoiCCVYSIstrain. whichwasisolatedfromthefeces.fthedogwithd/arrheaThedinicalsymptoresandpat]~lngica]changeswereohservedon16pupaofthetest groupduringtwoweeks,andmorbilitywere32%,mortality125%r~pecrivdyTypicalCCVvirionseoh~edIromthe,~amples0f pupsEhnegativestainingelectrocmlcroseope.andh'sfurtherulass~fiedin?CCVhyRT— PCRtestTheaveragetite~0fCCVSNantil~dy 0ffoffty—e嗜htpupawere1:310,1:245.1:185.1:115蛐 d1{86resp~fvely.at'tmrbeinginocuhtedbydifferentCCVYS1titersTheave titersotCCVSNwereabouttwotimestlmathatoft}dogswhichreimmunedwiththesameciter0fUSCCVNL一18strab~Ther~ulm edthatCCVYS1stramwas"virulentstrainwithgoodimmuogenidty.andmayheusedasavaccinesstrain 中圈分类号:$852.655文献标识码;A文章编号:1004—7034(2000)02—0001—02 犬冠状病毒(cA3v)性肠炎是犬的一种高度接触性传染病,挑选符合I.2所述条件的 幼犬55只,分为6组,前5组为 该病以严重脱水,呕吐和血便为特征,对幼犬的危害严重,发病人工感染组,每组L0 只,分别肌肉注射不同量的试验用病毒 率和死亡率都很高,是目前对养犬业危害较大的疾病之YS1V5,其中1,3组分别 接种YS1原液16,4和LmL,第 一 Ll_2】 .胡桂学等?在"犬冠状病毒的分离与鉴定论文中报4组接种10倍稀释的 YS12.5mL,第5组接种100倍稀释 道了我们对犬冠状病毒(CCV)YS1株的分离与初步鉴定,为查的YS1V5625mL,第 6组5只犬不接种作为健康对照,各组 明所分离的YS1株是CCV自然弱毒株还是流行强毒株以及隔离饲养. 该毒株对犬的免疫原性,我们进行了该株病毒的人工感染犬试1.4试验步骤 验,现将结果报告如下.14.1临床观察试验期间逐日观察并记录动物I临床症状. 1材料和方法包括精神,食欲,体温和粪便性状等,于接种后14d,统计全部 1,1试验用痛毒发病犬和病死犬数,并接Reed—Muench法计算YS1V5的 人工蒜染用的病毒为胡桂学等b分离鉴定的CCVYS1株[Dso值. 第5代CRFK细胞培养物.其毒价为10TCIDso/0.1mL,测定 中和抗体用的指示病毒为YS1v5和CCVNL一18株,前者即 人工蒜染试验所用病毒,后者为犬冠状病毒标准毒株,由本室 殷震院士从美国引进.其毒价亦为10TCIDso/0.1mL. 1.2试验用犬 为CCV血清中和抗体效价小于1:2的2,3月龄CCV易 感的健康幼犬. 1,3人I感染试验与分组 收稿日期:1999—07—26 基叠项目:"九五"全军医药卫生重点基空课题资助项目. 四川键为县人,助理兽医师 第一作者简介:奈春(1973一),男, 在读硕士研宄生, 14.2病理解剖学检查对病死犬及时进行病理解剖学检 查,观察并记录胃,肠,肝,肾等脏器的病理变化. 1.4,3中和抗体检测采用固定病毒一稀释血清法.将接种 当天收集的犬血清作1:2,1:64倍稀释,而接种14d后收集 的犬血清作1:32,1:1024倍稀释,稀释后的血清分别与等体 积的指示病毒液(毒力为2×10TCID~0/01nlIJ)混合,经 25"C,2b感作后,分别加人24:yL细胞培养板,每个稀释度加 4孔,每孔加01mL;然后每孔加人分散并稀释成 30x10个/rnL的细胞悬液lmL,置5%O()2温箱内(37?, 60%,80%湿度)培养.同时设阴,阳性血清对照.4d后爿 定结果,以每孔完全不出现拉网状的融合细胞为中和标准,按 Reed,Muench法计算血清的50%中和散价. 1.4.4病毒学检查 2黑龙江盲牧兽医2000年弟2期 14.41电镜负染检查试验期间收集各组试验犬的少许粪 便,分别用pH7.2,0.01toolPBS翩成1:10悬液,3000r/nfin 离心10rain,取上清液用200目铜网沾取.经磷钨酸染色后,进 行电子显锻毓观察. 1.442RT—PCR检测参照胡桂学等报道的方法进行. 取各组试验犬的少许粪便,经144.1中所述方法处理,取上 清液按Chomc~yskiP等报道的"异硫氰酸胍一酚一仿抽提 分离RNA一步法"提取总RNA.然后用CCVS蛋白基因的一 对特异引物进行RT—PCR检测. 2结果 2.1临床观察蛄果(见表1) 在接种YSIV的50只犬中计有16只发病,其中有l4只 耐过,2只死亡.