血管紧张素转化酶基因插入缺失多态与新生儿危重症和胰岛素敏感

血管紧张素转化酶基因插入缺失多态与新生儿危重症和胰岛素敏感 北京大学 博士学位血管紧张素转化酶基因插入/缺失多态性与新生儿危重症和 胰岛 素敏感性关系的研究 姓名:韩彤妍 申请学位级别:博士 专业:儿科学 指导 教师:叶鸿瑁 20050501 北京大学博士论文 血管紧张素转化酶基因插入/缺失多态 性与 新生儿危重症和胰岛素敏感性关系的研究 北京大学第三医院儿科 研究生 韩 彤妍 导 师 叶鸿瑁 教授 副导师 王新利 副研究员 中文摘要 血管紧张素转化酶 (angiotensin converting enzyme，ACE)基因插入/缺失insertion/deletion，I/D多态性 引起的肾素,血管紧张素系统(renin angiotensinsystem，RAS)活性差异，与人类 健康和疾病的有着广泛的联系。本课题通过检测 ACE 基因 I/D 多态性，其与 新生儿危重症和新生儿胰岛素敏感性的关系。课题分两部分进行。 第一部分研究 ACE基因I/D多态性与新生儿危重症的关系。按新生儿危重病例评分标准将入NICU 的新生儿于入院第1d分为非危重病组(237例)、危重病组(98例)，同时设正常对 照新生儿116例。提取DNA后进行基因分型并检测血清ACE水平。危重病组DD基因 型比正常对照组和非危重病组多，DD基因型患儿入院第1d的危重病评分较低，DD 基因型需要呼吸机辅助治疗的病例较多，出现代谢性酸中毒和低血钠、低血糖的例 数也较多，而罹患新生儿湿肺、新生儿呼吸窘迫综合征和早产儿动脉导管未闭的病 例也较多。DD基因型的血清ACE水平显著升高，而且血清ACE水平与入院第1d的危 重病评分呈显著负相关。以上结果明ACE基因/缺失多态性与新生儿危重症有相关 性，DD基因型患儿有相对高的血清ACE水平，表现为病情相对重，心肺功能适应性 相对差。 第二部分研究202例新生儿ACE基因I/D多态性与胰岛素敏感性的关系。用 3 北京大学博士论文HOMA指数来评价胰岛素敏感性，小于胎龄儿胰岛素敏感性比 适于胎龄儿胰岛素敏感性相对差，DD基因型的HOMA指数相对高，提示DD基因型 比II和ID基因型的胰岛素敏感性相对差。在孕周无差异的情况下，DD基因型出生体 重最轻，II基因型出生体重最重，ID居中。说明ACE基因型与低出生体重、成人胰 岛素抵抗和代谢综合征有关。关键词 ACE基因I/D多态性，新生儿危重症，血清ACE 水平，胰岛素敏感性 4 北京大学博士论文Relationships between angiotensin converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism and illness severity and insulin sensitivity of neonates MD. Candidate: Han Tongyan Tutor: Professor Ye Hongmao Associate Tutor: Associate Professor Wan Xinli ABSTRACT Recent studies indicate that the angiotensin converting enzymeACE gene insertion/deletion I/D polymorphism influencerenin–angiotensin system RAS activity and thus may have an impacton the health status and disease processes. We investigated whether theillness severity and insulin sensitivity of neonates were influenced bythe ACE genotype. The study was divided into two parts. In the first part the relationship between ACE gene polymorphismand illness severity of neonates was studied. According to the NeonatalCritical Score draft the neonates admitted to NICU were divided intonon-critical group n237 and critical group n98 and a normalcontrol group n116. DD genotype frequency was increased in thecritical group compared with the non-critical group and normal controlgroup and was significantly associated with lower critical score. MoreDD subjects needed mechanical ventilation support and the incidencerates of metabolic acidosis hypoglycemia and hyponatremia were alsohigher in DD group. More DD subjects developed neonatal respiratory 5 北京大学博士论文distress syndrome NRDS and wet lung syndrome. The incidence