【doc】流动注射化学发光分析法测定人血清中白蛋白的研究

【doc】流动注射化学发光分析法测定人血清中白蛋白的研究 流动注射化学发光分析法测定人血清中白 蛋白的研究 第22卷第4期分析科学 Vo1.22No.4JOURNALOFANALYTICALSCIENCE 2006年8月 Aug.2006 文章编号:1006-6144(2006)04—0414—04 流动注射化学发光分析法测定人血清 中白蛋白的研究 李江华,胡涌刚,庞志涛 (华中科技大学环境科学与工程学院,武汉430074) 摘要:本文对人血清中白蛋白的鲁米诺一K.Fe(cN).化学发光反应体系进行了较系统 的研究.考察了流速,发光试剂浓度,PH值以及增敏剂等对人血清白蛋白分析检测的 影响.在优化的实验条件下,测定人血清中白蛋白的线性范围为1.2×10,4.4× 10一mol/L,R一0.9942;的检出限(s/N一3)为1.2×10mol/L;回收率范围为 90.75,103.5,本法对2.9×10mol/L的样品平行重复12次测定, 其相对 标准偏差为3.5. 关键词:化学发光;人血清白蛋白;流动注射 中图分类号:o657.63文献标识码:A 1前言 人血清白蛋白(HsA)在人血浆中含量极其丰富,成年人每升血液中含40g左右,其功能主要起维持 血液的正常渗透压和运送亲水分子的作用,在临床上作为血浆容量扩充剂广泛应用于大出血,休克,烧伤, 癌症,红白细胞增多,白蛋白过少等症[1].人血清白蛋白的测定是生物化学和临床检验中的重要内容.测 定人血清白蛋白的常规方法是光度法口],但亦有荧光法_3及极谱法的报道. 化学发光分析法(cL)以其灵敏度高,仪器设备简单,操作方便等特点,广泛应用于环境化学,临床检验, 药物分析和工业分析等领域.流动注射一化学发光法(FI-CL)已广泛用于金属离子],氨基酸和药物分 析[7],但用于蛋白质分析的报道却相当有限.黄春保等口._提出了反相流动注射一化学发光测定牛血清白蛋 白,牛血红蛋白和人血清白蛋白的方法,并讨论了蛋白质标记物化学发光增强作用的原因;李永新等…建立 了一种灵敏度较高的测定蛋白质的猝灭化学发光方法,并应用于人 血清样品中总蛋白的测定;Huang等将 微孔分析盘技术和FI技术相结合,测定了标记链霉素的牛血清白蛋白_;根据蛋白质一铜络合物的性质;Tong 等u副开发了1,10一phenanthroline-HzO2一CTMAB-Cu体系,并用于鲁米诺化学发光检测BSA,HAS和7-glob— ulin等.作者在实验过程中发现,HAS可有效催化Luminol—K3Fe(CN).反应,产生很强的发光信号,基于这一 现象,本文建立了一种灵敏度高,准确度好的化学发光测定人血清中白蛋白的新方法. 2实验部分 2.1仪器与试剂 自行组装的流动注射化学发光仪(FI—CL),包括:IFIS—C型智能流动注射进样器和CL流通池(西安瑞 迈电子科技有限公司);R一212型光电倍增管(北京滨松公司);ND-802型直流前置放大器(南京大学微弱 信号检测中心);色谱工作站(上海千谱有限公司);818型酸度计(美国,奥立龙公司). 收稿日期:2005—07—07修回日期:2005—11-07 基金项目:国家自然科学基金(No.20005005) 通讯联系人:胡涌刚,男,博士,副教授,主要从事环境分析化学研究 414 第4期分析科学第22卷 人血清白蛋白(HSA),亮氨酸(Leu),丙氨酸(Ala),精氨酸(Arg),苯丙氨酸(Phe),组氨酸(His),天 冬酰胺(Asn),赖氨酸(Lys)和谷氨酸(Gln)(美国,Sigma公司).人血清白蛋白(HSA)和所有氨基酸标准 溶液均为水溶液;鲁米诺储备液:2.0×10mol/Ll铁氰化钾储备液:0.05mol/L~NaOH溶液:1.0tool/ L;十六烷基三甲基溴化胺(CTMAB)溶液:1.0×10一mol/L~十二烷基硫酸钠(SDS)溶液:5.0×10 mo1/L;KBr溶液:2.5mol/L;聚乙二醇辛基苯基醚(OP)溶液:2.0×10mol/L;~J精(cD)溶液: 鲁米诺,铁氰化钾的流速为4.0mI/min,载流和样品的流速.:.o, f v HS — A v一.. 为5.0mI/rain时,信噪比最高,峰形好.mL/min;……一5.0×10一不.ol儿_I】mI 3?2?2鲁米诺浓度的选择实验结果明:在5?0X10,=一 3 1 . 2 0 . X 2 10-5mo — l/ 1 L .. sa × m 1 p . le 一 p ; 2~me : diu 2 m .9 p × H 5.0×10mol/L范围内时,相对发光强度随着鲁米诺浓度10一e.l儿. 的增大而发生变化,当鲁米诺浓度超过3.0×10mol/L时, 相对发光强度降低.选择鲁米诺的浓度为3.0×10一mol/L. 3.2.3铁氰化钾浓度的选择考察了铁氰化钾浓度对该化学发光反应相对发光强度的影响.结果表明, 相对发光强度在一定浓度范围内随铁氰化钾浓度的升高而增大,并且在铁氰化钾浓度增大到5.0×10 mol/L时达到最大;但是,随着铁氰化钾浓度的继续增大,该反应的相对发光强度反而降低.因此,选择的 铁氰化钾浓度为5.0×10,mol/L. 3.2.4体系pH值的影响改变铁氰化钾与鲁米诺溶液的pH值,并考察其对化学发光反应的影响,结 果见图3.实验表明,当体系的pH一12.2时,发光强度达到最大值. 3.2.5试样pH值的选择样品的pH值在一定的范围内对化学发光反应有影响,在pH9.0,12.5范 围内,化学发光信号随着HSA溶液的pH值升高而变化,当样品的pH达到12.2时,化学发光信号强度 最大而后急剧下降. 