蛋白质提取方法

蛋白质提取方法 三色竹芋的蛋白质组学研究 一、蛋白质的提取 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20?的条件下过夜，然后离心(4?8000rpm以上1小时)弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4?8000rpm以上1小时)，然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15?8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为)，可临时保存在4?待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80?备用。 药品: 提取液:含10TCA和0.07的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入1M的DTT65ul/ml。 种苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。 100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40聚乙烯吡咯烷酮及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10 三氯乙酸(丙酮配制，含10mM即0.07β-巯基乙醇)，混匀，-20?沉淀1小时，4?，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮含10 mMβ-巯基乙醇，再于-20?沉淀1小时，同上离心弃上清，(有必要再用80,丙酮含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。 按每mg干粉加入20μl(可调) UKS液9.5 M尿素，5mM碳酸钾，1.25SDS，0.5DTT二硫苏糖醇，2 Ampholine Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10，6 Triton X-100，37?温育30min，期间搅动几次，28度 (温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好～上清即可上样电泳。或者-70度保存 二、蛋白质含量测定: (一)实验原理 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法(Bradford法)，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置(lmax)，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 Bradford法的突出优点是: (1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质,染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 (2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。 (3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K、Na、Mg2离子、Tris缓冲液、糖和蔗 糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是: (1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有:去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干扰Lowary法一样)。 (3)标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 (二)试剂与器材 1. 试剂: (1)标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白BSA，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。 (2)考马斯亮兰G—250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G—250， 溶于50ml 95的乙醇后，再加入120ml 85的磷酸，用水稀释至1升。 2. 器材: (1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)试管16支 (三)操作方法 1. 标准方法 (1)取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。 (2)加完试剂25分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。 注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 考马斯亮兰法实验表格: 管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 1.0mg/ml 未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 约1.0mg/ml 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝 G,250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋 白质量(mg) 光吸收值 (A595) (3)用标准蛋白质量(mg)为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。 2. 微量法 当样品中蛋白质浓度较稀时(10,100mg/ml)可将取样量(包括补加的水)加大到0.5ml或1.0ml 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O 考马斯亮蓝G,250试剂仍加5.0ml 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。 贮存液:由100ml 95乙醇，200ml 88磷酸，350mg考马斯亮蓝G-250 组成， 室温下可长期保持稳定。 工作液:由425ml双蒸水，15ml 95乙醇，30ml 88磷酸，30ml Bradford 贮存 液混合而成，用滤纸过滤后置于棕色瓶中保存于室温下，使用前再过滤。 测定标样和样品的平均吸收值，在Excel 工作表中，以吸光度为横坐标x，反应蛋白量(μg)为纵坐标y，将标准曲线测定数据用工作表中的Chart Wizard 绘制标准曲线，回归出线性方程yf(x)、线性相关系数r 平方值，将样品测定结果的平均值用Paste Function中Forecast返回出待测样品的预测值y，或用回归出的线性方程计算待测样品的反应蛋白量(μg)y值。 在酶学研究中酶的比活是以蛋白质的含量为基础的 。一般认为提取液的蛋白质浓度与组织重量呈正比与所加入的提取液体积呈反比因而在计算蛋白质含量时总是把检测液的蛋白质浓度乘以提取液总体积再除以组织重量 。 研钵经硫酸清洁液按配方2 浸泡24 h 流水冲洗180, 200 ?烘烤或装在器械盒中经1. 034×105 Pa 高压20m in 自然冷却 取出 放入- 80 ?冰箱备用。若用于提取RNA 则需经0. 1 焦碳酸二乙酯DEPC 水37 ?处理3, 4h 后高压。 从- 80 ?冰箱取出研钵 把冷冻新鲜组织0. 1 g 放入研钵捣碎 不断研磨把组织磨成粉状 用小钢匙或一次性手术刀片把粉末组织刮入1. 5 m l Eppendo rf 简称EP 管中。 组织用于提取DNA 时在EP 管中加裂解混合液 提取RNA 时在EP 管DEPC 处理 中加试剂TR IzO l GIB2 COBRL 公司产品 1 m l 方法见文献。提取的总蛋白质用于蛋白质印迹检测时则直接加1 十二烷基磺酸钠SDS500 Ll 剧烈振摇 然后煮沸10, 15 m in 立刻冰浴 以使蛋白质变性。- 85 ?保存备用。 提取的DNA 以B2Globin 为引物经PCR 扩增后 1 琼脂糖凝胶电泳见一清晰、无拖尾的条带。提取的RNA 用1琼脂糖 甲醛变性凝胶电泳见粗细不等但明亮无弥散的二条带。提取的蛋白质以SDS2PA GE 聚丙烯酰胺 凝胶电泳 考马斯亮蓝R250 染色在淡蓝色背景中有多条蓝黑色粗细不 同的条带。