实验3 蟾蜍坐骨神经干电生理实验

实验3 蟾蜍坐骨神经干电生理实验 生理科学实验—实验3 神经干 李丹阳 2006.09.28 【摘要】 目的 运用电生理实验技术测定蛙类坐骨神经干的单相、双相动作电位和其中,类纤维冲动的传导速度，并观察机械损伤、药物对神经兴奋和传导的影响。 方法 采用RM6240微机生物信号处理系统，通过电生理的方法来测定蛙坐骨神经干的单相、双相动作电位的电位和时程以及其中,类纤维冲动的传导速度。并采用夹伤神经和加不同药物等处理措施，记录一定刺激强度下坐骨神经动作电位的大小变化，从而坐骨神经干动作电位的影响因素及机制。 结果 动作电位的传导速度为31.76?3.63 m/s，阈刺激强度为0.28?0.03 V，最大刺激强度为1.21?0.36 V。中枢端引导动作电位正相和负相振幅分别为3.15?1.87mV和 2.11?1.46mV，末梢端引导动作电位正负相振幅分别为7.04?2.01 mV和 3.89?1.46 mV，与中枢端引导时的动作电位振幅比有显著性差异(p<0.01);夹伤神经干后，动作电位振幅为8.49?2.48 mV，时程为 1.73?0.40 ms，与末梢端引导时正相波时程比有显著性差异(p=0.002<0.01)。引导电极间距离分别等于10mm、20mm和30mm时，动作电位正相振幅:A110为 7.07?1.87 mV，A120为 9.57?3.08 mV，A130为 9.75?3.33 mV，负相振幅:A210为 3.87?1.19 mV， A220为 5.35?2.23 mV，A230为 4.44?2.39 mV，A120、A130分别与A110比均有显著性差异(p<0.05)，A220与A210比有显著性差异(p<0.05)，A230与A210以及A220与A230比没有显著性差异 (p>0.05)。3mol/L KCl处理前Ac正相振幅为 2.57?0.75 mV，负相振幅为1.28?0.52 mV，处理后5min A5正相振幅为3.16?0.97 mV，负相振幅为0.12?0.18mV;Dc正负相时程分别为 1.30?0.26 ms和2.00?0.65 ms，处理后5min D5正负相时程分别为 1.94?0.44 ms和0.31?0.44 ms。A5与Ac相比以及D5与Dc相比均有显著性差异(P<0.05)。3,procaine处理前Ac正相振幅为 7.43?0.92 mV，负相振幅为4.17?0.75 mV;处理后5min A5正相振幅为8.54?1.88 mV，负相振幅为2.92?1.76 mV。Dc正负相时程分别为 0.88?0.21 ms和1.99?0.50 ms，处理后5min D5正负相时程分别为 1.02?0.29 ms和 2.13?0.79 ms。A55与Acc相比以及D55与Dcc相比均有显著性差异(p<0.05)。 结论 神经冲动在神经纤维内可以双向传导， 。双相动作电位是神经冲动先后通过两个引导电极形成传导速度为 m/s 的，为正相波与负相波叠加后的结果。坐骨神经干的动作电位及传导过程不现“全或无”现象，当刺激电压从阈刺激增加至最大刺激的过程中，神经干动作电位振幅随刺激电压增加而增高，。KCl处理神经干过程中，由于阻滞了K+的外流，动作电位的振幅随时间延长逐渐减小，至5min时已基本为0。procaine处理神经干后，由于阻滞了Na+的内流，动作电位的振幅逐渐变小。 【关键词】神经干 刺激 复合动作电位 单相动作电位 双相动作电位 传导速度 神经纤维在接受阈上刺激后产生动作电位(全或无)，产生后沿其神经纤维以一定的速度传导。神经干由许多神经纤维组成，从神经干引导的动作电位是这些神经纤维的复合动作电位。通过置于神经干上的电极，可 以引导出不同的单相、双相动作电位。不同的神经纤维传导速度也不同，蟾蜍坐骨神经干主要由Aα类纤维组成，传导速度约为30-40m/s。神经损伤以及药物作用等对神经的兴奋、传导都具有影响。本实验通过测定不同条件下神经干动作电位参数变化，探讨其机制。 1.材料和方法 1.1实验动物 蟾蜍(中华蟾蜍指名亚种，Zhuoshan Toad) 1 生理科学实验报告—实验3 神经干 李丹阳 2006.09.28 1.2药品 任氏液、3%procaine、3mol/LKCl. 1.3 器材 RM6240微机生物信号处理系统(成都仪器厂)、神经标本屏蔽盒。 