【doc】 新生仔猪产肠毒素性大肠埃希氏菌致病因子的分子生物学研究进展

【doc】 新生仔猪产肠毒素性大肠埃希氏菌致病因子的分子生物学研究进展 新生仔猪产肠毒素性大肠埃希氏菌致病因 子的分子生物学研究进展 中国兽医科技2005.35(10):837—842 ChineseJournalofVeterinaryScienceandFechnology 新生仔猪产肠毒素性大肠埃希氏菌致病因子的 分子生物学研究进展 卫广森,许崇波.,孙宇. (1.中国农业科学院兰州兽医研究所,甘肃兰州730046;2.大连大学生物工程学院, 辽宁大连116000;3.辽阳市动物防疫站,辽宁辽阳1li000) 摘要:阐述了新生仔猪产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)菌毛的结构,分子生物学特性,基因 检测技术,菌毛抗原受体的生化特性以及菌毛载体系统的优点;另外,从分子结构与功能,作用机 理,基因检测三方面叙述了新生仔猪ETEC不耐热肠毒素和耐热肠毒素的研究进展. 关键词:产肠毒素性大肠埃希氏菌;新生仔猪;菌毛;不耐热肠毒素;耐热肠毒素 中图分类号:S852.6l2:Q7l0l文献标识码:A文章编号:1000—64l9(2005)l0-0837—06 Advanceonmolecularbiologicalstudyoncausalagents 0fenter0t0xigenicEscherichiacoliinnewbornpiglets sen,XUChong—bo.,SUNYu WEIGuang— (1.LanzhouVeterinaryResear~hInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScien~es,Lanzhou730046,China: 2.CollegeoJBoP”g77Pr” 冀,DalianUniversity,Dalian116000,China;3.LiaoyangPrefectural Q”?rantineStationforAnimals,Liaoyang111000,China) Abstract:Structures,molecularcharacteristicsandgenedetectiontechniquesofenterotoxigenicEsc- herichiacoli(ETEC)fimbriae,biochemicalcharacteristicsofreceptorstothefimbrialantigens.andmerits ofthefimbrialvectorsysteminnewbornpigletswerereviewed.Besides,molecularstructures,functions, mechanismsandgenedetectionofbothheat——labileandheat——stableen terotoxinsofETECinnewbornpiglets werediscussedbrieflytoo.. Keywords:enterotoxigenicE(1herichiacoli;newbornpiglet;fimbriae;heat—labileenterotoxin;heat— stab】eenterotoxin 产肠毒素性大肠埃希氏菌(Enterotoxigenic Escherichiacoli,ETEC)是引起新生仔猪大肠埃希 氏菌性腹泻的病原.ETEC以其菌毛与新生仔猪小 肠上皮细胞的受体结合,在肠道内定居并大量繁殖, 产生肠毒素,引起剧烈腹泻.由于菌毛与肠道受体 的结合是ETEC导致仔猪腹泻的先决条件之一,所 以菌毛又称为定居因子(colonizationfactor,CF)或 黏附素,对其抗原也相应地称为定居因子抗原(col— onizationfactorantigen,CFA)或黏附素抗原. ETEC产生2种肠毒素,一种是不耐热肠毒素 (LT),另一种是耐热肠毒素(ST).