基于纳米材料修饰的过氧化氢、甲胎蛋白和癌胚抗原传感器研究（可编辑）

基于纳米材料修饰的过氧化氢、甲胎蛋白和癌胚抗原传感器研究（可编辑） 西南大学 硕士学位论文 基于纳米材料修饰的过氧化氢、甲胎蛋白和癌胚抗原传感器的 研究 姓名:袁艳茹 申请学位级别:硕士 专业:分析化学 指导教师:袁若 20080401两南大学硕士学位论文 摘要 基于纳米材料修饰的过氧化氢、甲胎蛋白 和癌胚抗原传感器的研究 分析化学专业硕士研究生 袁艳茹 指导教师 袁若教授 摘 要 生物传感器是一种以生物活性单元如:酶、抗体、核酸、细胞等作为敏感基 元,对被分 析物具有高度选择性的现代化分析仪器。自从年首次提出“在化学电极的敏 感膜中 加入酶以实现对目标物进行选择性分析”的设想。生物传感器由于其灵敏度 高、选择性好、 价格低廉、分析速度快和容易实现在线活体检测等优点,又有其在艋床医学、 环境检测和食 品工业等领域的广泛而潜在的应用,近三十年来取得了迅猛的发展,同时成为当前的研究热 点之一。生物活性物质固定是生物传感器的研究和开发中最为重要和关键的工作,其固定的 效果直接影响到传感器的灵敏度,选择性,寿命等。本文正是从生物活性物质的固定出发, 结合当今材料科学领域内的无机纳米材料,从而构建了多种生物传感器。研究工作主要分为 两部分: 第一部分基于纳米金和铂空心纳米球修饰的过氧化氢生物传感器的研究 .溶胶一凝胶是固定生物分子的良好材料,纳米金具有比面积大、吸附能力强,可以 很牢固地吸附生物大分子并保持其生物活性。结合两者优点发展了一种氧化氢传感器。具体 地,以铂电极为基底,用恒电位沉积一层普鲁士蓝,然后用纳米金和明胶构成的复合固 酶基质,结合溶胶一凝胶技术将辣根过氧化物酶固定在普鲁士蓝修饰的电极表面, 再用戊二醛对复合酶膜进行交联改性,从而制备了性能良好的过氧化氢传感器。采用 循环伏安法、计时电流法、交流阻抗法对传感器进行了电化学表征。在. 的磷酸盐缓冲溶液中,探讨了工作电位、、温度以及干扰物质对传感器响应电流 的影响。实验结果表明,此方法有较高灵敏度、较好抗干扰能力、良好稳定性及重现性。对 的线性响应范围为.×石~×。?.,检测限为.×。.。 .空心材料具有不同于它们对应的实心材料的性能,其具有密度低、耗材少、费用低、 催化效果显著等特点,近年来引起了广泛的关注。本项研究采用简单、高效、经济方法制备 了尺寸均一的铂空心纳米球,其结构已用透射电镜表征,并将其固定于裸玻碳电极 表面。研究了该修饰电极在磷酸盐缓冲溶液中对过氧化氢的电催 化作用。采用循环伏安法、计时电流法、交流阻抗法对传感器进行了电化学 表征。在.的磷酸盐缓冲溶液中,探讨了工作电位、、温度对响应电流的影 西南大学硕十学位论文 摘要 响,还考察了修饰电极的稳定性,重现性及抗干扰能力。修饰电极对的线性响应范围为 .×击~.×刁?.,检测限为.×。?~.其用于对实验试样中回收率的测定, 结果良好。 第二部分基于纳米金、纳米二氧化钛和纳米铁氰化镍修饰的免疫传感器的研究 纳米金沉积在半导体的纳米二氧化钛上可以提高纳米金催化的稳定性和提 升二者的性 能。同时这两种材料都具有良好的生物兼容性。纳米金具有很强的吸附能力和能保持生物分 子的活性。基于此,在裸铂电极上电沉积一层普鲁士蓝,之后在普鲁士蓝层上固定一层纳米 二氧化钛,其产生了一个具有强吸附能力的带有正电荷的界面,接着在这个界面上沉积一层 纳米金层,最后用纳米金层去固定甲胎蛋白抗体,从而制备了甲胎蛋白免疫传感器。对影响 该传感器性能因素作了详细的探讨。在优化的实验条件下,循环伏安技术测得峰电流与甲胎 蛋白在..和.?. ?范围内呈良好的线性关系,在信噪比为时,检出限 为. ?.。实验结果证明,该传感器展示了高的选择性,好的再生性,长期的稳定性 一 个月和良好的稳定性。 .传感器时电活性物质加入,可以提高传感器性能。因此基于生物兼容性好、吸附 能力强纳米金锄和良好电活性物质铁氰化镍纳米颗粒咿发展了一种新的在 临床免疫测定法中检测癌胚抗原的免疫传感器。构建传感器的步骤具体如下:首先,采 用一种简单电化学还原氯金酸溶液的方法将纳米金被固定在裸玻碳电极表面:其次,铁 氰化镍纳米颗粒用做一种电活性物质被固定在纳米金层上,铁氰化镍纳米颗粒的微结构和表 面形态已经用透射电镜和扫描电镜表征:再次,纳米金再次被固定在铁氰 化镍纳米颗粒上,纳米金能提供良好微环境和生物兼容性,有利于固定癌胚抗体锄.。 利用循环伏安技术和交流阻抗技术表征整个自组装过程。 实验还探讨了纳米金的沉积时间、 缓冲溶液的、孵育温度和时间等对此免疫传感器性能的影响。在优化的实验条件下,利用 循环伏安技术测得峰电流与浓度在.?.和.~. ?范围内呈良好的线性 关系;在信噪比为时,检测限为. ?..该免疫传感器展示了良好的重现性和再生性、 可接受的准确度、高的灵敏性以及它将是有价值的用于诊断和监测癌。 关键词:普鲁士蓝纳米金铂空心纳米球过氧化氢免疫传感器 ?’ 西南大学石贞士掌位论文, .. ” 黟曲:: ’ 锄” .吣 岫嬲:巧,鲫弘 私,笛 ,觚. ? , :“ 拶 ”. ?鲥 柚锄 ? , 越 印 鸲辩 锄唔 曲咄伽 咄 他. ,印锄 雏 ,锄印 , . 锄 ? ?啪 曲锄 仃,. , 拶??如 卸 . 砸。璐. 行 位 咖锄 驴 响弱 忙 船:?劬劬锄 ..锄 驴 唱锄 伽’ 臼 . 、 笛: , ? ’ .? .