【word】 柱前衍生HPLC法测定水蛭提取物中氨基酸的含量

【word】 柱前衍生HPLC法测定水蛭提取物中氨基酸的含量 柱前衍生HPLC法测定水蛭提取物中氨基 酸的含量 ? 38? 中医药信息 InformationOnTraditionalChineseMedieine 2010年第27卷第4期 Vo1.27,No.4,2010 者使白术具有镇痛作用.在临床应用时,生白术主要 以健脾燥湿利水为主,炮制后其挥发油含量均有不同 程度的降低,从而影响了止痛功效的发挥.而制白术 虽缓和了”燥性”,增强了健脾和胃,补脾止泻的作 用J,但其止痛作用则大打折扣.此类现代药理研究 亦从另一角度验证了中医学”不通则痛,通则不痛”的 科学性,进一步为指导临床用药提供了可靠依据. 中药学是祖国医学的重要组成部分,在丰富多样 的药物种类中,像白术这样老药新用的例子非常多. 2000年《中国药典》一部收载含白术制剂共51种, 2005年《中国药典》白术药材居全国大宗常用中药材 之首,临床应用频率极高.除其常规补益作用,应重视 白术在疼痛治疗中的独特之处.现代中医药人更应将 继承,发展传统医学为己任,在药物应用方面,努力发 掘传统中药的临床新用,进而研制出行之有效的中药 复方制剂,这对于促进中医药现代化,加快中医药研究 进程,具有十分积极的意义. 参考文献: [1]江苏新医学院.中药大辞典()[M].上海:上海科技出版社, 1985:1376. [2]吕明惠.自术治疗腰痛[J].中药通报,1988,13(12):52. [3]罗继林.腰痛圣药话白术[J].四川中医,1994,12(10):23. [4]孙燕妮.白术的药理实验及临床研究进展[J].中国中医药科技, 1999,6(4):279—280. [5]刘素英.自术的药理与临床应用[J].广东药学,1999,9(3):22— 23. [6]朱树宽.自术应用新识[J].新中医,1993,25(12):16一l7. [7]周海虹.自术提取物对子宫平滑肌作用的研究[J].安徽中医学院 ,1993,12(4):39. [8]杜培凤,聂进红.白术研究综述[J].齐鲁药事,20O4,23(9):41-43. 柱前衍生HPLC法测定水蛭提取物中氨基酸的含量 刘相辉,裴福成,任桂萍,杨柳 (1.哈尔滨市食品药品检验中心,黑龙江哈尔滨150028;2.哈药集团中药二厂,黑龙江哈尔滨150078; 3.东北农业大学,黑龙江哈尔滨150030;4.黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040) 摘要:目的:水蛭中氨基酸的含量及其特征性.方法:采用柱前衍生HPLC法测定水蛭提取物中 的17种氨基酸,采用外标法定量.结果:所测定氨基酸在26min内可得到较好分离,氨基酸质量浓度与 峰面积呈良好的线性关系,r值均在0.995以上.结论:所建立的方法分离效果好,灵敏,准确,简便,适 宜水蛭提取物中氨基酸的测定. 关键词:水蛭;氨基酸;高效液相色谱;柱前衍生 中图分类号:R284.1文献标识码:A文章编号:1002—2406(2010)04—0038—02 水蛭为水蛭科动物蚂蟥(WhitmaniapigraWhit— man),水蛭(HirudonipponicaWhitman)或柳叶蚂蟥 (WhitmaniaacranulataWhitman)的干燥全体.具有破 血,逐瘀,通经之功效….主含蛋白质,多肽,氨基酸 类2j.前期试验中,我们曾采用柱前衍生法测定了地 龙中的氨基酸含量,收到了较好的效果.本实验采 用同样的测定方法进行了水蛭提取物中游离氨基酸和 水解总氨基酸的含量测定研究,为水蛭的质量评价提 供依据. 1仪器与试剂 Agilent1100系列高效液相色谱仪:1311A四元梯 作者简介:刘相辉(1974一),男,主管药师,主要从事药品检验及药品 质量标准制定工作. 通讯作者:任桂萍(1974一),女,副教授,主要研究方向:生物工程. 收稿日期:2010—03—16 修回日期:2010—04—15 度泵,1313A自动进样器,1315A二极管阵列检测器 (DAD). 17种混合氨基酸标准品,硼酸盐缓冲液,邻苯二 甲醛(OPA)试剂及9一芴甲基氯甲酸酯(FMOC)均由 Agilent公司提供;甲醇,乙腈(色谱纯),其他试剂均为 分析纯,超纯水. 水蛭(蚂蟥)药材购于安国药材公司. 2液相色谱条件 色谱柱:AgilentZOBAXEclipse—AAA柱 (4.6ram×150ram,3.5Ixm),流动卡目A:40mMNaHP04 pH7.8;B:乙腈一甲醇一水=45:45:10(V/V/V),流 速2mL?rain一.