菌毛和这2种 肠毒素是ETEC的主要致病因子. 1菌毛 菌毛是一类表达于细菌细胞膜表面,长约 0.5,3.0m,在电镜下呈丝状的蛋白质.通常由多 达100个相同的结构亚单位和各种不同的微小辅助 蛋白构成1.菌毛是致病性大肠埃希氏菌感染动物 的先决因子,它使致病菌附着于肠道上皮细胞上,避 免因动物消化道不断蠕动而被迅速排出,为细菌大 量生长繁殖和产生肠毒素致病创造条件.至今已从 猪源大肠埃希氏菌中发现了K.(F),K..(F), 987P(Fe),F1s,Ft,Fz,Ft.等菌毛,F..,F..与仔猪 水肿病密切相关,其他菌毛主要与仔猪腹泻有关. 收稿日期:2005—07—06 作者简介:卫广森(1956一),男,辽宁西丰人,研究员,博 士.Tel:0931—4960932,E—mail:weiguangsen@126.COrn 838中国兽医科技第35卷 1.1菌毛的分子生物学特性 1.1.1F(K)茵毛编码F菌毛抗原的基因位 于一个大的非结合性质粒上.Fab由l0个基因 ({aeA,faeJ)编码,相应的多肽命名为FaeA, FaeJ,这些多肽参与F菌毛的生物合成.Fab和 Fac的faeC,faeH,faeG基因序列对比分析显示, Fab和Fac的血清型差异由faeG基因决定.编 码F抗原的基因与编码棉籽糖降解酶的基因(Raf) 常位于同一质粒上,两基因相距30kI).这种基因结 构特点赋予了猪源ETEC选择优势,因为棉籽糖降 解酶降解了猪肠道内能够与菌毛竞争肠道受体的棉 籽糖.位于F菌毛上的抗原是一个多肽聚合体,其 中G蛋白是菌毛的主要亚单位,决定菌毛的黏附特 性;D蛋白是外膜蛋白,起支撑作用;另一种多肽可 能与菌毛的生物合成有关,C,F,H蛋白是菌毛结构 的更小组成成分.另外,研究证实,Fac抗原亚单 位基因位于F抗原基因的HindII1酶切片段上. 1.1.2F(K..)菌毛编码F菌毛抗原的基因位 于可结合的质粒上,质粒分子质量为50,57Mu,该 质粒还同时存在编码ST的基因和一些抗生素抗性 基因,编码F的基因已克隆成功.据报道,重组质 粒pFK99中含8个结构基因,根据编码多肽的分子 质量不同,分别将其编码多肽命名为P10.2,P10.9, Pl8.2,P76,P2l,P26.5,P33.5和P19.8,在编码的 8种多肽中至少有7种参与F抗原的生物合成. 1.1.3F(987P)茵毛编码987P抗原的基因所 在位置因菌株不同而异,有的在染色体上,有的在质 粒上或同时位于染色体和质粒上!,并且在体外保 存或传代中易丢失.987P菌毛由8个基因(fasA, fasB,fasC,fasD,fasE,fasF,fasG和fasH)编码,编 码的相应多肽称为FasA,FasB,FasC,FasD,FasE, FasF,FasG和FasH,其中FasG亚单位与肠上皮细 胞的黏附有关3].Schifferli等用987P核酸探针 与987P株的几种质粒进行杂交检测,发现987P 抗原基因位于35,40Mu的质粒上.STa基因也 位于同一质粒上.因此,987P菌株通常产生STa. 1.1.4F茵毛编码F的基因位于染色体上. vanZijderveld等用单克隆抗体鉴别出5种抗原 决定簇(F,F),并证明这些抗原决定簇位于 F菌毛抗原的29ku亚单位上.同时证实F…抗原 决定簇介导了F菌株对猪小肠上皮细胞的黏附 和猪红细胞的凝集. 1.2菌毛抗原的基因检测技术 1.2.1核酸探针技术核酸探针技术是从20世纪 80年代初期发展起来的一种基因检测技术.核酸 探针是一段带有标记的能与被检核酸发生互补配对 的核苷酸片段,能检测出被检样品中所存在的特定 DNA序列,因而能够从基因水平上做出检测.常用 的核酸探针杂交试验有Southern印迹杂交试验,菌 落杂交试验和斑点杂交试验3种,这些杂交方法比 E11SA,玻片凝集试验更敏感. 