肾透明细胞癌肿瘤相关基因的表达

肾透明细胞癌肿瘤相关基因的达 肾透明细胞癌肿瘤相关基因的表达 肾透明细胞癌肿瘤相关基因的表达 肖耀军,陈壮飞.郑少斌 (南方医科大学附属南方医院,广州510515) 山东医药2011年第5l卷第18期 摘要:目的观察肾透明细胞癌组织与癌旁正常肾组织的基因表达谱差异,探讨肾透明细胞癌的肿瘤相关基 因.方法采用ASilentHuman1B寡核苷酸基因芯片检测3例肾透明细胞癌患者的癌组织和1例肾透明细胞癌的 癌旁正常肾组织的基因表达谱.结果在检测的基因中,共筛选出差异表达基因204个,癌组织中共同上调基因 共同下调基因173个,包括6个尚未被Genebank收录的人类新基因.结论肾31个, 透明细胞癌的发生与染色体 基因的异常相关,异常基因有相对集中区域,如3p,14q和5q等. 关键词:肾肿瘤;肾透明细胞癌;基因表达谱;寡核苷酸;基因芯片 中圈分类号:R737.11文献标志码:B文章编号:1002-266X(2011)18-0068-02 肾透明细胞癌(ccRCC)是泌尿外科较常见的一 种恶性肿瘤.我们采用60—70mer的长链寡核苷 酸基因芯片,检测ccRCC组织和癌旁正常肾组织的 基因表达谱,分析其基因差异表达情况,探讨肾透明 细胞癌的肿瘤相关基因. 1资料与方法 1.1临床资料2006年2月,2007年3月本院收 治的ccRCC患者4例.3例肾癌标本于肾癌根治术 后0.5h内置于液氮罐冻存备用,l例正常肾组织标 本取自T1期肾癌距原发灶5cm以上的正常区域肾 组织.所有标本均经常规病理检查证实. 1.2方法 1.2.1RNA的提取,荧光标记及cDNA的合成 分别取上述各组织样品50—100mg,用Trizol提取 法提取总RNA,测定浓度并进行质量鉴定.用Low InputRNAFluorescentLinearAmplificationKit试剂 盒将提取合格的RNA进行双色荧光标记.4个标本 各取总RNA2g,按照常规逆转录方法合成cDNA. 1.2.2荧光标记cRNA的合成与纯化用Cy3标 记肿瘤组织,Cy5标记正常肾组织,进行cRNA的合 成.将cRNA样品转移到RNeasy微型纯化柱, 13000r/min离心308,弃滤液;向柱子中加500l 的RPE缓冲液,13000r/min离心60s,弃滤液.将 纯化柱转移到新的收集管,在纯化柱滤膜中央加人 30的无RNA酶水,室温放置60S,13000r/min 离心30s,收集到约60l的cRNA纯化液,测定样 一80?遮光贮存,备芯片杂交用. 晶浓度后, 1.2.3芯片杂交,洗片和扫描取以Cy3及Cy5标 ?通讯作者 68 记的线性扩增cRNA各0.75g混合,5O的10X 对照质控样品,用去核酸酶水调至215l,混匀, 一 8O?避光保存.2×cRNA中加人9.0l的25× 片段化缓冲液,轻轻混匀,6o?避光孵育30min后, 加入2251的2×杂交缓冲溶液,轻轻混匀,离心沉 淀.取一新盖玻片,标签面向上置于杂交盒底座,在 盖玻片上滴加400l杂交标本,将AgilentHuman lB寡核甘酸芯片数字面向上盖在盖玻片上.组装 好杂交盒,于杂交炉中60?,4r/min杂交16h.取 出芯片,置于洗液1中,将芯片与盖玻片分开,漂洗 后取出,置入新的洗液1中室温漂洗10min,洗液2 漂洗5rain,氮气吹干,遮光保存.将芯片置于 Agilent2565BA基因芯片扫描仪中扫描,参数设置 采用扫描仪的默认参数,扫描后的数据用Feature ex~acfion软件进行分析及均一化处理. 1.2.4共同差异表达基因的判断以Cy3(gpro— cessedsigna1)以及Cy5(rpmcessedsigna1)L~gRatioP Value为标准进行判断,若P<0.01则认为该基因 在疾病初诊或复发时的表达存在差异,gprocesseds— ignal<rprocessedsignal则界定为基因表达上调, gpmcessedsignal>rprocessedsignal则界定为基因表 达下调.3例ccRCC患者中每1例复发时均表达上 调的基因为共同上调基因,均表达下调的基因为共 同下调基因,共同差异表达基因包括共同上调基因 和共同下调基因. 2结果 2.1RNA质检结果3例癌组织和1例正常肾组 织总RNA的A260/A280为1.7,1.9,总RNA的电 泳带18S和28s均清晰,表明核酸成分完整,无降 解,无蛋白质和有机溶剂等污染.经Agilent2100生 山东医药2011年第51卷第l8期 物分析仪测定,曲线标准,符合实验要求. 2.2芯片杂交质控结果2张芯片杂交结果经 Featureextraction软件严格筛选,芯片中全部22000 个点中有效杂交达99%以上. 2.3正常肾组织和肾癌组织的基因表达谱差异比 较将3例癌组织的基因表达谱分别与正常肾组 织的基因表达谱进行对比.结果显示,1例上调基 因403个,下调基因399个,1例上调基因1783个, 下调基因2415个,1例上调基因2756个,下调基 因3307个;3例癌组织与正常组织比较,共筛选出 差异表达基因204个,其中共同上调基因31个(占 15.2%),共同下调基因173个(占84.8%),其中包 括6个尚未被Genebank收录的人类新基因. 3讨论 肿瘤的发生发展通常需要多个癌基因的激活, 以及抑癌基因和细胞增殖,分化,凋亡等相关基因的 协同作用.我们采用长链寡核苷酸基因芯片检测 ccRCC组织的基因表达谱,共发现差异表达基因 204个,上调的基因31个,下调的基因173个.