姗 .咖硎 耐撇锄 曙 仃 够 锄昀 锄:搬 ,、 够 ?【璐.’ 矾、嬲仃 啪仃印 ?.廿, 】【笛嬲仃 油廿 ? 玎胁 锄,粗嬲佗 啪. 啪. . 锄 臼眵,枷叫柚 鹋 . . 。.. 而肌锄 嘲毹 ., 西南大学硕十学位论文 . ?弱印 ,,阳:,. 纰 坝他劬辩,觚鄂旧 够圮圮佗衄 .×.?.×。 ?。】【 ?培.×’ .一. . 腩陀舶 明孤 ‘啪矾 ”孔 协 砷,锄陀 觚衄 班 乜. 舔他 笛憾 .璐, ,,锄 诬仉托嬲 觚舱 们 、娜响 仃锄 ,锄 鹳 咖. 仃. , 仃 舔咖. 锄仃?,仃 锄 仃 撇 仃 矗 锄 仃 仃. 胚 . 啪锄 舱 .,舔印 ,,. ,蛐饥 觚 鹊咖. 仃趴 咖. .×.~.×. .. 池 .×.‘~. 臼 嬲 陀 锄, . ?., . 伪. ”豫 鹤墒 .锄. 锄 而孤锄? 由? ,【 ., 删锄 骼. 够陀觚 锄仃, 他豁锄仃 弱?姐 啪 臼,唱柚卸.. 不 , 砌 觚 仃 肌伽 . . . 他 . 瑚丘鲫. 。札叶劬 ?. . 璐 【 。.‘ 印? 曲?咄 陀劬啦咖, 柚 哦出劬 .舶甜 , 仃 觚.锄油 . 仃?锄 仃 巾 姊锄黜锄狮 柚 驴 锄 岫。勰. 笛.豳:,锄 嬲 ?西南大学硕士学位论文仃 ;孙 锄仃 劬,陀髓? .仃觚 阳 觚? ;,锄 鹤 .仃 ,、地 眦啪 ?.仃 锄 锄时 咖 .仃. 疗, 佗 ?’ 阳陀锄 粕州 响珊锄. , 【弱仃; 盯 . 笛 铆。啪仃 . . .’札.锄纳 ?~,洫 . .’ 啪 阳肌?. 陀釉够锄 咄?例 ? 埘柚. : ; ;. ; ; 独创性声明 学位论文题目:基王纳苤越整签鱼盟过氢焦氢里舱蛋鱼垒癌厘拭基 佳盛墨数珏宠 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得西南大学或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 签字日期:复两予年谚月日 学位论文作者:。在扭新 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定,有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。 本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 保密的学位论文在解密后适用本授权书,本论文:口不保密,口 保密期限至 年 月止. 学位论文作者签名:表弛荔 导师签名: 签字日期: 红月;日 签字日期:衣?,孑年尹月乡矿日西南大学硕士学位论文 第章绪论 第章绪论 众所周知,世纪席卷全球的现代科技革命是以生物技术与信息技术为主要特征。两种高 新技术的相互融合,派生出一个全新的、异常活跃的研究领域一一生物信息技术体系,生物传感 器则是其中最典型的代表。生物传感器利用生物化学和电化学反应原理,将生化反应信号转 换为电信号,通过对电信号进行放大和模数转换,测量出被测物质及其浓度。由于其灵敏度 高,选择性好,设备简单,检测迅速和容易实现在线活体检测等,而在临床诊断、食品和发 酵工业、环境监测、生物工程、分析化学和训练运动员等方面表现出相当广泛的应用前景。 .生物传感器的简介 ..生物传感器的基本定义和工作原理 生物传感器是由固定化生物功能物质酶、蛋白质、抗原、抗体、生物膜等做敏感元件与 适当的化学信号换能器件组成的生物电化学分析系统。它具有特异识别分子的能力,以生物体 内存在的活性物质为测量对象。所谓化学信号换能器的作用是将生物化学输出信号转变为可 以输出的,并加以程序化的电信号,光信号,热信号或声音信号。 生物传感器的工作原理是:待测物质经扩散作用进入固定生物敏感膜层,经分子识别而发 生生物化学反应。其产生信息如光、热等被相应的化学信号换能器变为可测量的电信号。再 经二次放大并输出,用电极测得其电流值或电位值,从而换算出被测物的量或浓度。 团?一 圉一? 他. ..生物传感器的发展历程 年等人报道了用葡萄糖氧化酶与氧电极组合检测葡萄糖,最早提出了生物传 感器酶传感器原理?。年和研制出世界上第一支葡萄糖氧化酶电极,用于定 量检测血清中葡萄糖含量,这是生物传感器的首次问世【】.继这些开创性的工作之后,每年生 物传感器方面均有大量的文献发表,从事这方面研究相当活跃。 到目前为止,可以说生物传感器经历了三代。 第一代生物传感器是将生物活性成分截留或结合在非活性基质膜上透析膜或反应膜和 电化学电极组成’。其结构较简单,工作原理较易理解。它用酶作为天然电子传递体?氧来 沟通与电极之间的电子通道,直接检测酶反应底物的减少或产物的生成的传感器。但是它易两南大学硕士学:论文 第章绪论 受环境中氧分压波动的影响,响应时间较长且难以进行活体分析,其灵敏度也不太高。 年代起,人们开始用小分子的电子传递媒介体来代替氧沟通酶的活性中心与电极之间 的电子通道,通过检测媒介体的电流变化来反映底物浓度的变化,构造了出了第二代生物传 感器。它是将生物活性成分直接吸附或共价键和到转换器表面上,而不需要非活性基质膜, 测定时不需要向样品中加入其它试剂,从而改善了分析的质量和简化了操 作。但是,酶一般 都是生物大分子,其氧化还原活性中心被包埋在酶蛋白质分子里面,它与电极表面间的直接 电子传递难以进行。