rateof patent ductus arteriosus PDA was higher in preterm with DDgenotype. The ACE activity was higher in carriers of the DD genotype.And a negative correlation was observed between ACE activity and thecritical scores. Thus ACE gene I/D polymorphism associated withincreased illness severity of neonates. The DD genotype encodinghigher ACE activity may adversely influence the illness severity ofneonates. In the second part the relationship between ACE genepolymorphism and insulin sensitivity was studied in 202 neonates. Thehomeostasis model assessment HOMA was used to estimate insulinsensitivity. The neonates who were small for gestational age hadrelatively impaired insulin sensitivity compared with the neonates whowere appropriate for gestational age. The DD carriers with higherHOMA had a relatively impaired insulin sensitivity compared with IDand II. As to the birth weight the DD carriers were the lightest and theII carriers were the heaviest. This may explain the association of DDgenotype and insulin resistance and metabolic syndrome in adults.【Key words】 ACE gene I/D polymorphism Neonatal critical casePlasma ACE activity Insulin sensitivity 6 北京大学博士论文 中英文缩略词对照 ACE angiotensin converting enzyme 血管紧张素转化酶I/D Insertion/deletion 插入/缺 失RAS renin angiotensin system 肾素,血管紧张素系统AGT angiotensinogen 血管紧 张素原Ang? angiotensin ? 血管紧张素?Ang? angiotensin? 血管紧张素? SRAS systemic renin angiotensin system 循环肾素-血管紧张素系统LRAS local renin angiotensin system 局部肾素,血管紧张素系统BK bradykinin 缓激肽ARDS acute respiratory distress syndrome 急性呼吸窘迫综合征NRDS neonatal respiratory distress syndrome 新生儿呼吸窘迫综合征BPD bronchopulmonary dysplasia 支气管肺发育不 良NICU neonatal intensive care unit 新生儿重症监护病房NO nitrous oxide 一氧化氮 AVP arginine vasopressin 精氨酸加压素ACTH adrenocorticotropic hormone 促肾上 腺皮质激素PGE2 prostaglandin E2 前列腺素 E2PDA patent ductus arteriosus 动脉导 管未闭IR insulin resistance 胰岛素抵抗IUGR intrauterine growth retardation 宫内发 育迟缓ACEI angiotensin converting enzyme inhibitor 血管紧张素转化酶抑制剂SGA small for gestational age 小于胎龄儿 7 北京大学博士论文AGA appropriate for gestational age 适于胎龄儿PICU pediatric intensive care unit 儿童重症监护病房 HOMA homeostasis model assessment equation 内稳态模式评估公式PI ponderal index 出生体格指数IGF insulin-like growth factors 胰岛素样生长因子 8 北京大学博士论 文文献综述 血管紧张素转化酶基因插入/缺失多态性与 新生儿危重症和胰岛素敏 感性的关系 血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)基因插入/ 缺失insertion/deletion，I/D多态性引起的肾素,血管紧张素系统(renin angiotensinsystem，RAS)活性差异，与成人期疾病关系的研究已经进行了十余年。 