1.4坐骨神经干制备 蟾蜍毁脑脊髓，去上肢和内脏，下肢剥皮浸于任氏液中。蟾蜍下肢背面向上置于蛙板上，剪去尾椎;标本腹面向上，用玻璃分针分离脊柱两侧神经丛，用线在近脊柱处结扎，剪断神经;将神经干从腹面移向背面。标本背面向上固定，从大腿至跟腱分离坐骨神经。坐骨神经标本置任氏液中备用。 1.5仪器连接和参数 “实验”菜单中选择生理科学实验中的“神经干动作电位”进入实验 信号记录状态。仪器参数:1、2通道时间常数0.02s、滤波频率1KHz、灵敏度5mV，采样频率40kHz，扫描速度0.5ms/div。单刺激方式，刺激幅度1.0V，刺激波宽0.1ms，延迟5ms，同步触发。 1.6 动作电位引导 神经干标本置于标本盒的电极上，神经与电极接触良好，调节刺激电压，记录动作电位。 2.观察项目 2.1 蟾蜍坐骨神经干复合动作电位参数测定 2.1.1 将神经干中枢端置于刺激电极处，用刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms的方波刺激神经干，测定第一对引导电极引导的双相动作电位正相波与负相波的振幅(Ac1、Ac2)和时程(Dc1、Dc2)。 2.1.2 将神经干末梢端置于刺激电极处，用刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms的方波刺激神经干，测定第一对引导电极引导的双相动作电位正相波与负相波的振幅(Ap1、Ap2)和时程(Dp1、Dp2)。 2.2 动作电位传导速度测定 将神经干中枢端置于刺激电极处，用刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms的方波刺激神经干，记录通道1、2产生动作电位起始时间之差，根据υ, S R1- R2 / Δt 计算出AP的传导速度。 2.3 引导电极间距离的变化对动作电位振幅的影响 取下第二对引导电极，用刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms的方波刺激神经干，分别记录第一对引导电极间距离为10mm，20mm，30mm时的动作电位的正负相振幅(A1、A2)。 2.4 单相动作电位引导 用镊子将第一对引导电极之间的神经夹伤，用刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms的方波刺激神经干，测定第一对引导电极引导的单相动作电位的振幅(Am)和时程(Dm)。 2.5 刺激强度(U)变化对动作电位振幅(A)的影响 用刺激波宽0.1ms，刺激电压从0.1V按步长0.05V不断增加，测定不同刺激电压下动作电位振幅的变化，直到动作电位不再增大为止。记录阈刺激强度(Uth)和最大刺激强度(Umax)以及所对应的动作电位振幅。 2.6 3mol/L KCl溶液处理后的影响 将一小块浸有3mol/L KCl 溶液的滤纸贴附在第2对引导电极的后一电极的神经干上，用刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms的方波刺激神经干，记录KCl溶液处理前及处理后5min时，第一对引导电极引导的动作电位振幅(Ap)和时程(Dp)。 2.7 3%procaine处理后的影响 2 生理科学实验报告—实验3 神经干 李丹阳 2006.09.28 换一神经干，将一小块浸有3%procaine溶液的滤纸贴附在第1 对引导电极的后一电极的神经干上，用刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms的方波刺激神经干，记录procaine处理前及处理后5min时，第一对引导电极引导的动作电位振幅(Ap)和时程(Dp)。 3.结果 3.1 刺激波宽0.1ms时，阈刺激Uth为0.28?0.03 V;最大刺激1.21?0.36 V，刺激电压1.0V时，动作电位的传导速度为31.76?3.63 m/s 。(见表1) 表1 蟾蜍坐骨神经干阈刺激、最大刺激和传导速度 sample Uth(V) Umax(V) V(m/s ) 1 2 3 5 6 7 8 9 ?x?s 0.30 0.32 0.30 0.25 0.25 0.30 0.26 0.24 0.28?0.03 0.99 1.16 1.30 1.25 1.80 1.50 1.10 0.59 1.21?0.36* 30.77 31.75 28.17 28.17 34.48 31.25 30.30 39.22 31.76?3.63 *p,0.01 vs阈刺激组。 