1.2.2PCR检测技术PCR检测技术可从基因水 平检测菌毛.具有操作简单,快速的优点,不需要对 细菌进行菌毛化培养,克服了有些菌株体外培养条 件苛刻的不利因素.对细菌培养物仅需3,4h即 可得出结果. Franklin等6建立了检测和鉴别大肠埃希氏菌 K..不同变异型菌毛抗原的PCR方法.采用K.. 菌毛基因通用引物和特异引物扩增出相应长度的 DNA片段,结合限制性内切酶分析来鉴别Kab, Kac和K.ad3种变异型菌毛抗原.陆桂平等 建立了检测肠毒素性大肠埃希氏菌K.菌毛基因的 PCR方法,该方法具有很好的特异性和敏感性,能 检出l0CFU/mI的细菌.李鹏等8研制了K一 K..PCR诊断试剂盒,应用该试剂盒可以对ETEC 中K.,K.菌毛蛋白结构基因中的保守特异性核酸 序列进行同步扩增,通过对扩增产物的检测来判断 2种菌毛蛋白核酸的存在,适用于ETEC感染者的 快速鉴别. 1.2.3单链构象多态性分析单链构象多态性分 析(Singlestrandconformationpolymorphism, SSCP)的原理是单链DNA分子因单一核苷酸不同 而使其二级结构有所差异,表现在非变性凝胶电泳 中电泳迁移率的不同.该方法多用于检测肿瘤与正 常组织基因的点突变.Bosworth等q成功应用该 方法检测了大肠埃希氏菌F.菌毛亚单位基因 (fedA)在不同菌株之间的差异,并鉴别了Fab 和F18ac菌株. 1.3菌毛抗原的受体 致病性大肠埃希氏菌在肠道的定居是通过其表 面的黏附素与肠上皮细胞刷状缘上的特异性受体结 合来实现的,同时由于这些受体在肠道各段的分布 不均匀,使表达不同黏附因子的大肠埃希氏菌表现 出相应的组织嗜性.其中D一半乳糖是K.的受体, 主要表达于小肠;神经节苷(GM)和D一半乳糖是 K..的受体,糖蛋白,D一半乳糖和L岩藻糖是987P 的受体,两种菌毛受体主要在回肠表达;D一半乳糖 是F的受体,主要在小肠表达.这些受体都已 从肠道上皮细胞上分离,大多数受体的结构也已清 楚.已证实,在遗传上无显性K受体基因的猪群, 第10期卫广森等:新生仔猪产肠毒素性大肠埃希氏菌致病因子的分 子生物学研究进展839 K.菌株不能黏附在其仔猪小肠上皮细胞上;相 反,具有相应基因的猪群,K菌株则能黏附于其 肠道上皮细胞上l】. 猪大肠杆菌病具有明显的年龄特征,黄痢主要 发生于1周龄内的仔猪,白痢主要发生于10,30Et 龄,猪水肿病多在断奶前后出现.这种特征可能与 猪肠道黏膜上皮细胞上受体的表达水平有关. Dean[1纠比较了1日龄,3周龄无菌猪和3,4周龄 断奶仔猪小肠上皮刷状缘和肠道冲洗物中987P菌 毛受体的情况.发现987P敏感猪(新生猪和无菌 猪)和987P抗性猪(较大的猪)的肠上皮细胞刷状 缘都存在987P受体(987R),分子质量为33,40 ku.在987P抗性猪的肠道冲洗物中检测到l7ku 的987P受体(987M),而在987P敏感猪(新生猪和 无菌猪)中仅检测到微量的987M.这表明,新生仔 猪(小于6日龄)对987PETEC敏感,而较大的仔 猪(大于3周龄)不敏感,是由于较大猪的小肠黏液 中987P受体(987M)抑制了987P—ETEC对小肠 上皮细胞刷状缘的暖附,从而抑制了987PETEC 在仔猪肠道的定居.Willemsen等,调查了猪的日 龄与其肠道内K受体的相关性,发现7日龄和35 日龄猪肠道内的黏液中含有K受体,而在180日 龄的猪肠道黏液中几乎检测不到K受体.存在于 肠上皮细胞刷状缘上的受体与猪的日龄无相关性. 1.4菌毛载体系统 利用菌毛载体系统表达外源基因有许多常规表 达载体无法比拟的优点.菌毛载体拷贝数高,每个 菌体都含有数百根菌毛,每根菌毛由上千根单体组 成,每个单体都有外源基因表达,所以其外源基因表 达量较高;菌毛具有很强的免疫原性,能增强机体对 融合菌毛中外源蛋白的免疫应答,特别是菌毛蛋白 具有黏附特性,可有效激发黏膜免疫应答;菌毛抗原 易于提取纯化,有利于亚单位疫苗的批量生产. 