ACE基因I/D多态性与扩张性心肌病 1 、冠心病 2 3、原发性高血压 4、高血压性 左室肥厚 5、糖尿病 6 7 、肾脏疾病 8、结节病 9 10、哮喘 11和铍中毒 12等多种 疾病关系的探讨，提示我们RAS、ACE基因I/D多态性与人类健康和疾病存在广泛联 系，推动我们开展其与新生儿疾病关系的研究。1、 RAS、ACE 基因与 ACE RAS 的主要成份包括血管紧张素原(angiotensinogen，AGT) 肾素 、 (renin)、ACE、 血管紧张素?angiotensin ?，Ang?、血管紧张素?(angiotensin?，Ang?)及其 各型受体。除了循环RAS(systemic RAS，SRAS)在机体心血管系统、水电解质平 衡以及内环境自稳态调节中发挥作用 13，研究证实在心脏 14、肺 15、脑 16、肾 17 、眼睛 18 、血管 19 、骨骼肌 20 、T淋巴细胞和白细胞 21 等多器官和组织 存在局部RAS(local RAS，LRAS) 22-25，其中各成分的产生不依赖于循环前体物质，这些物质通过自分泌、旁分泌和胞内分泌 26作用影响局部组织的生长 27、代谢 28、炎性反应 29及其他生理过程。 ACE基因位于17号染色体长臂2区3带 ， (17q23) 属于单拷贝基因，长21kb，由26个外显子和25个内含子组成 30。在ACE基因存在多个变异位点，近年来倍受瞩目的是位于ACE 基因16内含子长度为287bp的Alu序列的插入(insertion， 9 北京大学博士论文I)或缺失(deletion，D) 31 。因为16内含子起始部位14bp的核苷酸序列与末端的14bp序列相同，这种重复序列的结构可能是产生ACE基因缺失型的起源，即在细胞减数分裂时，后边14bp的重复序列取代了前一序列，造成其中的287bp序列排除在外的缺失结构 32，使ACE基因呈现插入/缺失(I/D)的限制性片断长度多态现象，即存在I和D两种等位基因以及三种基因型:DD 纯合子、ID杂合子和II纯合子，遗传方式为常染色体显性遗传 31。不同种族间等位基因频率和基因型频率都有差异，高加索人D等位基因频率是50.033 ，非洲美国人为60.434 ，亚洲人是39.035 ;DD基因型频率在高加索人是35.033 ，亚洲人是20.035。 ACE是一种含锌的金属肽酶，系统名称为肽基-二肽水解酶EC，3-4-15-136 。其分子量为150,180 KD，由1306个氨基酸组成 37，含2个结构相似的功能区。ACE是RAS的关键酶，不仅可以使十肽的Ang?脱去组氨酰亮氨酸，生成强大的、作为血管加压物质的八肽Ang?，直接引起血管收缩和间接刺激醛固酮的释放从而引起水钠贮留 38，还可以同时水解缓激肽(bradykinin，BK)羧基末端的苯丙氨酰精氨酸，使之失去舒血管作用，因此具有另一个名字—激肽酶?(kininase ?)20。ACE 在机体的血压、水电解质稳态方面的调节起着重要的作用 4;能使参与炎性作用的BK、P物质等多肽性物质灭活 3940，因此ACE是RAS以及激肽-缓激肽系统的重要调节因素，影响人体多种生理机能。2、ACE 基因 I/D 多态性与 ACE 个体间RAS活化程度差异与ACE基因I/D多态性有关，ACE基因型影响ACE的浓度和生物活性 41。1990年Rigat等研究80例高加索人种健康个体的ACE基因I/D多态性和血清ACE水平，证实ACE浓度与基因多态性存在密切联系:ACE 10 北京大学博士论文水平变化受ACE基因的调控 33 ，DD、ID和II三种基因型携带者的血清ACE水平分别为493、393和299μg/L(Plt0.01);不同基因型使高加索人种血清ACE水平产生个体间差异达43,473342 ;对正常人群的研究发现，在心脏和白细胞，DD基因型个体与II基因型个体相比，组织ACE浓度增高达751421 。 ACE基因如何调控ACE水平,Rigat等认为与转录有关 33 。ACE基因第16内含子中Alu的重复序列插入(I等位基因)降低ACE基因转录速率，使ACE合成减少，因而降低RAS的活性。Ukkola等认为I等位基因是增强子的抑制物，它影响其他基因位点使产物蛋白构象改变，从而使酶活性减弱 4344 。而Keavney等认为I/D多态性只是出现在ACE基因的一个内含子上，一般内含子并不直接影响基因编码的蛋白质的性质，因此，这一多态性可能是其它具有重要功能的基因位点的标记 45。Rieder等提出该基因多态性可能与一个上调ACE表达量的(S等位)基因存在紧密连锁不平衡 46。3、ACE 基因 I/D 多态性与肺损伤 越来越多的证据支持 RAS 活化在肺损伤时起作用 47。肺循环是 RAS 活化的重要靶器官，肺局部 RAS 活化通过影响血管渗透性 48、血管张力 49、成纤维细胞活性 50和缩短肺泡上皮细胞生存时间 51以及其它组织(如骨骼肌、心肌或血管壁)的局部 RAS 的作用 52，调节系统炎性反应、组织低氧反应和代谢底物的利用 53。 动物实验结果表明，肺内小动脉平滑肌中有 ACE 基因 的表达，并检测到ACE 的活性 54。低氧 6 小时后 ACE 基因表达的变化并不明显，但随后的 12、24、48 小时明显增加，并呈时间依赖性;在低氧 24 小时后肺内小动脉平滑肌中 ACE 活性较低氧前显著增加。研究提示低氧可促使肺内小动脉平滑肌中的 11 北京大学博士论文ACE 基因表达增加 54，使 ACE 的合成增加、ACE 活性上升，当然低氧也可能使 ACE 分子结构发生变化而引起活性增加，Ang?的生成随即增加，通过相应的受体介导使肺内小动脉平滑肌增殖、肥大，引起或促进低氧性肺动脉高压的形成及发展。 Marshall 等 首 次 对 ACE 基 因 型 和 成 人 急 性 呼 吸 窘 迫 综 合 征 ( acuterespiratory distress syndrome，ARDS)发生、发展的关系进行了研究 29。