年代中期以来,介体型酶电极的发展很大程度上改善了酶电极性能。 课题组采用二茂铁作为电子传递媒介体制备了酶修饰电极,二茂铁在电极表面和酶催化 反应层间起传递电荷的作用,替代了氧的作用,而且二茂铁的氧化电位很低,从而克服了上 面的缺陷【】。介体型酶电极逐渐成为生物传感器家族中的主角,研究工作主要集中在电子传递 媒介体的选择和其在电极表面的修饰方法方面。 尽管媒介体型第二代生物传感器有许多优点,人们仍在追求酶与电极间的直接电子转移。 将生物分子共价键合到化学修饰电极上,或将其固定到多孔电聚合物修饰电极上,使生物分 子活性中心与电极接近,利用酶自身与电极间的直接电子转移来完成信号的转换的生物传感 器被称为第三代生物传感器。传感器能直接进行电子传递、感知和放大界面物质的变化,从 而把生物识别和信号的转换处理结合在一起。蛋白质电化学表明,电子交换速率依赖于蛋 白质的性质、电极材料和电极/电解质界面的状态,只有少数的一些低分子量的电子载体.如细 胞色素、细胞色素、铁氧化还原蛋白等,可以在金属电极上监测到电子的直接传递。高分 子量的蛋白质酶、抗体等的活性中心深埋在多肽结构内部,很难发生直接电子传递。为 了实现电子在电极上的直接电子传递,近年来发展了许多固定化的新型材料如有机导电聚合 物膜【、有机导电复合材料膜【,、金属纳米颗粒或金属和非金属纳米颗粒【,.。用上面 材料所构建传感器性能稳定、工作电压较低、使用寿命较长、受氧及其底液中电活性物质干 扰较小;能较好地保持蛋白质分子的生物活性等优点,为生物传感器的发展开辟了新的方向。 ..生物传感器的分类 生物传感器的分类有多种,总的说来可从下面三个方面进行分类。 按生物传感器中生物分子识别元件上的敏感物质不同,可将生物传感器分为酶传感器、免 疫传感器、组织传感器、微生物传感器、细胞及细胞器传感器。 根据生物传感器的信号转化器换能器不同,可把生物传感器分为电化学生物传感器电 位型、电流型、电导型和电容型生物传感器等、半导体生物传感器、热生物 传感器、光学生 物传感器荧光型和化学发光型等、压电晶体生物传感器、介体生物传感器等。 根据传感器输出信号的产生方式可分为生物亲合型生物传感器和代谢型或催化型生物传 感器。前者利用分子间特异的亲和性,如传感器、免疫传感器、受体传感器等;后者包 括酶传感器、组织传感器、微生物传感器等,博】; .生物功能物质的固定 将具有分子识别能力的生物功能物质,如酶、抗原.抗体、细胞等,包裹或吸附于某些高 分子材料、生物高分子或无机材料如分子筛上制备成感应器敏感膜,这称为生物功能物 两南大学硕士学位论文 第章绪论 质的固定化。生物功能物质固定方法都必须满足生物功能物质活性保持和所制备传感器的稳 定性,这是制作生物传感器的最为关键部分。为了研制灵敏度高、选择性好、廉价和寿命长 的生物传感器,固定化技术已成为世界各国竞相研究和探索的目标。经过科研工作者们不断 努力,已经建立许多固定化方法。 ..生物功能物质的固定方法 ...吸附固定法 吸附固定法是生物功能组分通过吸附作用固定在转换器表面上的一种较为简单的固定化 方法。它是基于生物分子极性键、氢键、疏水键以及静电等作用,将生物分子吸附于不溶性 载体上。吸附固定法具有无需化学试剂、活化和清洗步骤少、生物组分不易降解、对生物功 能物质生物活性影响小等优点。固定后的生物分子由于与载体相互作用力弱而容易从基体上 脱落,存在稳定性和重现性差,而不被广泛应用。 ...共价键合固定法 将电极表面进行化学处理和修饰,然后将生物功能物质通过化学试剂以共价键的方式结 合固定于电极表面的一种固定化方法。电极表面的共价键合较吸附困难,但提供了较稳定的 固定化生物敏感膜,因此被较多地采用。但是也存在有的化学反应容易使生物功能物质失活 问题。 ...包埋固定法 包埋固定法是将生物分子直接包埋在多聚合物中一种方法,分为溶胶.凝胶法和微囊化法。 包埋法一般不涉及化学反应,生物功能物质的生物活性嫩能得到较好的保持。所用凝胶主要 有聚丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚乙烯醇、醋酸纤维等合成高聚物及海藻酸、明 胶、胶原等溶胶状高聚物。但是也存在酶易从传感层渗漏,扩散限制问题。十几年前,科研 者们开始探索用人工合成的聚合物如娟嬲 等将酶直接包埋到电极表耐们,这 些膜不但能包埋生物分子,还可以抗干扰、抗毒化且膜比较致密酶分子不易渗漏,是较好的 包埋材料。 ...电化学聚合法 电化学聚合法是将聚合单体和酶及其相关物质辅酶、介体等同时混合于电解液内,通 过恒电位或电位循环扫描法使单体电氧化或还原聚合在基础电极表面,同时由于吸附或静电 作用可以将生物分子及其相关物质包埋于高分子膜内,直接固定于电极表面,是近年来发展 的聚合物包埋技术。目前最常用于固定化的聚合物有:导电的聚吡咯【,聚苯胺【】,非导电 的聚苯酚【职】,聚邻苯二胺【等。这种方法具有快速、简便、可控、便于实现自动化操作的特 点,尤其适用于生物传感器的微型化构造。 ...层层组装方法 层层组装方法是近几年发展起来的利用静电作用固定带有相反电荷化合物 的一种固定化 西南大学硕学位论文 第章绪论 方法。现已经应用于多种生物分子酶、抗体、、蛋白质的固定和许多纳米材料的制 备中。