病犬表现为精神抑郁,嗜眠,厌食,呕吐,排稀 软而带粘液粪便,病初常突发呕吐,而后腹谭或两者同时发生. 从表I中还可看出发病犬的数量及病情严重程度明显与接种 量有关,接种量最大的第1组发病犬散最多并有2只死亡.而 接种量最少的第5组投有一只犬发病,按Reed—Muench法计 算其I.为10TCID~o,即接种毒价为10TCI.的YS1V5 38mL便可使半数试验犬发病. 22病理解剖学捡查蛄果 两只病死犬剖梭发现其肠壁菲薄,骑臂扩张,骑内充满黄 绿色内容物,肠系膜淋巴结出血水肿,胃肠粘膜脱落,腰囊肿 大.肝和肾变性. 2.3中和抗体捡洲站果 接种当天和14d后的犬血清对YS1V5和CCVNL—l8 的SN抗体效价检测结果见表2.可见接种当天所有犬的SN 抗体效价均小于1:2,接种15d后除第6组的5只对照犬的血 清SN抗体效价仍小于1:2外,其余5个试验组的4B只犬血清 对YS1V的SN抗体效价均明显升高,其平均值分别为 1:310,1:245,1:185,1:115和1:8,第5组10只犬对 CCVNL一18的SN抗体平均价为l:89. 24病毒学捡查蛄果 24.1电镜负染检查结果电镜观察结果见表1,在所有呈 现CCV临床感染症状的患犬粪便中均发现了典型的犬冠状病 毒粒子,而其他试验犬则未曾观察到. 2.4.2RT—PCR检测结果用CCVS基目的一对特异引物 对各组试验犬的粪便进行RT—PCR检测,结果见表1,所有呈 现CCV临床感染症状的患犬样品(包括只病死犬)均扩增出了 与理论设计值相符的CCV特异核酸片段,而其他试验犬的粪 便样品RT—PCR结果全部阴性. 表1YS1V5人I意染犬试验结果 注:表示分于代表发生病理变化的犬散.丹母代表检查的总犬敦, 即死亡犬敦;."表示未做病理解靓学检查. 3讨论 犬冠状病毒性昕炎是犬的一种高度接触性传染病.呈世界 性分布,我国亦有军犬,警犬,实验犬和民用犬发病的报道,且 表2SN抗体效价捡测结果 注;"?表示第1组有2只犬死亡,故只检测了8只犬的8N抗体技价i "?表示未测定其对于ccVNL一18的SN抗体效价. 有流行趋势.近年来,在我国随着犬瘟热,犬细小病毒性肠炎 等疫苗的研制成功和广泛应用,犬的这些急性,恶性传染病基 本得到了控制.而犬冠状病毒性肠炎则成为严重威胁我国养 犬业的重要疫病之一.所以开展CCV的病原诊断及防治研 究.对于建立可靠的CCV薅染诊断方法和研制有效疫苗,具有 重要的理论和实际意义.本研究使用CCVYS1株的第5代细 胞培养毒对50只CCV易感犬进行了人工感染,结果有16只 发病,l4只耐过,2只死亡.病犬表现为精神抑郁,嗜眠,厌食, 呕吐,排稀软而带牯液粪便等CCV临床症状,病死犬呈现胃牯 膜脱落,肠壁菲薄,肠系膜淋巴结出血水肿等病理变化.电镜 负染检查呈现CCV临床感染症状的患犬粪便,均发现有典型 的犬冠状病毒粒子;进一步用CCV特异引物对其进行RT— PCR检测.结果均扩增出与理论设计值相符的特异CCV核酸 片段.说明YS1V5可使CCV易感犬发病甚至死亡,为一株 CCV流行强毒 试验犬血清对YS1V5的SN抗体平均效价1,5组依次 为1:310,1:245,1:185,1:115和l:86.其中第5组10只犬的 血清对CCVNL一18的sN抗体平均效价为l:89,与对YS1 V5的1:86的SN抗体平均效价相比,十分相近,说明YS1V5 与CCVNL一18的抗愿关系十分密切.另外,将本狄试验犬血 清对ccVNL一18的SN抗体平均效价与William等报道的用 相近毒量(10TCIo)免疫ccV易感犬结果相比,前者SN抗 体效价平均为1:89,后者平均为1:48,初步说明YSIV5的免 疫原性强于CCVNL一18,这样,我们下一步就可以利用动物 病毒强毒株在组织细胞培养中,鸡胚内或在非宿主动物体内连 续传代能减弱病原致病性的原理.将该株CCV强毒株在CCV 钝感细胞上连续传代驹化致弱,再进行驹化弱毒的免疫研究. 从而为研制犬冠状病毒弱毒疫苗提供一株安全,免疫原性好的 种毒株 参考文献: 【1]T~ramtBLGaskellRC.J?CJ.et8tudi~onthet一 zootiotogyofcaJ-eooronavlrus[J]VeterinaryRecord,1993,132 (2):7,1l 【2]夏戚柱.养犬太全【M]长春:吉林人民出版社,1993.561,564 【3]胡桂学.夏成拄,部啸环,等犬冠状病毒的分离与鉴定【A]中国 畜牧兽医学会传染病丹会中国畜牧兽医学会传染学分会第四届 全国会员代表大会鬟第七次学术研讨会论文集【C]上海:上海 市畜牧兽医学会,1997.527,530 【4]胡桂学,邹啸环.夏成柱,等犬冠状病毒RT—PCR柱测方法的 建立和韧步应用【J]吉林农业大学.1997,19(4):78,84 【5]Chomezynsk5P.SaochiNSingle—stepmet]2odofRNAisolationby acidgranidiniumthiocyanatephenol—chloroformexr~ctinn【J] AnalyticalBiochemistry.1987,162:l56,159(009)