刘永庆等对K.菌毛形成亚单位基因(fanC) 进行了克隆和测序,分析了fanC作为生长抑制素外 源表达载体的可行性.结果,fanC片段具有一个非 常突出的亲水区,是抗原决定簇所在的部位.一般 来说,天然抗原决定簇都位于蛋白的外侧,亲水性较 强,这些部位可以允许氨基酸的缺失,替换和插入. 因此,从理论上讲,fanC基因具有非常明显的抗原 决定簇部位,能够成为外源小肽基因的表达载体. 2不耐热肠毒素(LT) IT根据抗原性可分为IT—l(又分为人源 I.Th—I和猪源I.Tp—I)和IT—II(又可分为在血清 学上不相关的IT—IIa和IT一?b).编码ITh—I和 ITp—I的基因位于质粒上,具有高度的同源性;编 码LT一?的基因则位于染色体上,这些基因已被克 隆和测序. 2.1LT的分子结构 IT与霍乱弧菌毒素(Choleratoxin,CT)在结 构和功能上相似,各种LT的分子质量约为85ku, 含有1个分子质量为25ku的A亚单位和5个分子 质量为l1ku的B亚单位,它们以非共价键结合的 四级结构而形成全毒素.完整的IT分子或B亚单 位都有良好的免疫原性.IT在基因结构,DNA序 列上表现出高度的保守性,广泛分布于不同寄主来 源的大肠埃希氏菌中.它由1个A亚基和5个B 亚基构成.A亚基能催化真核细胞中与调控腺苷酸 环化酶有关的一种膜蛋白腺苷二磷酸糖基化,是毒 素的毒力活性部分.B亚基与靶细胞膜的组成部分 GM1结合,介导A亚基进入,是毒素主要的免疫原 性部分,在免疫学上具有重要意义. 用重组DNA方法研究表明,IT基因由A和B 两个顺反子组成,这2个顺反子位于1.8kb的 DNA片段内.此等长的DNA片段足以编码600 个氨基酸的IT蛋白,LT的亚单位eltA和eltB的 顺反子是作为一个单位转录成mRNA的.启动子 位于eltA的氨基端.eltA和ehB的2个顺反子之 间被200bp顺反子隔开.2个顺反子有一l8个氨 基酸的信号肽序列,2个顺反子的产物通过细 胞膜分泌于胞外,2个亚单位蛋白再聚合成IT完 整毒素.Mass等用易位子3(Tn3)和易位子5 (Tn5),插入ETEC染色体和产生肠毒素的质粒 DNA,对IT基因产物发生极性效应,从而获得高 产IT的突变株.研究认为,丝裂霉素C促进LT 合成的机理可能是通过诱导ETEC的温和噬菌体 而实现的.可见,产生IT的遗传因子质粒,不仅因 结合而被传递,也可因噬菌体的转导而传递. 2.2LT的作用机理 LT以ITn亚单位与细胞膜上GM1神经节苷 脂和糖蛋白受体结合,A亚单位以同样方式进入细 胞中.在进入肠上皮细胞后,A亚单位裂解活化为 A1和A2两个片段,其A1片段激活胞浆内的AC (腺苷酸环化酶),并使其活性不可逆,致使cAMP 水平增高,从而改变细胞膜对水和盐离子的通透性, 导致腺上皮细胞分泌功能亢进,引起C1,Na, HCOs一和水在小肠内分泌增加,超过肠管重吸收能 力,从而导致腹泻.过量的分泌导致脱水及代谢性 酸中毒等,进而引起仔猪死亡16,17J. 840中国兽医科技第35卷 IT作用缓慢而持久,可导致肠管中液体缓慢 蓄积,一般在毒素作用后3h肠内液体开始蓄积, 7,12h达到高峰,至少可持续18h,继而逐渐下降, 直至24h仍能保持一定水平. 2.3LT的基因检测技术 2.3.1基因探针技术Seriwatana曾以P标记的 DNA探针检测IT,其结果与细菌培养相比,前者 的敏感性和特异性为71和90,后者为59和 86,与Y1.肾上腺细胞试验的符合率为100%. 2.3.2PCR技术()live等用Klenow聚合酶扩增 了IT基因,然后用生物素标记的探针检测扩增产 物,使探针的敏感性提高到了1×10.CFU/mI.