以酶的层层组装为例,根据酶分子的等电点选择适当的,使酶分子带有过多的正电 荷或负电荷,然后吸附酶到带有相反电荷的聚电解质上,接着重复交替吸附聚电解质和酶。 通常是把酶当作大阴离子靠静电作用和其它的大阳离子如聚赖氨酸。聚烯丙胺【】等,在电极 表面一层一层地吸附沉积组装酶电极。 ..生物功能物质的固定材料 生物分子的固定材料主要包括纳米材料、溶胶.凝胶、有机导电聚合物及生物材料等。 ...纳米材料 纳米材料是指颗粒尺寸在~姗的超细材料,其尺寸大于原子簇而小于通常的微分,处 在原子簇和宏观物体交界的过渡区域。纳米材料性能与对应的宏观材料相比,其基本物理性 能如电、磁、热、密度、熔点等和力学性能有着奇特的变化。一般来讲,纳米材料与其 对应的正常态材料相比,密度降低,强度和硬度提高,塑韧性改善,扩散能力 提高,热膨胀 系数提高,导热性降低,弹性模量降低。此外还具有一些独特的物理性能,如超弹性模量现 象、磁致热效应等。 纳米材料的界面结构和表面结构能够影响材料的性质,由于纳米颗粒的直径比较接近电 子的平均自由程,所以许多宏观的物理和化学理论已不再适用于纳米颗粒,下面主要介绍纳 米粒子的几个主要的特性:体积效应: 当纳米粒子的尺寸与传导电子的德布罗意波波长 相当或更小时,周期性的边界条件将被破坏,其磁性、内压、光吸收、热阻、化学活性、催 化性及熔点等都较普通粒子发生了很大的变化。表面效应:指随着纳米粒径减小,其表 面原子数占总原子数之比急剧增大后所引起的性质上的变化。文献报道【说随着纳米粒子粒 径减小,表面原子数及比例迅速增大,纳米粒子的比表面积、表面能和表面结合能都急剧增 大。纳米材料所具有表面效应使其粒子表面具有很高的化学活性。量子尺寸效应:粒子 尺寸减小到一定值时,费米附近的电子能级由准连续能级变为分立能级,吸收光谱由连续光 谱带向短波方向移动,且具有分立结构的线状光谱,即为量子尺寸效应。早在世纪年 代,久保【】指出,金属纳米颗粒具有特殊的电子取出和注入效应。他采用一电子模型求得金 属纳米粒子的能级间距与颗粒大小之间的关系,得到颗粒变小时,产生能级的分离,能级间 距随颗粒变小或总电子数变小而变大。当能级间距大于热能、磁能、静磁能、静电能、光子 能量或超导态的凝聚能时,量子尺寸效应就表现得十分明显,由于这一特点就导致纳米颗粒 的磁、光、声、热、电以及超导电性与宏观特性有显著的不同。宏观量子隧道效应:粒 子具有穿越比总能量高的势垒的能力称为隧道效应。近年来,人们逐渐发现了一些宏观量, 如微粒的磁化强度、量子相干器件中的磁通量以及电荷等也具有穿越宏观系统的势垒而产生 变化的隧道效应一宏观量子隧道效应? 锄啪【刀,用此概念 可定性解释超细镍微粒在低温下继续保持超顺磁性。等人】采用扫描隧道显微镜 技术控制纳米尺度磁性纳米粒子的生成,用量子相干磁强计研究低温条件下微粒 磁化率对频率的依赖性,证实了低温下的确存在磁的宏观量子隧道效应。 由于纳米粒子的独特性能,近年来科学工作者们做了许多研究探索,将纳米粒子引入生物 西南大学硕七学位论文 第章绪论 电化学传感器中以改善传感器的响应性能【聊。由于纳米粒子,特别是复合纳米粒子的生物 相容性、吸附定向、吸附浓缩效应和量子尺寸颗粒效应等特性,能明显提高仿生体系的寿命 和功能;此外,空心纳米材料作为一种高级纳米材料,由于其除具有普通纳米材料具有性能 外,还有密度小、比表面积大、耗材少、催化能力强等优点,能显著提高其应用价值。它们 在生物化学分析中的应用必然是一个方兴未艾而又值得高度重视的新兴领域。 ...溶胶.凝胶 溶胶.凝胶材料作为固定化载体,开辟了制备生物传感器的新领域“。其原因在于溶胶. 凝胶材料具有以下优点:有一定刚性,且呈化学惰性,不但提高了生物功能分子的热稳定性 而且保持了其活性:具有良好的生物相容性,为微传感器植入生物体内提供了可能;制备条 件可控制,控制溶胶一凝胶的孔径大小及其分布为生物功能物质提供足够活动空间而不至于 流失从而提高传感器寿命;可通过对溶胶一凝胶前躯体的功能化赋予其新的特性。 ...有机导电聚合物 有机导电聚合物具有电化学活性,将有机单体和生物功能分子同时混于电解液中,通电使 有机单体在电极表面形成有机导电聚合物,同时生物功能分子也被包埋在在聚合物膜内,可 用来构建生物传感器。生成的膜厚度可调控,重现性好并与电极表面有较强粘附力。另外不 少聚合物膜具有选择性透过某些物质的功能,可起到降低干扰,防止电极被污染的作用。有 机导电聚合物现已广泛的运用于生物分子的固定【‘卯。 ...生物材料 生物材料特有的生物结构为生物的存活提供了很好的微生物环境,使生物分子活性保持率 高,寿命长。壳聚糖类载体属于天然高分子材料,对人体无毒,具有良好的生物相容性和可 降解性,因此是近年来国内外研究最热门的固定化材料之一,而以壳聚糖为载体用共价连接 法固定化生物分子是研究最活跃固定化方法。【】对壳聚糖进行巯基化处理,获得了 一巯基壳聚糖,可以直接与酸性磷酸酶结合,固定化后的酶催化一硝基苯磷 酸水解,反应 活性几乎没有损失,反复使用时仍具有较高活性。郭晓明【】等用脱乙酰基魔芋葡甘聚糖固定 葡萄糖氧化酶,制备了葡萄糖传感器。脱乙酰基魔芋葡甘聚糖保持了酶的生物活性,所制备 的传感器也表现出了良好的灵敏度、稳定性和寿命。王玉军【等用一种具有良好透气与透湿 性、无毒、无刺激、与人体相容性强的生物材料家蚕丝蛋白质来固定化酶,并用于生物传感 器的制备。