从 基因的功能分类看,这些差异表达的基因主要包括 癌基因,抑癌基因和细胞信号传导,细胞周期,DNA 转录翻译,凋亡,细胞因子,代谢酶类等编码基因. 本研究发现的204个差异表达基因,除去6个 新基因及11个编码但功能不明确的基因,其余均可 根据Genebank精确定位,确定其所在的染色体区带 及功能.从本实验差异表达的基因的染色体定位情 况分析,上调基因主要分布在2p,3p,5q,9p,10q, 11p,14q,20q等,而下调的基因主要分布在lq,1p, 3q,3p,4px7p,11p,12q,13q,14q,17p和19p等,与 以往的研究结果比较接近J.说明ccRCC的发生 与染色体的异常相关,差异表达基因较集中地分布 在染色体的一定区带上.统计发现,位于3p,14q, 5q的分别有13,9,6个差异表达基因,分别占7.O% (13/187),4.8%(9/187),3.2%(6/187),属于比较 集中的几个区域,3p区的l3个差异表达基因中有 大家熟悉的VHL基因.VHL基因定位于染色体 3p25一p26,其编码的蛋白产物为pVHL,pVHL与细 胞周期调控,细胞间信号传导,细胞外纤维连接,蛋 白形成及血管形成等肿瘤发生发展相关的生物学过 程密切相关J.研究表明,ccRCC患者3p杂合 性缺失,VHL基因突变以及甲基化所致VHL基因 失活是原发性散发ccRCC发生的主要分子机制之 一 ,而ccRCC患者中VHL基因突变率高达57%. 据此,有学者提出,根据ccRCC基因表达谱的表达 情况,将ccRCC进一步分成VHL突变阳性型和阴 性型两类. 本实验结果显示,包括原癌基因EGFR和抑癌 基因VHL在内的诸多重要基因均呈显着差异表达, 其中EGFR和VHL的平均Ra值分别为l5.Ol和 0.04,即分别上调l5倍和下调25倍,HIF—lot平均 Ra值为28.o0,上调28倍.VHL,HIF—la和EGFR 等这些基因的明显差异表达,揭示其与ccRCC的发 生密切相关,这一点已普遍地被人们接受J. 目前大多数研究者[4认为,ccRCC的发生与染 色体的异常相关.如1,3,5,6,9,13,14号染色体的 部分缺失或扩增,其中单一染色体异常较多见的是 3号染色体.据统计,3号染色体或3p的缺失异常 约占60%,此外还包括14q的缺失和5q的放大. Chen等用SNP芯片检测8O例ccRCC组织,发现 最易出现杂合性丢失的是3p,共有69例(占 86.25%),其次是8p12,6q23.3-27,14q24,9q32, 1Oq22等;出现5q异常扩增的有32例.Arai等J 通过对51例ccRCC组织基因聚类分析,也发现3p 的缺失和5q的扩增是最常见的染色体异常. 参考文献: [1]BeroukhimR,BrunetJP,DiNapoliA,eta1.Patternsofgeneex- pressionandcopy?-numberalterationsinvon—hippellindau~soase-? associatedandsporadicclearcellcarcinomaofthekidney[J]. CancerRes,2009,69(11):4674-4681. [2]PauseA,PetemonB,SchaffarG,eta1.Studyinginteractionsof fourproteinsintheyeasttwo-hybridsystem:structuralresemblance ofthepVHL/donginBC/hCUL-2complexwiththeubiquitinligas— ecomplexSKP1/cullin/F2boxprotein[J].PrecNatlAcadSci USA,1999,96(9):9533-9538. [3]果宏峰,龚侃,邹霜梅,等.肾透明细胞癌中VHL基因突变与缺 氧诱导因子一1a表达的研究[J].中华泌尿外科杂志,2004,42 (11):196-200. [4]MonzonFA,AlvamzK,GatalieaZ,eta1.Detectionofchromosomal aberrationsinrenaltumors:acomparativestudyofconventionalcy— togenetiesandvirtualkary0l帅i"gwithsingle—nueleotidepolymor- phismmieroarrays[J].ArchPatholLabMed,2009,133(12): 1O17.1q22. [5]ChenM,YeY,YangH,eta1.Genome-wideprofilingofchromo- somalalterationsinrenalcellcarcinomausinghigh—densitysingle nueleotidepolymorphism8I1即[J].IntJCancer,2009,125(10): 2342-2348. [6]AraiE,Ushijimas,TsudaH,眦a1.Geneticclusteringofclearcell renalcellcarcinomabasedonarray-comparativegenomichybridiza— tion:itsassociationwithDNAmethylationalterationandpatientout- come[J].ClinCancerRes,2008,14(17):5531-5539. (收稿日期:2010—12—12) 69