刺激波宽0.1ms，刺激电压从0.1V按步长0.05V不断增加时，当刺激电压小于阈刺激时，不产生动作电位;当刺激电压大于阈刺激小于最大刺激时，动作电位振幅不断增大;当刺激电压大于最大刺激时，动作电位振幅不再增大。动作电位振幅与刺激电压的变化关系见图1。 图1 不同强度刺激电压对蟾蜍坐骨神经干动作电位振幅的影响 3.2 刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms时，中枢端引导时动作电位，正相和负相振幅分别为3.15?1.87 mV和 2.11?1.46 mV，两者有高度显著性差异(p=0.001<0.01);动作电位正 3 生理科学实验报告—实验3 神经干 李丹阳 2006.09.28 负相时程分别 0.95?0.16 ms和 1.68?0.41 ms，两者有高度显著性差 异(p=0.0004<0.01);末梢端引导时动作电位正负相振幅分别为 7.04? 2.01 mV和 3.89?1.46 mV，与中枢端引导时的动作电位振幅比有高度显著 性差异(p<0.01);动作电位正负相时程分别为 0.98?0.18 ms和 2.02 ?0.48 ms，与中枢端引导时没有显著性差异(p>0.05)。(见表2) 表2 蟾蜍坐骨神经干中枢和末梢引导的复合动作电位 sample Ac1(mv) Ac2( mv) Dc1(ms ) Dc2(ms ) Ap1(mv) Ap2(mv ) Dp1(ms ) Dp2(ms ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 x?s 4.98 2.86 4.64 1.69 6.23 1.81 0.99 1.27 3.92 3.15?1.87 3.03 2.15 2.72 1.10 5.23 1.27 0.56 0.72 2.20 2.11?1.46** 0.84 0.90 0.83 1.32 1.04 0.93 0.98 0.80 0.87 0.95?0.16 1.52 1.60 1.11 1.96 2.31 1.40 1.31 2.23 1.70 1.68?0.41** 8.02 7.00 8.99 5.35 9.86 8.11 3.31 5.79 6.91 7.04?2.01* 4.27 4.41 6.13 2.09 4.16 5.24 1.36 3.79 3.59 3.89?1.46* 0.94 0.84 0.88 1.37 1.13 1.04 1.02 0.81 0.80 0.98?0.18 1.97 1.69 1.19 2.56 2.67 1.97 1.59 2.41 2.09 2.02?0.48 *p<0.01 vs中枢端引导组;**p<0.01 vs正相波。 3.3 夹伤神经干后，动作电位振幅为 8.49?2.48 mV;时程为 1.73? 0.40 ms，与末梢端引导时正相波时程比有高度显著性差异 (p=0.002<0.01)。(见表3) 表3 蟾蜍坐骨神经干双相和单相复合动作电位 sample Ap1(mV) Ap2(mV ) Dp1(ms ) Dp2(ms ) Am(mV) Dm(ms) 1 2 3 5 6 7 9 x?s 8.05 7.00 8.99 9.86 8.11 3.76 7.61 7.63?1.94 4.18 4.41 6.13 4.16 5.24 1.95 4.05 4.30?1.28 0.93 0.84 0.88 1.13 1.04 0.94 0.83 0.94?0.11 1.96 1.69 1.19 2.67 1.97 1.77 2.26 1.93?0.46 8.40 2.06 8.62 2.19 10.66 1.44 11.66 2.19 7.85 1.33 3.80 1.35 8.45 1.53 8.49?2.48 1.73?0.40* *p<0.01 vs末梢端引导时正相波。 