家蚕丝蛋白质作为一种良好的固定生物分子的材料,很好保持了酶的活性。传感 器也表现出较好稳定性和灵敏度。张国林【】等用乙基纤维素和乙炔黑获得的导电复合生物材 料去固定葡萄糖氧化酶,并用于生物传感器制备。并通过实验证明这种固定方法有利于酶催 化反应的进行。 .电化学生物传感器 电化学生物传感器是具有电化学信号转换器换能器一类生物传感器。电化学换能器有 许多优势:能在混浊的溶液中操作;具有较高的灵敏度、较好选择性并且容易微型化、智能 两南大学硕士学位论文 第章绪论 化;分析快速:所用仪器简单、便宜、操作简便;电极体系可实现的连续、实时、在线检测 定物质浓度或量的变化等。因此电化学换能器常被广泛用于传感器的制备。电化学换能器又 可分为电流型、电位型、电导型和电容型。对应应该有四种生物传感器:电流型生物传感器、 电位型生物传感器、电导型生物传感器和电容型生物传感器。 ..酶生物传感器 酶生物传感器一种把酶膜固定在电化学换能器表面构成的最普通的酶基电化学生物传感 器。当酶选择性地催化生化反应时,生成或消耗一种可被电极测定的物质,当反应达到稳态 时,电活性物质的浓度可以通过电位或电流模式进行测定。 . 电化学酶生物传感器把固定化酶和电化学传感器结合在一起,因而具有独特的优点: 由于酶的专属反应性,使其具有高的选择性,能够直接在复杂试样中进行测纠如。.具有电 化学电极的高灵敏度;因此,酶修饰电极在生物传感器领域中占有非常重要的地位。 酶生物传感器分为电位型和电流型两类传感器【。我们主要介绍电流型酶生物传感器。 电流型酶传感器是以酶促反应所引起的物质量的变化转变成电流信号输出,输出电流大小直 接与底物浓度有关?.电流型传感器具有更简单、灵敏、直观的效果,是生物传感器领域中 研究最多的一种类型记纠.电流型酶生物传感器的电极反应包括酶化学反应和异相电子转移 反应。其所要解决的中心问题就是使反应能够在恒电位下快速进行,将电子从反应中心转移 到电极表面,形成响应电流。然而,绝大多数氧化还原酶的氧化还原中心一般处于内部,有 的酶外部还有一层糖蛋白【’引,这种结构严重阻碍了反应中心与电极表面间的电子转移及还 原性辅酶的有效循环。因此,解决酶活性中心与电极表面间的电子转移问题是酶传感器发 展的方向。 ..免疫生物传感器 电化学免疫传感器是一种将高灵敏电化学分析方法与特异性免疫学技术相结合,而发展的 用以监测抗原?抗体反应的一类方法。免疫传感器的工作原理和传统的免疫测试法相似,都 属于固相免疫测试法,即把抗原或抗体固定在固相支持物表面,来检测样品中的抗原或抗体。 免疫传感器具有能将输出结果转化为数字化的精密换能器,不但能达到定量检测的效果,而 且由于传感与换能同步进行,能实时监测到传感器表面的抗原抗体反应;而传统免疫测试法 的输出结果只能定性或半定量地判断,且一般不能对整个免疫反应过程的动态变化进行实时 监测。抗原抗体的反应被公认是一种专一性极强的化学反应和传感器技术具有及时、快速、 简便、灵敏、自动的特点,因此发展的免疫传感器具有专一、快速、灵敏、选择性高、操作 简便等特点。免疫传感器广泛地用于医学临床诊断、环境监测和食品工业等领域,获得了良 好的可检测性【羽。根据换能器不同,电化学免疫传感器可分为电位型、电流型、电导型和 电容型免疫传感器,研究较多的是电位型和电流型免疫传感器。本论文主要介绍电流型免疫 生物传感器。 电流型免疫传感器是将电化学反应与抗原/抗体免疫反应相结合的一种分析方法。由于抗 原一抗体生物分子本身不具备电活性,电流型免疫传感器一般需要标记的抗原/抗体,标记物 一般用电活性物质或者酶标记。通过固定化的抗体抗原与溶液中抗原抗体发 生免疫反 第章绪论 两南大学硕士学位论文 应,引起电活性物质或者酶催化反应的底物反应的电流信号的变化来间接测定待测样品中的 , 抗原抗体的浓度【羽。 .生物传感器的应用和展望 ..生物传感器的应用 由于生物传感器具有快速、灵敏、省时、精确、样品需要量少和重复性好等优点,正在成 为一种强有力的通用分析工具.它的应用也从涉及最广泛的临床诊断、生物医药、生命科学 研究、环境监测、到生物工程、食品分析、军事等领域。现就介绍主要几种应用。 ...临床诊断上的应用 生物传感器可以广泛地应用于对体液中的微量蛋白如肿瘤标志物、特异性抗体、神经递 质,小分子有机物如葡萄糖、乳酸及各种药物的体内浓度,核酸如病原微生物、异常基因 等多种物质的检测。在现代医学检验中,这些项目是临床诊断和病情分析的重要依据。能够 在体内实时监控的生物传感器对于手术中和重症监护的病人很有帮助。用酶、免疫、基因传 感器等生物传感器来检测体液中的各种化学成分,为医生的诊断提出依据。 ...生物医药上的应用 利用生物工程技术生产药物时,将生物传感器用于生化反应的监视,可以迅速地获取各种 数据,有效地加强生物工程产品的质量管理。因此运用生物传感器技术实现化合物准备、生 物活性测定和数据分析处理的自动化,建立简便快速的大规模的生物检测方法是未来新药研 究开发的关键之一。 ...环境监测上的应用 随着环境污染问题日益严重,人们对能够连续、快速、在线监测污染物的仪器的需求也愈 来愈迫切。自从年代初国际上开始了对生物传感器的广泛研究以来,目前已有相当部分的生 物传感器应用于环境监测【删。 ...生物工程上的应用 生物传感器在生物工程上应用主要包括在基因工程、发酵工程、细胞工程及酶工程上的应 用。