罗红霉素胶囊微生物限度检查方法验证

罗红霉素胶囊微生物限度检查验证 STP-QC-HY-007-00 检验方法验证 罗红霉素胶囊微生物检验 方法学验证方案 浙江花园药业有限公司 一、概述 罗红霉素(Roxithromycin)，英文别名:Claramid、Rulid，是新一代大环内酯类抗生素，主要作用于革兰氏阳性菌、厌氧菌、衣原体和支原体等。其体外抗菌作用与红霉素相类似，体内抗菌作用比红霉素强1—4倍。罗红霉素胶囊为该药物的固体产品。 二、验证目的 可2010年版药典中未明确指出罗红霉素胶囊的微生物检验方法，所以现在为了得到一个行的、可控的、科学的微生物检验方法，特进行一系列的对稀释剂、抑菌剂等方面的方法学验证活动。 三、验证依据 3.1 《中国药典》2010年版二部附录? J 3.2 《中国药品检验操作规程》2010年版 四、实验用品 4.1 供试品 次数 品名 规格 批号 来源 1 2 浙江花园药业有限公司 3 4.2 培养基 名称 批号 厂家 营养琼脂培养基 玫瑰红钠培养基 营养肉汤培养基 北京三药科技开发公司 改良马丁培养基 改良马丁琼脂培养基 胆盐乳糖培养基 培养基的配制方法均按照厂家书要求进行配制，符合《中国药典》2010年版的要求。 4.3 缓冲液 名称 批号 厂家 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 杭州微生物试剂有限公司 4.4 验证菌种: 名称 菌种编号 菌龄 来源 大肠埃希菌 CMCCB(B)44102— 金黄色葡萄球菌 CMCCB(B)26003— 枯草芽孢杆菌 CMCCB(B)63501— 金华食品药品检验所 白色念珠菌 CMCCB(F)98001— 黑曲霉 CMCCB(F)98003— 4.5 菌液制备 4.5.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌:取少量的三种菌种的新鲜培养物接种至5ml营养肉汤培养基上，在30,35?培养18,24小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml中含50,100cfu的菌悬液。 4.5.2 白色念珠菌:取少量的白色念珠菌的新鲜培养物接种至5ml改良马丁培养基上，在23,28?培养24,48小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml中含50,100cfu的菌悬液。 4.5.3 黑曲霉:取少量的黑曲霉的新鲜培养物接种至5ml改良马丁琼脂斜面培养基上，在23,28?培养5~7天，加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱后移置无菌管中，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml中含50,100cfu的孢子悬液。 4.6 菌落计数 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50~100cfu，分别注入无菌平皿中，立即注入15~20ml营养琼脂培养基，混匀，待凝固后，置30~35?培养48小时，计数;取白色念珠菌、黑曲霉各50~100cfu，分别注入无菌平皿中，立即注入15~20ml玫瑰红钠培养基，混匀，待凝固后，置23~28?培养72小时，计数。结果下表: 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 1 2 平均 操作人/日期: 复核人/日期: 五、检查法验证 5.1 细菌、霉菌和酵母菌检查 5.1.1 预实验 5.1.1.1 供试品配制:将供试品用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释配制成1:10的供试品 溶液。 5.1.1.2 菌液:白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌 5.1.1.3 平皿法:取供试品溶液1ml注入三个营养琼脂培养基平皿中，第一个平皿中加入1ml金黄色葡萄球菌，第二个平皿中加入1ml枯草芽孢杆菌，第三个平皿中加入1ml白色念珠菌，另做一空白对照，培养72h后，计算每种菌种的回收率。 实验结果: 菌种 计数结果 空白对照 回收率 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 操作人/日期: 复核人/日期: 5.1.1.4 培养基稀释法:取供试品1ml分别按0.5ml/皿和0.2ml/皿的添加量分别加入2个和5个营养琼脂培养基平皿中，然后分别将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌各1ml按照供试品溶液的加入法，分别加入到各个平皿中，另做一空白对照，培养72h后，计算每种菌种的回收率。 实验结果: 计数结果 回收率 菌种 0.5ml 1ml 0.5ml 1ml 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 空白对照 —— 操作人/日期: 复核人/日期: 5.1.1.5 薄膜过滤法:取供试品1ml通过薄膜过滤，分别用200、400、600、800mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，分别在每张膜上加1ml金黄色葡萄球菌、1ml枯草芽孢杆菌、1ml大肠埃希菌，放置在营养培养基上，另做一空白对照，培养72h后，计算每种菌种的回收率。 实验结果: 计数结果 回收率 菌种 200ml 400 ml 600 ml 800 ml 200 ml 400 ml 600 ml 800 ml 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 大肠埃希菌 空白对照 —— 操作人/日期: 复核人/日期: 实验总结: 操作人/日期: 复核人/日期: 5.1.2 实验方法 5.1.2.1 计数方法:根据上述预实验结果，可以得出选用 来进行供试品的细菌检查，霉菌和酵母菌检查可用 。 