3.4 刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms，第一对引导电极间距离分别等 于10mm、20mm和30mm时，末梢端引导的动作电位正相振幅:A110为 7.07?1.87 mV，A120为 9.57?3.08 mV，A130为 9.75?3.33 mV，A120、A130分别与A110比有显著性差异(p<0.05)，A120与A130比没有显著性差异;负相振幅:A210为 3.87?1.19 mV， A220为 5.35?2.23 mV，A230为 4.44?2.39 mV，A220与A210比有显著性差异(p<0.05)，A230与A210以及A220与A230比没有显 4 生理科学实验报告—实验3 神经干 李丹阳 2006.09.28 著性差异(p>0.05)。(见表4) 表4 引导电极间距离对坐骨神经干动作电位振幅的影响(mV) sample 10mm A1 A2 A1 20mm A2 A1 30mm A2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 x?s 8.38 6.92 7.94 5.26 10.06 8.02 3.76 5.96 7.32 4.18 4.46 4.08 2.15 4.42 5.83 1.95 3.96 3.83 3.87?1.19 7.07?1.87 12.19 8.11 8.83 6.35 14.97 11.68 5.02 8.54 10.48 9.57? 3.08* 7.74 4.65 3.68 3.49 7.82 7.40 1.45 5.26 6.69 5.35?2.23* 12.65 8.21 8.29 6.41 15.91 12.09 5.35 8.48 10.37 9.75? 3.33*,** 8.70 2.82 2.33 3.24 7.67 4.42 2.39 2.70 5.65 4.44?2.39#,** *p<0.05 vs 10mm组，#p>0.05 vs 10mm组， **p>0.05 vs 20mm 组。 3.5 刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms，3mol/L KCl处理前Ac正相振幅 为 2.57?0.75 mV，负 相振幅为1.28?0.52 mV。处理后5min A5正相振 幅为3.16?0.97 mV，负相振幅为0.12?0.18mV。 A5与Ac相比有显著性 差异(p<0.05);Dc正负相时程分别为 1.30?0.26 ms和2.00?0.65 ms， 处理后5min D5正负相时程分别为 1.94?0.44 ms和0.31?0.44 ms。D5与 Dc相比有显著性差异(P<0.05)。(见表5) 表5 3mol KCl 对坐骨神经干动作电位振幅和时程的影响 sample Ap1(mV) 5 Ap2(mV ) c 5 c Dp1(mS) 5 Dp2(mS ) c 5 c 2.14 1.47 1.78 2.42 2.80 2.99 3.60 3.38 2.57? 0.75 1 2 3 4 5 7 8 9 x?s 2.87 1.80 2.26 2.50 4.41 3.24 3.92 4.31 3.16? 0.97* 1.54 1.42 1.21 0.84 2.33 1.27 0.70 0.89 1.28? 0.52 0.24 0.21 0.48 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.12? 0.18 1.40 1.32 1.10 1.72 1.35 1.30 1.40 0.82 1.30? 0.26 2.27 1.62 1.40 2.62 1.86 2.39 1.82 1.57 1.94? 0.44* 1.90 1.57 1.19 3.31 2.03 2.19 2.32 1.52 2.00? 0.65 1.03 0.66 0.78 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.31? 0.44 *p<0.05 vs处理前 3.6 刺激电压1.0V，刺激波宽0.1ms，3,procaine处理前Ac正相振 幅为 7.43?0.92 mV，负相振幅为4.17?0.75 mV。处理后5min A5正相振 幅为8.54?1.88 mV，负相振幅为2.92? 5 生理科学实验报告—实验3 神经干 李丹阳 2006.09.28 1.76 mV。 