他们将 96 例诊断为 ARDS 的病人设为实验组，另设 3 组对照:88 例发生呼吸衰竭(非 ARDS)的病人，174 例行冠状动脉分流成形术的病人和 1906 例健康人。ARDS 组病人携带 DD 基因型频率明显高于三个对照组;D 等位基因与 ARDS组增高的病死率有关:II 是 1/9(11.1)，ID 是 12/43 (27.9)，DD 是 24/44(54.5)(Plt0.02)。上述 D 等位基因和 ARDS 之间的关系提示 ARDS 初始阶段 RAS 活化的作用，研究者因此提出 ACE 基因型的研究将可以预测低氧肺损伤的疾病进展及转归。 研究发现在 ARDS 时，肺泡灌洗液的 ACE 活性升高而循环 ACE 活性降低 56 ，这一局部 ACE 活性的增高可能通过影响血管通透性、内皮细胞生存时间和纤维母细胞活性而影响急性肺损伤的病程 57。 新生儿呼吸窘迫综合征(neonatal respiratory distress syndrome，NRDS)和支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)都是新生儿的肺损伤性疾病 58。在 NRDS 急性期，肺血管阻力增加、肺内出现右向左血液分流和显著的低氧血症，发生与 ARDS 相似的病理生理变化。BPD 是常发生于早产儿呼吸机治疗后的慢性肺损伤 59。BPD 的发生以急性炎性介质浸润、不同程度的肺组织纤维化和肺泡实变为特征，这些病理变化最终导致早产肺发育受损 59。因为研究证实在炎症和 RAS 活化之间、肺纤维化和 ARDS 结局之间 12 北京大学博士论文存在联系 29，据此推断，ACE 基因 I/D 多态性与新生儿肺损伤之间可能存在联系。 英国的 Harding 等对 148 例新生儿重症监护病房(neonatal intensive careunit，NICU)中孕周 29,32 周、体重 1356,1761g 的危重早产儿进行生后早期心肺血管适应性的研究 60。他们将 ID 和 II 基因型患儿合并为 IDII 组，与DD 基因型患儿组进行比较。研究发现 DD 基因型的患儿需要较高的吸入气氧浓度(最高吸入气氧浓度 DD 为 39、II，ID 为 0.21，P 0.039;最低吸入气氧浓度 DD 为 27、II，ID 为 21，P 0.046;DD 基因型患儿碱剩余的负值明显增加(DD 为-5.0，ID，II 为 0 ，P 0.024);而且为了维持血压在正常范围，DD 基因型的患儿更多的需要血管活性药物(P 0.037。他们因此提出 DD 基因型的早产儿与另外两种基因型早产儿相比心肺功能适应性较差。 美国 Yanamandra 等研究平均孕周 26.4?0.1 周、平均出生体重 869?12g、经呼吸机治疗的 245 例早产儿，分析 ACE 基因 I/D 多态性与 BPD 发病率之间的关系 61 。在研究中，所有的患儿生后都需要呼吸机辅助呼吸，228/245 例93患儿经外源性肺表面活性物质治疗，其中 DD 基因型 88/245 例(35.9)，ID 基因型 107/245 例(43.7)，II 基因型 50/245 例(20.4)。这些早产儿被分为生后 28d 和 36 孕周时的氧依赖和非氧依赖组、达 36 孕周前死亡组和非死亡组。研究发现，ACE 基因 I/D 多态性对 BPD 的发病率(生后 28d 或 36周校正孕周时的氧气依赖)或病死率都没有影响。出现这一无相关性结果的原因，一方面可能是 因为对于 BPD 发病率来说，基因因素的影响远不及成熟度的影响大;另一方面，可能是由于人种的差异(研究中多数是美洲人种，高加索人种很少，而已有的研究证实美洲人种 ACE 基因 I/D 多态性与 ACE 水 13 北京大学博士论文平之间没有相关性)。4、ACE 基因 I/D 多态性与心血管疾病 数年来，研究者们发现RAS在循环系统内稳态上起重要作用，因此ACE基因I/D多态性在很多成人研究中被称为―心血管疾病的候选基因‖。成人疾病的研究发现DD基因型病人的血管平滑肌张力较其他两种基因型携带者高，对一氧化氮(nitrous oxide，NO)的血管舒张作用反应迟钝 62。D等位基因携带者循环ACE水平的增加，促进脑垂体分泌精氨酸加压素(arginine vasopressin ，AVP)和促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)，兴奋交感神经释放去甲肾上腺素，收缩血管;血管局部ACE水平增加，引起局部Ang?活性增加，其活性增加不仅使BK失活，NO生成减少，血管收缩;而且可以增加NADH/NADPH氧化酶活性而提高超氧化物水平，并因此降低NO生物活性63 ;另外，虽然Ang?在血液循环中的半衰期仅为数分钟，其能促使血管内皮细胞分泌作用更强而持久的内皮素-1而继续发挥缩血管作用。 新生儿出生后肺呼吸建立，PaO2急剧升高，刺激细胞膜去极化，导致血管平滑肌细胞内游离钙离子浓度升高和内皮素-1生成增加;与此同时，反应性氧代谢产物促使血管中层平滑肌和外膜产生、释放前列腺素E2(prostaglandin E2 ，PGE2)，动脉导管产生NO样血管舒张因子 64。随着PGE2生成减少和破坏增加，血栓素大量进入动脉导管，管壁肌肉强烈收缩，动脉导管关闭。早产儿对氧刺激关闭动脉导管的敏感性低，对PGE2 和NO松弛动脉导管的敏感性高，而且早产儿动脉导管平滑肌的收缩能力较足月儿差，易于发生动脉导管未闭(patentductus arteriosus，PDA) 64。 但是，有研究提出动脉导管是否关闭不仅取决于血液中血管舒张与收缩因 .