基因工程上应用:众所周知,双链分子中的碱基是互补的。若合成出与被测目标物 分子碱基序列互补的单链分子,并以此作为生物传感器的探针,结合换能器就能够 将所发生的杂化反应的有关信息记录下来。 从而可开发出在基因工程中应用价值极大的 生物传感器:细胞工程上应用:由于生物传感器有着其他传感器无法比拟的简单、可靠、准 确、尤其是可以深入极其微小空间进行检测的优点,生物传感器在细胞工程中有着极大的应 用价值:发酵工程上应用:在发酵过程中,尤其是在发酵过程中的中后期,需要对发酵罐中 细菌浓度进行定时检测,以确定停止发酵的最佳时间。把生物传感器用于发酵工程中,将使 工作效率得到极大的提高;酶工程上应用:酶生物传感器的发展,直接推动了酶工程的进步, 在酶工程的研究中有着举足轻重的作用。 第章绪论 西南大学硕士学位论文 ...食品分析上的应用 现在,随着人们生活水平的提高,人们对食品质量和安全性的要求越来越高,为保证食品 质量及对加工过程进行人为的控制,需要比较合适的分析方法。长期以来广泛应用的物理、 化学、仪器等方法已不再能满足现代食品分析的需要,而生物传感器具有较好的敏感性、特 异性,操作简便、响应速度快等优势,尤其是它能对许多过去难于测定的成分进行检测,并 能现场在线检测,它可应用于食品成分分析、食品添加剂的测定及食品卫生检测等多方面【, 吲。 ...军事上的应用 生物传感器技术在军事领域中具有广阔的应用前景。现代战争往往是在核武器、化学武器、 生物武器威胁下进行的战争。侦检、鉴定和检测是整个“三防”医学中的重要环节,是进行 有效化学战和生物战防护的前提。由于生物传感器具有高度特异性、灵敏性和能快速地探测 化学战剂和生物战剂包括病毒、细菌和毒素等的特性,将是最重要的一类化学战剂和生物 战剂侦检器材。 ..生物传感器的应用前景 随着科学技术的交叉发展、相互渗透,对传感器的质量、品种等都提出了新的要求。为 了获得高灵敏度、高稳定性、低成本的生物传感器和为了实现传感器实用化和商品化,人们 开始从开发新材料、研究新方面,着力实现传感器的着微型化、实用化、集成化和智能 化。 新材料的使用特别纳米材料的介入为生物医学传感器的发展提供了无穷的想象空间。近年 来,纳米技术逐步进入生物传感器领域,并引发突破性的进展。纳米结构可以是管道、纤维、 颗粒、光纤以及薄膜和多孔体等。纳米材料可以广泛地应用于敏感分子的固定纳米金、碳纳 米管、待侧物质的富集和浓缩纳米磁粒子、信号的检测和放大纳米金、纳米磁粒子、荧 光纳米颗粒。由于纳米结构有着优异的化学和物理性能,有着极高的比表面,有利于提高敏 感分子的吸附能力,并能提高生化反应的速度,因此被广泛用于生物传感器表面吸附层的制 作。 新工艺的介入也一定会大大推动传感器的发展。集成加工技术、微细加工技术、薄膜技术 等的引入有助于制造出性能稳定、可靠性高、体积小的敏感元件。随着半导体技术的发展,现 在已经把敏感元件与信号处理以及电源部分做在同一个基片上,从而使检测及信号处理一体 化。而随着人们健康意识的不断提高和现代医学手段的多样化,无创检测成为近年来传感器 发展的另一热门方向,通过改变敏感元件或检测原理来实现无创检测也成为现代临床诊断研 究的重点领域。自诊断和自报警功能,智能传感器能根据预先设定的算法对设备的工作是否 正常进行检测,并能诊断故障根源,并以故障代码的形式进行显示:接口功能,智能传感器 采用数字化输出,其输出的数字信号是符合某种协议的,从而将多个传感器以网络 、 形式组成一个系纠凹】。 生命科学和纳米科技世纪最前沿的两大学科,随着“人类基因组工作草图”的完成、新 两南大学硕士学位论文 第章绪论 材料和新工艺出现,无论在原理上还是加工技术上都将为生物传感器带来巨大变革。可以预 见,在不久的将来,生物传感器将走进我们的生活,它将在药物的发现和筛选、疾病诊断、 生物信息遥测和基因检测分析等方面展现广泛的应用前景。 .本论文的研究思路 ’ 一 ?生物传感器构建最关键步骤是生物功能分子的固定。本论文从对生物功能分子的固定化 方法出发,进行了一系列探索,设计构筑了几种性能良好的生物传感器。主要研究内容如下: 溶胶一凝胶是固定生物功能分子的良好材料。它具有的良好生物相容性、稳定性、 化学惰性以及溶涨性小的特性适合生物功能分子的固定;此外纳米颗粒具有比表面积大、吸 附能力强,可以很牢固地吸附生物大分子并保持其生物活性。本论文第二章正是利用此二种 材料明胶和纳米金的优势把辣根过氧化物酶固定,并保持了酶的活性。利用设计的传感 器对其底物过氧化氢检测,其结果令人满意。 空心纳米材料催化是近年研究的热点。众所周知,贵金属负载在碳上对甲醇等有良 好的催化。但是实心的贵金属催化耗材多、费用贵、催化效果一般,人们一直在追求新的耗 材少、费用低、催化效果显著的材料。基于空心材料的良好性能,本论文第三章合成了铂空 心纳米球,并把这种铂空心纳米球固定在电极上面直接用于过氧化氢的催化, 通过实验证明 这种空心纳米球的催化效果要比实心纳米球好几倍,而且也节省了材料和费用。在保持一定 选择性的前提下,不用导入酶而影响传感器的寿命。 纳米材料介入生物传感器,为传感器的发展增加了很多想象空间。纳米二氧化钛作 为一种半导体纳米材料在环境清洁,光催化及燃料电池有广泛的应用。最近报道说纳米金沉 积在半导体的纳米二氧化钛上可以提高纳米金催化的稳定性和提升二者的性能。