A55与Acc相比有显著性差异(p<0.05);Dc正负相时程分别为 0.88?0.21 ms和1.99?0.50 ms，处理后5min D5正负相时程分别为 1.02?0.29 ms和 2.13?0.79 ms。D55与Dcc相比有显著性差异(p<0.05)。(见表6) 表6 3% procaine 对坐骨神经干动作电位振幅和时程的影响 sample Ap1(mV) 5` Ap2(mV ) c 5` c Dp1(mS) 5` Dp2(mS ) c 5` c 7.66 9.03 7.88 6.40 7.65 6.50 6.86 7.43? 0.92 1 2 3 4 5 7 9 x?s 9.95 11.10 8.85 6.42 9.86 6.47 7.12 8.54?1.88* 4.42 5.03 5.06 3.40 3.86 3.15 4.26 4.17? 0.75 5.70 1.42 2.59 2.43 2.50 0.88 4.90 2.92?1.76 0.91 0.95 0.63 1.10 1.06 0.93 0.56 0.88? 0.21 0.95 1.23 0.80 1.22 1.25 1.21 0.50 1.02?0.29* 2.05 1.97 1.18 2.10 2.81 2.20 1.64 1.99? 0.50 3.34 1.43 1.35 2.52 2.82 1.40 2.05 2.13?0.79 *p<0.05 vs处理前 4.讨论 4.1 中枢端引导和末梢端引导时均能产生动作电位，说明神经冲动在 神经纤维内可以双向传导。且中枢端引导和末梢端引导时产生的动作电位 的时程没有显著性差异，说明神经冲动的传导速度与神经冲动的传导方向 是没有关系的。文献资料显示蛙类神经冲动的传导速度在20?时约为 30m/s。实验中测得的蟾蜍坐骨神经干动作电位传导速度为27.61?8.19m/s， 与文献数据相比有意义，说明神经干标本生理功能完好。 4.2 神经传导依靠局部电流来完成，要求神经纤维在结构和功能上都 是完整的。实验中将两引导电极间的神经夹伤后，神经冲动传导被阻断， 可观察到双相动作电位的负相波消失，只形成一正相波。由此可见，双相 动作电位是神经冲动先后通过两个引导电极形成的。当冲动通过第1个电 极时，产生第一次动作电位，即我们所观察到的正相波;当冲动通过第2 个电极时，产生第二次动作电位，即我们观察到的负相波。我们所观察到 的双相动作电位实际为正相波与负相波叠加后的结果。实验中观察到单相 动作电位的时程显著长于双相动作电位正相波的时程;逐渐增加两引导电 极间距离，单相动作电位的振幅也逐渐增大。这些也都证明了观察到的双 相动作电位为正相波与负相波叠加后的结果。 4.3 实验中观察到双相动作电位的正相波振幅显著大于负相波的振幅。因为一条神经干是由许多条神经纤维以及纤维间的结缔组织组成的，神经干的动作电位应为每一条神经纤维动作电位叠加的结果。由4.2可知双相动作电位是神经冲动先后通过两个引导电极形成的。当神经冲动经过第1个电极时，每条神经纤维产生动作电位叠加后即为正相波的振幅;当神经冲动经过第2个电极时，由于某些神经纤维处于不应期内，从而产生第二次动作电位的神经纤维数量减少，叠加后的值小于第一次，即正相波振幅大于负相波的振幅。 4.4 刺激电压从阈刺激增加至最大刺激的过程中，神经干动作电位振幅随刺激电压增加而增高，说明坐骨神经干的动作电位及传导过程不表现“全或无”现象。 4.5 动作电位的产生是由于Na+跨膜内流和K+跨膜外流形成的，而离子跨膜流动的动力主 6 生理科学实验报告—实验3 神经干 李丹阳 2006.09.28 要来自其浓度梯度。细胞在静息状态时膜内[K+]高与膜外。当用KCl处理神经干时，膜外[K+]增高，因此K+的浓度梯度减小，K+跨膜外流减少，导致动作电位振幅减小。随着时间延长，膜外[K+]继续增高，当增至膜内外[K+]相同，即不再产生动作电位。因此KCl处理神经干过程中，动作电位的振幅随时间延长逐渐减小，至5min时已基本为0。 4.6 Procaine为局部麻醉药，可作用于神经细胞膜Na+通道，封闭Na+ 通道，阻滞Na+的内流，从而使动作电位振幅下降，甚至完全丧失产生动作电位的能力。实验中procaine处理神经干后动作电位振幅逐渐变小，与理论相一致。 【参考文献】 (1) 姚泰.生理学.人民卫生出版社.北京.2002.4第1版. (2) 陆源,夏强等.生理科学实验教程. 杭州:浙江大学出版社，2004. 7