5.1.2.2 稀释剂和缓冲液:均选用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 5.1.2.3 供试品处理方法:取供试品，称取10g，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，摇匀制成1:10的供试液。 5.1.2.4 操作步骤 5.1.2.4.1 细菌检查: 5.1.2.4.2 霉菌和酵母菌计数: 5.1.2.5 实验次数:每项实验进行三次。 5.1.3 试验内容 5.1.3.1 供试品组:取1:10的供试液按照5.1.2.4.1及5.1.2.4.2描述的方法进行试验，按每1ml供试液加入50~100cfu试验菌，结果记录在下表: 次数 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 1 2 3 平均 操作人/日期: 复核人/日期: 5.1.3.2 活菌组:参见4.6的菌落计数结果。 5.1.3.3 供试品对照组:参照5.1.3，结果记录在下表: 实验次数 菌落数 第一次 第二次 第三次 细菌 霉菌和酵母菌 操作人/日期: 复核人/日期: 5.1.3.4 稀释剂对照组:用pH7.0无菌氯化钠,蛋白胨缓冲代替供试品，照供试品组检查法同法处理，结果记录在下表中: 次数 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 1 2 3 平均 操作人/日期: 复核人/日期: 5.1.4 验证结果 5.1.4.1 供试品组的回收率 次数 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 1 2 3 平均 计算公式: 供试品组平均菌落数-空白组平均菌落数 供试品组的回收率%= ×100% 活菌组的平均菌落数 操作人/日期: 复核人/日期: 5.1.4.2 对照组的回收率 次数 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 1 2 3 平均 计算公式: 对照组平均菌落数 供试品对照组的回收率%= ×100% 活菌组的平均菌落数 操作人/日期: 复核人/日期: 5.2 控制菌检查 因本品为口服固体制剂，所以按照《中国药典》中的规定，必须要检测大肠埃希菌，选用金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。 5.2.1 验证试验:按照5.1.2.3的方法配制供试品溶液。 5.2.1.1 常规法 5.2.1.1.1 试验组:取供试品溶液10ml和1ml含50~100cfu的大肠埃希菌的菌液，加入到100ml胆盐乳糖培养基中，30~35?培养18~24小时。 5.2.1.1.2 阳性对照组:取50~100cfu的大肠埃希菌菌液加入到100ml胆盐乳糖培养基中，30~35?培养18~24小时。 5.2.1.1.3 阴性对照组:取pH7.0无菌氯化钠,蛋白胨缓冲液10ml加入到100ml胆盐乳糖培养基中，30~35?培养18~24小时。 5.2.1.2 实验结果 试验次数 第一次 第二次 第三次 试验组 阳性对照组 阴性对照组 操作人/日期: 复核人/日期: 5.2.1.2 培养基稀释法 5.2.1.1.1 试验组:取供试品溶液10ml和1ml含50~100cfu的大肠埃希菌的菌液，加入到200ml胆盐乳糖培养基中，30~35?培养18~24小时。 5.2.1.1.2 阳性对照组:取50~100cfu的大肠埃希菌菌液加入到200ml胆盐乳糖培养基中，30~35?培养18~24小时。 5.2.1.1.3 阴性对照组:取pH7.0无菌氯化钠,蛋白胨缓冲液10ml加入到200ml胆盐乳糖培养基中，30~35?培养18~24小时。 5.2.1.1.4 实验结果 试验次数 第一次 第二次 第三次 试验组 阳性对照组 阴性对照组 操作人/日期: 复核人/日期: 5.2.1.3 离心集菌薄膜过滤法:取5.1.2.3项下配置好的溶液在500r/min离心3分钟，取上清液10ml加到200ml稀释液中，混匀，作为控制菌检查供试液，冲洗液的量可参考5.1.1.5。 5.2.1.3.1试验组:取供试品溶液10ml通过薄膜过滤，在最后一次冲洗液中加入1ml含50~100cfu的大肠埃希菌的菌液，将滤膜放入到100ml胆盐乳糖培养基中，30~35?培养18~24小时。 5.2.1.3.2 阳性对照组:取1ml含50~100cfu的大肠埃希菌菌液通过薄膜过滤并用冲洗液冲洗，将滤膜放入到100ml胆盐乳糖培养基中，30~35?培养18~24小时。 5.2.1.3.3 阴性对照组:取pH7.0无菌氯化钠,蛋白胨缓冲液10ml通过薄膜过滤，将滤膜放入到100ml胆盐乳糖培养基中，30~35?培养18~24小时。 5.2.1.3.4 实验结果 试验次数 第一次 第二次 第三次 试验组 阳性对照组 阴性对照组 操作人/日期: 复核人/日期: 七、验证总结 7.1 细菌、霉菌和酵母菌 在细菌、霉菌和酵母菌的验证试验中，供试品组的回收率 ，供试品对照组的菌的回收率 ，说明供试品在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可忽略不计，本品在检查细菌、霉菌、酵母菌时 依据此法进行检查。 7.2 控制菌(大肠埃希菌) 在控制菌验证试验中，阳性对照组 试验菌，阴性对照组 ，试验菌组 试验菌，说明供试品在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用可忽略不计，供试品在检查控制菌时 依据此法进行检查。