血清谷丙转氨酶活性的测定

血清谷丙转氨酶活性的测定 血清谷丙转氨酶活性 的测定(King法) 【目的要求】 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作 方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。【原理】 生物机体内转氨基作用是α-氨基酸的氨基通过酶促作用转移到 α,酮酸的酮基位置上，生产相应的酮酸和氨基酸的化学反应。 催化这反应的酶称为转氨酶(transaminase)，其辅酶为磷酸 吡哆醛。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中，在肝、心、肾 等组织中的谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase GPT)，谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase GOT)活性较高。在正常的新陈代谢过程中，血清内维持一定水 平的转氨酶活性(即正常值)。当肝、心、肾等组织发生病变 时，由于组织细胞肿胀，坏死导致大量的酶释放至血流中，从 而引起血清谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活性显著 升高。因此测定这些酶的活性对某些疾病的临场诊断具有重要 的参考价值。 血清中的谷-丙转氨酶(ALT)，在37?、 pH7.4的条件下，可催化基质(底物)液中 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸:生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的24二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-24-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。King 氏法谷丙转氨酶活性单位:每毫升血清在 37?与 pH7.4 的基质液作用 60min，生成 1μmol 丙酮酸为一个单位。临床检验取血清量为 0.1mL，报告数据以 100mL 血清计算，因此实际测得结果乘 1000 即可。例如 0.1mL 丙酮酸标准液中丙酮酸含量为0.2μmol，即相当 GPT200U/100mL。 试剂与器材 1、样品 动物或人血清 2试剂 1 甲液(1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液) 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4，A. R.)9.47g 或含水磷酸氢二 钠(Na2HPO412H2O，A. R.)23.87g溶于蒸馏水中定容至 1000mL。 2 乙液(1/15 mol/L 磷酸二氢钾溶液) 称取磷酸二氢钾(KH2PO4，A. R.)9.078g溶于蒸馏水中定容 至 1000mL。 取甲液 825mL，乙液 175mL 混合，此液 PH应为 7.4。 3 GPT 基质液 称取α,酮戊二酸 29.2mg(2mmol/L)及α,DL,丙氨酸 1.78g(200 mmol/L)溶于 50mL pH7.4 的磷酸缓冲液中，加 0.1 mol/L NaOH溶液约 0.5mL，调节 pH为 7.4，然后加磷酸缓 冲液定容至 100mL。加少许氯仿防腐，置冰箱中保存。 4 2，4,二硝基苯肼(1mmol/L) 称 2，4,二硝基苯肼 20mg。先溶于 10mL 浓盐 酸中，使其溶解。再以蒸馏水定容至100mL。 5 丙酮酸标准液 精确称取丙酮酸钠 22mg。加磷酸缓冲液溶解后 定容至 100mL。此溶液浓度为 2μmol/mL，临用前 配制。 0.4mol/L NaOH 溶液，1/15 mol/L 磷酸 缓冲液(pH7.4)。 3、器材 试管及试管架，移液管(0.5mL，1 mL，5 mL)， 量筒(10 mL，100 mL)，恒温水浴，722 型分光 光度计，坐标纸。实验和步骤 1 制备标准曲线 2 绘制标准曲线 以光吸收值为纵坐标，酶活性单位数为横 坐标，在坐标纸上绘制各测得A520值与对 应的酶活性单位数的标准曲线。3 样品测定 结果计算 标准曲线测定法根据样品管 A520 值(已减去空白管 A520) 查标准曲线，即得每 100mL 血清中转氨酶 活性单位数。 标准管测定法每次测定酶活性时，同时用丙酮酸标准液 (2μmol/mL)0.1mL，平行操作，即按上 操作，不做标准曲线，测定A520按下公式 计算:比色测定法，如:金氏法(King法)、穆氏法(Mohun 法)和赖氏法 (Reitman-Frankel法)。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。 不同之处在于作用时间:King 法60min ，Mohun法和 Reiman法30min。因此 它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是:每1ml血清在 37?条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单位。 Mohun 法单位定义是:每毫升血清在pH7.4，37?条件下与底物作用30 min，每 生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实 验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位的定义是:在温 度25?，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度 下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物 质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单 位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系:1卡门氏单位 0.4821 IU/L25?，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。 改原赖氏法的反应温度40?改为37?和底物浓度改为低 浓度的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65;显色剂24-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半;保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。 注意事项1 为防止溶血及其他因素对酶活性测定的影响，实验过程所用的一切器皿(注射器、 试管等)应清洗干净，干燥后方能使用。2 空腹取血，避免血脂干扰。迅速分出血清，及时测定。3 作为标准物质的丙酮酸钠极易变质。配试剂时应选择外观洁白干燥者。若颜色变黄 或潮解，则应重结晶，干燥至衡重后再用。丙酮酸钠重结晶:取纯丙酮 8 份与蒸馏水 2 份混合，加入变质的丙酮酸钠使其达到饱 和。此时溶液上层无色，下层有棕黄色油状物。取出上层无色液体置烧杯中，加入两 倍体积的丙酮(无水)混匀后，置冰箱中数小时，则有白色丙酮酸钠析出，用布氏漏 斗收集沉淀，并用纯丙酮洗涤两次，抽干后，置干燥器内，保存、备用。4 转氨酶只能作用于α,L,氨基酸(L,天冬氨酸，L,丙氨酸)，对 D,氨基酸无催 化作用。实验室多用α,DL 氨基酸(因较 L,氨基酸价廉)，如采用α―L―氨基酸 则需按α,DL 氨基酸的用量减半。5 为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定 PH，保温时间，选用固定的比色计，比 色杯以减少误差。6 血清转氨酶活性高于 500(U)/100mL 血清时，应将血清稀释一定倍数重新测定， 其结果应乘以稀释倍数。7 每次测定样品数不要太多，其数量以在显色后 30min 内完成比色为宜。