此外纳米金 具有良好生物兼容性和很强吸附能力,可以很好固定生物分子并保持其生物活性。正是基于 此本文第四章利用沉积的普鲁士蓝做电活性物质,把纳米金沉积在纳米二氧化钛上面,并用 纳米金来固定甲胎蛋白抗体,从而来检测甲胎蛋白。通过多次实验测试证明纳米金沉积在纳 米二氧化钛上固定抗体制备的免疫传感器的性能要比只用纳米金固定抗体制备免疫传感器的 性能好很多。我们用所制备的传感器去检测血清的甲胎蛋白,获得满意的结果。 当制备免疫传感器时,电活性物质的加入,能提高传感器的性能如灵敏度、检测限 等。固定在电极上的电活性物质一般要电聚合、电沉积或层层自组装上去。但是前面固定电 活性的方法存在费时,受表征底液酸度或离子强度影响容易从电极表面渗漏等缺点。本论文 第五章合用简单方法合成了一种优良电活性物质铁氰化镍纳米颗粒。这种纳米电活性物质可 以通过简单滴涂法稳定固定在电极上,受底液酸度和离子强度影响较小。此外通过简单电化 学还原氯金酸方法制备了具有良好生物兼容性和强的吸附能力纳米金。此种方法形成纳米金 具有表面粗糙,结构紧凑等特点。利用纳米金良好的特性去固定铁氰化镍纳米颗粒和吸附更 多的抗体,从而发展了一种新型癌胚抗原免疫传感器。实验结果显示这种固定方法可以很好 的固定抗体,并保持它的生物活性。此外此方法还展示了良好选择性,重现性、稳定性和准 确性。 西南大学硕士学位论文 第章基于普鲁十蓝和明胶修饰的过氧化氢生物传感器 第章基于普鲁士蓝和明胶修饰的过氧化氢生物传感器 .引言 与我们生活相关的许多领域都涉及到过氧化氢,从其含量低的环境和生物样 品,到其含量 高的化妆品和肥料【。此外,过氧化氢还是生物体内许多氧化酶反应的副产物,因此对其含量 的测定在环境、生物、工业、临床诊断和食品等领域具有非常重要的实际意义。目前检测过氧 化氢的方法有滴定法、化学发光法、荧光法、色谱法、电化学法、分光光度法等。利用酶 催化反应的高度专一性和电化学信号检测高灵敏性的电化学酶传感器在近二十年得到了迅速 发展【。人们尝试用多种方法来固定酶,这些方法包括物理吸附、共价键和、包埋等四。以上 固定酶的方法可能会造成酶的失活以及媒介体的渗漏,因此酶的固定及其活性的保持是一个关 键的问题。溶胶一凝胶生物材料是目前研究较多的固定酶的载体,具有很好的生物相容性、稳 定性、化学惰性以及溶涨性小等特性,其已经成功用于生物活性物质的固定,引。. .纳米科技和生命科学是世纪最前沿的两大学科,纳米技术的介入为生物传感器的发展提 供了很大的发展空间。纳米颗粒具有比表面积大、吸附能力强,可以很牢固地吸附生物大分子 并保持其生物活性限,近年来研究者们已经将纳米粒子引入电化学生物传感 器并取得很大的 成绩,其中过氧化氢生物传感器也得到迅速发展【舡的。鞠烷先等将纳米材料与传统的固定酶的 方法吸附、包埋、自组装、溶胶一凝胶等结合起来制备生物传感器,取得了良好的效果唧, 。 本文以具有良好催化性能和电化学活性的普鲁士蓝为基底,利用纳米金溶胶和明胶构成的 复合固酶基质,采用溶胶一凝胶技术固定辣根过氧化物酶于普鲁士蓝修饰的铂电极表面,并结 合明胶工艺,用戊二醛对其交联改性,提高了膜的机械强度,从而制得了性能优良的生物传感 器。该传感器制备简单、成本低,同时此方法具有较高灵敏度、较好抗干扰能力、良好稳定性 及重现性。 .实验部分 ..仪器与试剂 电化学工作站上海辰华仪器公司, 叭.型超级数显恒温器重庆四达实 验仪器厂制造,型透射电子显微镜日本日立公司,超声清洗仪昆山市超声 仪器有限公司,.电子天平瑞士公司,.型酸度计上海大普 仪器有限公司,型交流阻抗测试系统德国 公司,辣根过氧化物酶 心,吼/,上海丽珠生物技术有限公司,和?四川化学试 剂公司,抗坏血酸重庆川东化工集团有限公司,甘氨酸上海康达氨基酸厂,亮 氨酸上 海试剂三厂,%,~, 葡萄糖.&上海试剂厂,明胶浙江省温州市乐 升化工试剂厂,氯金酸公司、避光保存,酪氨酸、一半胱氨酸、多巴氨、戊二 醛 为生化试剂,其他试剂如、棚、、柠檬酸三纳均为分析纯试剂,实验用水均 ?. 为二次蒸馏水。磷酸盐缓冲溶液是含. ?.‘的的. 和 西南大学硕士学位论文 第章基于普鲁蓝和明胶修饰的过氧化氢生物传感器 配置的.~.的缓冲溶液。 ..金溶胶的制备 金溶胶的制备参照文献【:取一定量的.,加热至沸后,迅速加入一定量的新鲜 配置柠檬酸三钠溶液,溶液的颜色由灰黄色变为深红色,保持沸腾 ,即制得 纳米金溶胶。 ..修饰电极的制备 ...普鲁士蓝膜修饰铂电极/的制备 铂电极?姗先用.,.?的糊抛光,之后用蒸馏水冲洗干净,再分别在 . ?. 、无水乙醇、蒸馏水中超声洗涤干净待用。将处理好的电极放入新制的 ?. ?。 咖?“. 用盐酸调节溶液的.~.溶 液中于. 电沉积 ,之后在..~. 电位区间以 ?以的扫速于. 。取 用盐酸调节溶液的.~.溶液中扫描圈.电极在?下恒温 出电极在室温下冷却,然后放在.的中扫描稳定待用。 ...酶电极/锄.//的制备 取 此 ‘’溶液由.的配制和此的纳米金溶胶混合均 匀,然后把皿的%/明胶放进混合液,使之混合均匀,然后将沉积有的电极 浸入其中 ,取出来?干后用微量注射器吸取“该溶液,均匀滴涂在刚浸过混合液的 电极表面,置于?的冰箱中 , ,随后把电极浸入%川%的溶液中交联 放在?的冰箱中待用。 ..实验方法 实验采用三电极系统:饱和甘汞电极为参比电极,酶电极为工作电极,铂丝为 对电极。