同 年他又改用TaqDNA聚合酶用20个核苷酸引物 对目的基因IT片段进行扩增,扩增产物通过电泳 或磷酸酶标记的23nt寡核苷酸探针进行检测,经 30个循环,可检测到单个菌落.Michael等检测了 4O份细菌学试验阳性的粪便标本(其中16份IT 和24份IT),从100I的粪便标本中提取总量 DNA,并用离子交换柱进行纯化;经检测,16份细菌 学检查阳性的标本,IT全部阳性,另外有1份粪便 标本(细菌学检查IT)经杂交试验和PCR检测为 IT.此结果表明,IT基因是存在的,可能没有表 达或表达量很低,用一般生物学方法无法检测出来. 经PCR技术对特异DNA序列扩增,提供了一个高 敏感性,高特异性,直接从临床标本中检测病原的方 法,而无需进行细菌的分离培养. 3耐热肠毒素(ST) 根据抗原性及宿主差异,ST分为ST.(STa)和 ST.(STb)两类.导致仔猪腹泻的主要是ST.. 3.1ST.的分子结构与功能 ST.在菌体内首先合成72个氨基酸的前体, ST.前体由1,19氨基酸前区,20,54氨基酸后区 和55,72氨基酸成熟区组成.前区为ST.类保守 的领头肽.在ST.mRNA翻译开始时便为信号肽酶 所切割;后区在ST.通过内膜进入细胞间质过程中 有重要作用;要成为成熟ST,转运后的后区ST必 须经过加工和分子内正确二硫键的形成.成熟的大 肠埃希氏菌ST为18,19个氨基酸的多肽,ST含 有13个高度保守的氨基酸序列(5,17氨基酸),这 段氨基酸小肽保留了ST的完全毒性,为一毒性区, 具有与天然毒素相似的受体蛋白结合能力.保守区 内的6个Cys组成Cys5Cysl0,Cys6Cysl4和 Cys9一Cysl7共3个分子内二硫键,其中Cys6一Cysl4 组成的二硫键与ST毒性有关而最为重要,其他2 个二硫键在维持分子结构上起作用,从而使ST成 为完整的结构.所有组成氨基酸的侧链都面向分子 的外面,说明ST.具有疏水特性,Asnl1一Alal3侧链 形成一个特殊的突起凸出分子表面.除Cys7/ Glu7,Alal5和Glyl6外,所有NH基团都包埋在分 子内,与分子内或转角内氢键有关.第二转角区 是受体的主要结合部.ST.也是一种阳离子结合 肽,目前对于由膜结合鸟苷酸环化酶C(GC—c)受体 蛋白介导的信号传导途径与Ca.刺激液体分泌的 关系还不清楚,也未阐明ST.是如何作为一种离子 携带者的.从ST.第二转角区侧链在毒性作用中 的重要作用可知,受体表面疏水区与ST.,Alal1侧 链紧密结合以及毒素分子与受体蛋白的结合主要都 是通过相互疏水作用完成的.ST.三维结构中间区 形成疏水核心及胆盐可解离ST.受体复合物而不使 受体蛋白结合能力下降的事实都支持上述毒素与受 体的结合是相互疏水作用完成的推论1.. ST-的毒性与其分子内的3个二硫键紧密相 关,破坏任一个二硫键,其毒性至少降低250倍以 上,而两个分子内二硫键被破坏,ST.的毒性可能丧 失殆尽.已知一种称为DsbA的胞膜间隙蛋白在大 肠埃希氏菌间隙和外膜蛋白的二硫键形成中起关键 作用.Yamanaka等揭示DsbA在ST.的成熟 和分子内二硫键形成中起主要作用,这可能是由于 DsbA改变胞膜间隙内氧化还原电位而有利于分子 内二硫键形成或DsbA直接催化ST.分子内二硫键 的形成.当ST.基因中编码第14位Cys的TGT置 换为AGT时,ST的毒性作用明显减弱. 3.2ST.的作用机理 业已证实,ST.能激活颗粒性鸟苷酸环化酶 (GC),二硫化合物能抑制此酶,从而使ST.无作用. ST.的生物活性具有组织特异性,可使回肠上皮细 胞内的cGMP(环磷酸鸟苷)增加10倍而结肠下段 仅增加1.8倍,对其他组织,器官无活性,此特异性 可能与受体分布有关.Mg.,Mn.等离子可增强 ST的作用.ST的激活作用具有专一性,这是由于 ST对小肠黏膜颗粒性酶比可溶性酶具有更高的亲 和力,同时小肠黏膜本身以颗粒性酶为主.