3.2.6增敏剂的选择据文献[143报道表明,某些表面活性剂及有机溶剂在一定程度上能对发光起到增 敏作用.本实验分别考察了OP,SDS,CTMAB,EDTA,KBr和CD三氯甲烷,乙醇,甲醇,乙腈等物质对 415 第4期李江华等:流动注射化学发光分析法测定人血清中白蛋白的研究第22卷 Luminol,K3Fe(CN)一HSA发光反应的影响.实验结果表明:OP的加入将会使该反应的发光信号降低; KBr和p-CD能明显增强Luminol—K3Fe(CN)发光信号,但对Luminol—K.Fe(CN)一HSA反应无协同增强 作用;SDS,三氯甲烷,乙醇,甲醇,乙腈等均未显示出明显的协同催化效果.如图4所示,CTMAB对该体 系的发光具有明显协同催化作用,Luminol—K3Fe(CN)一HSA体系的发光信号在一定浓度范围内随着试样 中CTMAB的浓度增加而增大,而当试样中的CTMAB浓度为1.0×10mol/I时达到最大值.EDTA 增敏效果不如CTMAB,故本文选择的增敏剂为CTMAB. > E \ .g — U 0 三 pH Fig.3TheeffectofpHofthemediumsolution onrelativechemiluminescenceintensity Flowrate:V一V一VI—V.一3,0ml/min,Cl…n.1— 3,0×10.mol,f?…iieid一5.0×10—mol/L, CcqMAB=2.0×10mol/L;SamplePH一12,2;Medi umpH=12.2;CHSA一7.4×10mol/L. > g \ ‘ .量 一 U ? ,兰 ConcentrationofCTMAB(×10)/mol,L Fig.4TheeffectoftheconcentrationofCT MABonrelativechemuliminescenceintensity CHSA一2.9×10一mol/L,otherconditionsasinFig,3. 3.3共存物质的影响 在选定的实验条件下,考察了多种物质共存时对浓度为3.6×10.mol/mLHSA发光强度的影响. 试验结果表明:5O倍的亮氨酸(Leu)无干扰;500倍的丙氨酸(Ala),精氨酸(Arg),苯丙氨酸(Phe),组氨酸 (His),天冬酰胺(Asn),赖氨酸(Lys)和谷氨酸(Gin)无干扰;1000倍的EDTA,甲醇,乙醇,SO;,NO;, F,100倍的CHC1.,乙腈,Na,K,Ca抖,Zn,A1”,Fe”,Mg不产生干扰.Br严重干扰;1倍的 co,Ni抖,1O倍的Cu抖,Pb抖,Cr等金属离子对HSA的发光强度有影响,加入100倍的EDTA后可 消除干扰. 3.4线性范围,检出限与精密度 在最佳条件下,HSA浓度在1.2×10,4.4×10mol/L范围内与发光强度呈良好的线性关系, 回归方程为:一4×100x+371.01(R一0.9942);检出限(S/N一3)为1.2×10mol/I;对2.9×10—8 mol/I的标准样品平行12次测定,其相对标准偏差(RSD)为3.5. 3.5实际样品分析 将离心后的人血液中的血清稀释1000倍,然后按实验方法进行分析,并将测定结果与常用的双缩脲 分光光度法进行比较,同时进行回收率实验.结果一并列于表1中. Table1ResultforthedeterminationofHSAininjectionandrecoveryofthemet hod sampIeNo-.眦gFoug 1 2 3 83.29 80.32 83.48 80.81 82.19 83.O9 2O.OO 2O.OO 2O.OO 2O.61 18.33 18.15 1O3.O5 9l_65 9O.75 3.6测定HSA的不同方法的比较 表2是不同方法测定HSA的线性范围和检出限的比较.可以看出:(1)本文的测定方法较分光光度 法,极谱法的线性范围宽2,3个数量级;与现有的其它测定HSA的化学发光方法相比较,本方法线性范 围宽1,2个数量级;(2)检出限低;(3)本法无需进行衍生,反应体系和实验步骤更加简单. 416 第4期分析科学第22卷 Table2ComparisonoftheresultsaboutHSAdeterminationwithdifferentmet hods ThemolecularweightofHASis68000g/too1. 参考文献: [1]ZHAOYing—yi(赵颖怡),WANGRong(汪嵘),WEIYu—tuo(韦宇 拓),DONGYan(董燕),GANFeng-qiong(甘凤 琼).JournatofGuangxiAgric.andBlot.Science(广西农业生物科 学)[J],2002,21(2):126. [2]GAOJian-hua(高建华),LIHua-cen(李华 岑).JournalofZhengzhouUniversity(郑州大学(理学版))[J],2003,35(3):64. [3]WEIQin(魏琴),DUBin(杜斌),wuDan(吴丹),OUQing—yu(欧庆 瑜).ChineseJournalofAnalyticalChem— isty(分析化学)I-J],2004,32(3):370. [4]SongJun-feng,HePing,GuoWei.AnalyticalBiochemistryl,J],2002,304 (2):212. 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Keywords:Chemuliminescence;HumanSerumAlbumin(HSA);Flowinjectionanalysis 417