选 电位区间记录图。当酶电极不使用时,将其 取.的为工作底液,在.~. 于?下贮存在.磷酸盐缓冲溶液上方。 .结果与讨论 ..实验条件的优化 ... 膜的稳定性 电沉积的时间会影响酶电极的性能:电沉积的时间短,酶电极的响应电流小,线性范围 较窄;电沉积的时间过长,膜厚度过大,会阻碍电子的传递,也会影响酶电极响应的各项性 能。实验结果表明,随着电沉积时间的增加,修饰电极的峰电流也随之增加,但是到 时, 峰电流开始下降,峰电位差变大,峰形也发生较大的变化如图..电沉积 时,峰电流 、 已增加很多,峰电位差较小,峰形和电沉积 比起来基本上没发生太大的变化。因此我 们选择 为最佳沉积时间。沉积底液的酸度在.~.范围内,随着值降低,膜的 稳定性会增加,但当值低于.时,膜变得不稳定,因此选择沉积底液的酸度为.~.。两南大学硕学何论文 第章基于普鲁士蓝和明胶修饰的过氧化氢生物传感器 电沉积到电极表面时,无机聚晶含有结晶水‘,只有把这些结晶水不可逆的去掉,电沉 积的膜才会很稳定。把电沉积之后的电极在?下恒温 ,可以把结晶水不可逆的移去, 得到修饰电极的稳定性较好。. .. .. .. : ;加;?;;?;. ? ... 对传感器响应电流的影响 .. 考察了传感器在.~.范围内对. 的响应如图.,由图.可 以看出传感器在.时响应电流最大,但是考虑到酶的活性和膜的长期稳定性,选择 .为工作底液的。 ...温度对传感器响应电流的影响 酶的活性与温度有着直接的关系:一般说来,随着温度的升高,酶催化反应的速率迅速增 大;但是温度过高会导致酶失活。由图.可以看出,?传感器的响应电流最大,这可能是 酶的活性和固酶介质共同作用的结果,但是考虑到操作的便捷性和传感器的寿命,选择室温 ?为工作底液温度。 仃 .. .. 心?恤 ;;. .: . .~.~. ..西南大学硕学位论文 第章基于普鲁士蓝和明胶修饰的过氧化氢生物传感器 ..传感器的电化学特性 ...层层修饰的电化学表征 图.为不同的修饰电极在.的中的图。从图中可以看出,裸铂电极在底 液中没出现明显的氧化还原峰图.曲线;当修饰上去之后,电极呈现的一对氧 化还原峰图.曲线;当已用修饰的电极再次被明胶、纳米金锄 和同时修饰时,虽然纳米金有利于电子的传输,但是由于大分子的酶以及明胶形成的空 间网状结构的影响,其产生的阻力远大于纳米金的传输动力,故氧化还原峰电流出现了明显的 降低图.曲线;当修饰电极被交联之后,膜中不仅有明胶分子内部的交联而且还有 明胶和酶、酶和酶之间的交联,阻碍了电子的传输,因此氧化还原峰电流进一步降低图. 曲线。图.曲线为修饰了的电极再被明胶和酶修饰,然后又用交联得到的 图,由曲线和曲线比较可以看出,峰电流下降很多,这可能是纳米金加入增加了电子传输 的能力。.... 旭 姻证 .? &.; . 行 : ;; .,, : ;,.?/, ?.,,; 仃. .刖.砌肿, . /,, . ~?胛, ?. . 图.为不同修饰电极在 由.的 配置而成的交流阻抗图。从图中可以看出,随着电极表面的层层修饰,阻抗也随之发 生变化,并且半圆的直径约为电子传递的阻抗。图.中是裸电极的交流阻抗图,曲线近似 为一条直线,说明电子传输到电极表面受扩散控制:当电极被修饰之后,曲线也近似一条 直线,并且直线的斜率更大,说明修饰上之后更有利于电子的传输图.曲线;当修 饰的电极再次被复合酶层修饰时,产生了较高的阻抗,表明复合酶层阻碍了‘到电极 表面的电子传递图.曲线;当用交联之后,产生了更高的阻抗,表明膜的机械强度 两南大学硕士学位论文 第章基于普鲁蓝和明胶修饰的过氧化氢生物传感器 的提高,进一步阻碍。到电极表面的电子传输图.曲线。图.曲线为修饰了 的电极再被明胶和酶修饰,然后又用交联得到的图,由曲线和曲线比较可以 看出没有纳米金存在时产生的阻抗更大,这可能是纳米金存在有利于电子传输。 ...传感器的电化学响应及检测机理 图.为传感器在.的中对不同浓度的计时电流响应图。工作电位为. ,生物传感器对有很好的电催化活性。 图.为同一批次三支不同电极在优化条件下,连续加入时的计时电流曲线。曲线、 、分别为/觚.//、佃冲//、/锄// . 修饰电极对连续加入“ ?.的计时电流响应图,它们的响应时间和灵敏度分别 为: 和. 和.肛??~, 和.??.一, “??。~。当 酶不存在时,电极对也有催化作用图.曲线,因为也对存在催化作用。 当酶存在时,电极对有更灵敏更快速的响应图.曲线;当酶和纳米金共存时,传感 器对响应更加灵敏快速图.曲线,这可能是酶、纳米金、三者协同作用的结果。 由曲线和曲线、比较分析,的催化还原主要为酶催化还原底物的过程。 ?? “??.. .. 代始. 懿 ... . ?, . ; 毛. . 蕾... . ? ;矗.;当该生物传感器在.的中循环伏安扫描时,随着扫速的增加,氧化还 原峰电 流也增加,且氧化还原峰电流值与扫速的平方根成正比尼,表现为扩散电流 特征。 西南大学硕学位论文 第章基于普鲁士蓝和明胶修饰的过氧化氢生物传感器 ..酶电极的性能测试 ...酶电极的线性范围、检出限及稳定性 通过实验酶电极测试的优化条件为. ?的磷酸盐缓冲溶液.,实验温度为 室温?,工作电位为. 。在此优化条件下,测得在.×西~.×刁?的 浓度范围内,传感器的响应电流与浓度成线性关系闻.;图.插图,当 ?.