有关 ST激活酶的作用机理主要有两种学说:一是”瀑 布’’学说,认为ST结合到细胞膜表面,打开钙离子 通道,钙摄取增加,激活调钙蛋白,触发磷酸酯酶 Az,膜磷脂释放花生四烯酸,后者的过氧化物及过 氧化氢代谢物使GC激活,但有的学者认为,ST并 不引起小肠细胞花生四烯酸的释放及改变膜脂成 分;二是”直接偶联”学说,该学说认为ST激活GC 第1O期卫广森等:新牛仔绪产肠毒素性大肠埃希氏菌致病因子的分 子生物学研究进展841 是直接的,不需要介导酶.即与已知腺苷酸环化酶激 活机理相似,靠ST.受体复合物系统. 3.3ST.的基因检测技术 3.3.1基因探针Moseley等用基因探针对分 离自临床腹泻病例的大肠埃希氏菌检测ETEC,这 也是基因探针首次用于临床细菌学诊断.作者用 pRIT10036质粒的l57bpHinfTST.P片段和 pSIM004质粒215bpHpa1ISTh片段以P标 记作为ST基因探针,用菌落原位杂交法检测了产 ST.的ETEC.近几年国内外对ST的探针检测大 多源于该法,并用该方法进行临床粪便,水源和食品 中的ETEC污染情况调查.其他用于ST检测的探 针还有Hanna等使用的pNG10质粒的510hp Ef0RIST.h探针,该探针不与STP杂交.用上述 基因片段制作的ST探针,特异性高,但制备时须经 多次酶切和PAGE分离,大量制备探针困难.冯书 章等对pSIM004质粒进行1”I一次酶切,收 集其840bp的TaqIST片段,缺口翻译法(NT)标 记P后作为探针,对不同来源的大肠埃希氏菌进 行检测,阳性结果与乳鼠试验的符合率为70. 虽然随着PCR技术的应用,大量小片段基因探 针的获得已不再是难,但是标记酶切片段制备探 针,易受载体质粒DNA的污染,有时可在乳鼠试验 显示阴性的样品出现假阳性结果.因此,需要进一 步提高探针的特异性.而人工合成的更短的寡核苷 酸探针,可以检出单个碱基的错配;在已知编码ST 基因的基础上,人工合成22,32bp的ST寡核苷 酸,利用随机引物法,T4多核苷酸激酶法以及缺口 翻译法标记,以标记物作为寡核苷酸探针,其特异性 和敏感性不亚于用克隆基因片段制备的探针. 3.3.2PCR技术目前,PCR亦用于检测大肠埃 希氏菌的肠毒素基因.Hornes等采用固相,比色的 套式PCR法,成功地从临床标本粗提物中检测出 ST.a和ST.b基因,该项技术进一步扩展了PCR的 应用.其特点是:?直接纯化标本粗提物中的靶细 菌,且不受粪便碎片和肠脱落细胞的干扰.固相法 运用免疫磁化分离组合生物素抗生物素蛋白系统技 术,在磁化珠中标记有抗生物素蛋白,使其能特异地 结合PCR产物中的生物素,起到固定PCR产物的 作用,达到富集浓缩和纯化靶细菌的目的.?套式 PCR是针对ST.基因的特点,设计5对引物,其中 有2对引物位于ST基因的外侧,另3对位于ST基 因的内侧.在进行PCR时首先使用2对靠外侧的 引物,以ST.DNA为模板扩增35个循环,然后再 以第1次的扩增产物为模板,使用3对靠近内侧的 引物进行第2次PCR,扩增25个循环.用这一方 法可以区别位于ST基因上的2种不同基因STa 和STb.据对38株大肠埃希氏菌测定结果分析, 13株具有ST.a基因,3株具有ST.b基因,l株具有 编码STa和ST.b两种基因,2l株则不具有编码 ST毒素基因的能力.PCR检测临床标本不受细菌 死亡的限制.?进行PCR只需在经PCR扩增,磁 化珠中固定有DNA的微量孔中加入1O.2mg/mL p半乳糖苷酶合成蛋白,置室温30min,洗涤,然后 加底物100I,终止反应后放人ElISA扫描器记 录读数即可,适用于大量临床标本的自动化检测. 参考文献(References) r1]FritsKG.PerK,WimG.Purification,characteriza— tion,andpartialcovalentstructureofEscherichiacoli adhesiveantigenK99[J].InfectImmun,1990,58: 187O一1878. 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