高效液相色谱法测定天黄猴枣散中胆红素的含量

高效液相色谱法测定天黄猴枣散中胆红素的含量 中国论文榜--------论文发论文榜第一的专业职称论文发表网 高效液相色谱法测定天黄猴枣散中胆红素的含量 丘明明等 【摘要】目的:建立天黄猴枣散中胆红素HPLC含量测定方法。方法:采用CAPCELLPAK C18色谱柱(250mm×46mm，5μm)，以乙腈-甲醇-01%磷酸溶液(用三乙胺调节pH值至60)(13?50?37)为流动相，检测波长451nm。结果:胆红素在001931,19309μg范围内呈良好的线性关系;回收率为1003% ，RSD=25%(n=9)。结论:本法专属性强，简便快速，精密度良好。 【关键词】胆红素;含量测定;HPLC;天黄猴枣散 天黄猴枣散具有清心，豁痰，开窍，凉肝，息风，解毒的功效。临床常用于热病神昏，中风痰迷，惊厥抽搐，癫痫发狂，咽喉肿痛，口舌生疮，痈肿疔疮。处方中体外培育牛黄为的君药，而胆红素为体外培育牛黄主要有效成分之一。据文献报道[1]，胆红素是一个直链四吡咯化合物，在人体内是血红素的代谢(分解)产物。药理研究表明，胆红素有解热、降压、抗病毒、抗衰老、抗癌和促进红血球新生的作用。选择胆红素作为含量测定指标，可反映和控制天黄猴枣散的内在质量。研究采用高效液相色谱法测定天黄猴枣散中胆红素的含量。 1仪器与材料 11仪器美国Agilent高效液相色谱仪(含DAD检测器、Chemstations色谱工作站);MILLI-PROA纯水处理器。 12材料胆红素对照品(批号:100077-200503，中国药品生物制品检定所。经归一化法 ?α、 ?α三个异构体峰面积之和计算，为9772%)。 天检查，纯度以胆红素X ?α、 黄猴枣散为广西梧州制药(集团)股份有限公司和广州敬修堂(药业)股份有限公司提供。阴性样品为广西梧州制药(集团)股份有限公司提供。乙腈、甲醇为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯。 2方法与结果 21色谱条件色谱柱:CAPCELLPAK C18柱(250mm×46 mm，5μm);流动相:乙腈-甲醇-01%磷酸溶液(用三乙胺调节pH值至60)(13?50?37);检测波长:451nm;柱温30?;流速10 ml/min;进样量:5μl。在此色谱条件下，并参考相关文献[2]，胆红素三个异构体出峰顺序为X ?α、?α、 ?α，三个异构体之间能完全分离，且与其他杂质峰有很好的分离。对照品及样品色谱图见图1。 22对照品溶液的制备取胆红素对照品，精密称定，加二甲基亚砜制成每1ml含20μg的溶液，即得。 23供试品溶液的制备取本品适量，混匀，取约50mg，精密称定，置棕色具塞锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率400W，频率40KHz)30min，放冷，再称定重量，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。 24线性关系考察精密称取胆红素对照品988mg，置25ml棕色量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取对照品取贮备液05、05ml，分别置50、20ml棕色量瓶中，再精密量取对照品取贮备液05、10、15、20、30、50、10ml，分别置10ml棕色量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀得曲线溶液。取5μl上述对照品溶液按“21”项下色谱条件测定。以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归，得回归方程Y=62204×103X-58761，r=10000。表明胆红素在001931,19309μg范围内线性关系良好。 25精密度试验取同一供试液，在“21”项色谱条件下连续测定6次，记录各峰面积，计算RSD，结果6次测定胆红素平均峰面积RSD=06%，表明仪器精密度良好。 中国论文榜--------论文发表论文榜第一的专业职称论文发表网 中国论文榜--------论文发表论文榜第一的专业职称论文发表网 26重复性试验取同一批样品6份，按“23”项下的方法制备，按“21”项下的色谱条件测定。结果 6份样品测得胆红素含量的平均值为119323mg/g，RSD=11%，结果表明本法的重复性较好。 27稳定性试验取同一供试液，按“21”项色谱条件分别在0、2、5、7、9、13、18、22、27h测定。结果供试品溶液在9h内峰面积RSD=28%，13 h后峰面积RSD=42%，27 h后峰面积RSD=54%，表明应在9小时内完成胆红素的测定。 28加样回收率试验 281加样用对照品溶液的制备精密称取胆红素对照品1060mg，置25ml量瓶中，加二甲基亚砜使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为胆红素对照品储备液;精密量取对照品储备液15、30、50ml，分别置A、B、C三个100ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，即得282加样回收试验精密称取已知含量的天黄猴枣散25mg，共9份，1,3份分别精密加入“281”项下对照品混合溶液A 25ml，4,6份分别精密加入对照品混合溶液B 25ml，7,9分别精密加入对照品混合溶液C 25ml，按“23”项下的方法提取，即得。精密吸取5μl注入液相色谱仪，测定含量，计算回收率，结果见表1。 29干扰实验取阴性样品，按“23”项下供试品溶液的制备方法制备，测定，结果阴性样品在胆红素峰相应的保留时间处无干扰峰，表明处方中成分对测定无影响。 210样品测定对2个不同生产单位的10批样品进行胆红素含量测定，结果含量在95,116mg/g之间。 3讨论 31测定成分的选择参考文献[3]，体外培育牛黄在制备过程中，受生产工艺、酸、碱、光、热及贮存条件等因素影响，双吡咯环产生异构化，即X ?α、?α、 ?α。胆红素?α是天然产物的原型物，故以异构体的总量来控制本品中胆红素的含量，较为合理。 32流动相的选择参考《中国药典》和文献[2]，HPLC法测定胆红素的流动相有三氯甲烷-甲醇-二乙胺(80?19?1)、甲醇-三氯甲烷-1%磷酸溶液(80?14?6)、乙腈-二甲基亚砜-pH47的1%醋酸铵(40?60?55)等，考虑到本实验系反相色谱，三氯甲烷和二甲基亚砜对色谱柱伤害较大，经摸索，最后确定用本文列出的流动相，得到的色谱峰形对称，分离度好。 33提取溶剂的考察天黄猴枣散处方中为体外培育牛黄，其胆红素为游离型胆红素，由6个分子内氢键形成，为不溶于水的脂溶性化合物，故对二甲基亚砜、三氯甲烷、三氯甲烷-1%盐酸甲醇溶液(5?1)、二甲基亚砜-乙腈(7?3)、EDTA-二氯甲烷(1?10)等提取溶剂进行考察，结果以二甲基亚砜为溶剂提取效果最好，见表2。 34提取方法的考察实验曾对静置过夜、超声处理和加热回流等3种样品溶液的制备方法进行比较，结果加热回流得到的供试品，未能检测到胆红素，表明加热后胆红素被破坏，不宜加热提取;而超声处理的含量明显高于静置过夜的样品含量。 35胆红素异构体在空气中尤其在光照下极易被氧化，因此整个操作因避光进行。稳定性实验结果进一步表明，含量测定操作方法以快速为佳。 参考文献 [1] 黄泰康.常用中药成分与药理手册[M].北京:中国医药科技出版社，1994:557. [2] 尹华，吴健敏，梁文藻.胆红素异构体相对含量的RP-HPLC测定[J].药物分析杂志，1992，12(6):338-339. [3] Norbert Blanckacrt.Analysis of bilirubin and bilirubin mono and diconjugates[J]. Biochem J， 1980，18(5):115-128. 中国论文榜--------论文发表论文榜第一的专业职称论文发表网