梯度程序见表1. 检测器设置:检测波长:338nm,带宽lOnm;参比 波长:390nm,带宽20nm;14.6min后检测波长:262nm, 带宽16nm;参比波长:324nm,带宽8rim;柱温:40~C. 进样:样品与衍生剂(OPA和FMOC)用自动程序 反应后进样. 2010年第27卷第4期 V0J.27,No.4,2010 中医药信息 InformationoilTraditionalChineseMedicine 表1梯度洗脱程序表 图1氨基酸分析HPLC图谱 1一ASP2一GLU3一SER4一HIS5一GLY6一THR 7一ARG8一ALA9一TYR10一CY211一VAL12一MET 13一PHE14一ILE15一LEU16一LYS17一PROa—HYP A一混合氨基酸标准品B一游离氨基酸样品C一水解氨基酸样品 Fig.1HPLCchromatogramsofaminoacids A—MixedstandardsolutionB—Sampleoffreeaminoacids C—HydrolyzingsolutionofPhe~timaaspergillum 3实验方法与结果 3.1水蛭提取物的制备 称取水蛭粗粉5g,加水30mL,浸泡60rain,超声处 理(250W,50Hz)60min,离心(12000r?min)10min, 取上清液,备用. 3.1.1完全酸水解氨基酸样品制备 精密量取水蛭提取物溶液1.5mL,加6mol?L 盐酸lOmL,抽真空脱气,N密封保护,在1IO~C下水解 24h,冷却后打开水解管,转移至蒸发皿中,水浴挥干盐 酸,再用水洗数次,彻底挥干盐酸,用0.1mol?L盐 酸溶解,并定容至10mL,0.45m滤膜滤过,滤液 备用. 3.1.2游离氨基酸样品制备 精密量取水蛭提取物溶液3.0mL,加入乙腈 9.0mL,摇匀,0.45m滤膜滤过,残渣加适量乙腈溶液 (乙腈一水=3:1,v/v)洗涤,滤膜滤过,合并滤液,减 压挥干溶剂,用0.1tool?L盐酸溶解,并定容至 10mL,0.45m滤膜滤过,滤液备用. 3.2工作曲线的绘制 将17种混合氨基酸标准品(浓度为1nmol? L)用0.1tool?L盐酸依次稀释成0.750,0.500, 0.250,0.100nmol?,,进行衍生和分析.结果,在 试验浓度范围内,除脯氨酸线性关系相对较差外(r= 0.996),其余16种氨基酸的线性相关系数均在0.999 以上(n=5). 3.3精密度试验 用混合氨基酸标准品溶液重复进样5次,结果17 种氨基酸的出峰时间及峰面积RSD均在0.9%以内. 3.4重复性试验 制备完全酸水解氨基酸样品和游离氨基酸样品各 6份,分别进行氨基酸含量测定,结果酸水解总氨基酸 (mg?g)分别为29.04,29.7l,29.13,30.29,29.96, 30.09,平均为29.70,其RSD值为1.74%;游离总氨 基酸(mg?g)结果分别为10.69,11.08,10.85, 11.03,11.26,11.17,平均为11.01,其RSD值为 1.91%. 3.5回收率试验 采用混合氨基酸标准品溶液加人法进行试验,结 果完全酸水解总氨基酸平均回收率为98.3%,RSD为 2.07%;游离总氨基酸平均回收率为97.7%,RSD为 2.14%. 4讨论 4.1用水解总氨基酸含量减去游离氨基酸含量可间 接得到水蛭提取物中抗凝溶栓活性蛋白及多肽类成分 的含量. 4.2在游离氨基酸测定过程中,为避免大分子蛋白类 物质对色谱柱产生污染,除采用常规的保护色谱柱外, 我们采用乙腈沉淀法对提取液进行预处理.试验结果 证实,样品溶液与乙腈比例为1:3(v/v)时,处理效果 最佳. 4.3水蛭提取液中各种氨基酸的含量差别很大.因 此,用等摩尔浓度的混合标准品溶液所作的校正曲线, 其线性范围不能涵盖所有的氨基酸,建议最好根据实 际样品中各氨基酸的具体含量情况配制不同浓度的混 合标准品溶液来作校正曲线. 4.4在试验条件下,游离氨基酸样品和水解总氨基酸 样品中均没有检测出CY2(胱氨酸),但均检测到HYP (羟脯氨酸),由于没有供含量测定用对照品,因此未 对其含量进行测定. 参考文献: [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:化学工业出 版社,2005. [2]黄荣清,孙晓东,李艳玲,等.水蛭的研究进展[J].中西医结合 ,2004,2(5):387—389. [3]裴福成,李长新,任桂萍.柱前衍生HPLC法测定地龙中氨基酸 的含量fJ].中医药,2007,35(3):26—27.