[精]可溶性糖的测定
实验1 可溶性糖的测定
一、实验目的
1(学习蒽酮比色定糖法的原理和方法。
2(学习721型分光光度计的原理和操作方法。
二、实验原理
总糖是指样品中的还原单糖及在本法测定条件下能水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和可部分水解为葡萄糖的淀粉。
蒽酮比色法是测定样品中总糖量的一个灵敏、快速、简便的方法。
其原理是糖类在较高温度下被硫酸作用脱水生成糠醛或糖醛衍生物后与蒽酮(CHO)1410缩合成蓝色化合物。溶液含糖量在150μg /ml以内,与蒽酮反应生成的颜色深浅与糖量成正比。
蒽酮不仅能与单糖也能与双糖、糊精、淀粉等直接作用,样品不必经过水解。
三、实验器材
1(试管(或具塞试管) 2. 吸量管及试管架(1 ml、10 ml) 3(沸水浴 4. 冰浴
5(721型分光光度计
6(蒽酮试剂
称取100 mg蒽酮溶于100 ml 98%硫酸溶液(A.R)中,用时配制。
7(葡萄糖
溶液(100 μg/ml) 200 ml
精确称取100 mg干燥葡萄糖,用蒸馏水定容至1000 ml。
8(样品溶液 200 ml 可自选待测物制成样品溶液。
举例:称取500 g市售白薯(或淀粉),洗净切碎后用多功能食品加工机磨成浆,4层纱布压滤、弃滤液溜渣,将渣放于烘箱内80,85?烘干后,再用植物粉碎机(微型)研细,过筛,取100目筛下物为待测样品。
取样品在烘箱内105?烘干,恒重后,精确称取1,5 g,置于锥形瓶中,加入80 ml沸蒸馏水,放入沸水浴。不时摇动,提取0.5 h。取出立即过滤,残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤,合并滤液。冷却至室温,用蒸馏水定容至100 ml。
9(白薯。
四、实验步骤:
1(制作标准曲线 取7支干燥洁净的试管,编号后按下表操作。
编号 1 2 3 4 5 6 7 试剂(ml)
葡萄糖标准液(100μg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8
HO 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 2
蒽酮试剂 10 10 10 10 10 10 10
1每管加入葡萄糖标准液和水后立即混匀,迅速置于冰浴中,待各管都加入蒽酮试剂后,同时置于沸水浴中,准确加热7 min,立即取出置冰浴中迅速冷却。待各管溶液达室温后,用1 cm厚度的比色皿,以第一管为空白,迅速测其余各管的光吸收值。然后以第2,7管溶液含糖量μg为横坐标,吸光度(OD)为纵坐标,画出含糖量与OD值的相关标准曲620620
1 要在冰浴条件下加入蒽酮,以防止发热,影响颜色反应。生成的颜色较稳定,在4 h内无明显变化。
线。
2(测定样品的含糖量 取4支试管按下表操作。
编号 1 2 3 4 试剂(ml)
样品溶液 0 1.0 1.0 1.0
HO 1.0 0 0 0 2
蒽酮试剂 10.0 10.0 10.0 10.0
其他操作与制作标准曲线相同。将第2,4管测出的OD平均值,根据OD平均值620620从标准曲线上查出相应的含糖μg数,再换算成100 g样品中总糖的含量。
五、思考题:
用蒽酮比色法测定样品中糖含量时,应注意什么,为什么,
实验2 氨基酸的总量测定和纸层析分离鉴定
? 甲醛滴定法测定氨基氮
一、实验目的
初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。
二、实验原理
氨基酸是两性电解质,在水溶液中有如下平衡:
+--++RCHRCHCOOCOOHNH,3
+NHNH32 ++是弱酸,完全解离时pH为11,12或更高,若用碱滴定—NH所释放的H来测量氨基酸,3
一般指示剂变色减小于10,很难准确指示终点。
常温下,甲配合能迅速与氨基酸的氨基结合,生成羟甲基化合物,使上述平衡右移,促
++使—NH释放H,使溶液的酸度增加,滴定终点移至酚酞的变色域内(pH9.0左右)。因此,3
可用酚酞作指示剂,用标准氢氧化钠溶液滴定。
NaOH--++RCHRCHCOOCOOH中和
+NHNH32
HCHO
-RCHCOO
NHCHOH2
-RCHCOO
OH)N(CH22 2如样品为一种已知的氨基酸,从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。如样品是多种氨基酸的混合物,如蛋白水解液,则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速,常用来测定蛋白质的水解程度。随水解程度的增加滴定值也增加,滴定值不再增加时,表示水解作用已完全。
三、实验器材
25 ml锥形瓶,3 ml微量滴定管,吸管。
0.1 mol/L标准甘氨酸溶液:准确称取750.7 mg甘氨酸,溶解后定容至100 ml。
30.1 mol/L标准氢氧化钠溶液
2 脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物,使滴定ml数偏低。酪氨酸的滴定ml数偏高。 3 标准氢氧化钠溶液应在使用前标定,并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。
酚酞指示剂:0.5%酚酞的50%乙醇溶液
中性甲醛溶液:在50 ml 36,37%分析纯甲醛溶液中加入1 ml 0.1%酚酞乙醇水溶液,用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液滴定到微红,贮于密闭的玻璃瓶中。此试剂在临用前配制。如已放置一段时间,则使用前需重新中和。
四、实验步骤
1(取3个25 ml的锥形瓶,编号。向第1、2号瓶内各加入2 ml 0.1 mol/L的标准甘氨酸溶液和5 ml水,混匀。向3号瓶内加入7 ml水。然后向3个瓶中各加入5滴酚酞指示剂,混匀后各加2 ml甲醛溶液,再混匀。分别用0.1 mol/L标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。
重复以上实验2次,记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的ml数。取平均值,计算甘氨酸基氮的回收率。
实际测得量甘氨酸氨基氮回收率%= ,100加入理论量
公式中实际测得量为滴定第1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液ml数的平均值与3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液ml数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度,再乘以14.008。
2 ml乘以标准甘氨酸的摩尔浓度再乘14.088。即为加入理论量的mg数。
2(取未知浓度的甘氨酸深液2 ml,依上述方法进行测定,平行做几份,取平均值。计算每ml甘氨酸溶液中含有氨基氮的mg数。
氨基氮(mg/ml)=
,,式中:为滴定待对测液耗用标准NaOH溶液的平均ml数。为滴定对照液(3号未对VV
瓶)耗用标准NaOH溶液的平均ml数。mol/L为标准NaOH溶液的真实摩尔浓度。 NaOH
五、思考题
选用酚酞指示剂,为什么滴定的是氨基,
? 氨基酸的纸层析法分离鉴定
一、实验目的
通过氨基酸的分离,学习纸层析法的实验原理及操作方法。
二、实验原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用R值(比移)来表示的: f
原点到层析点中心的距离R= f原点到溶剂前沿的距离
在一定的条件下某种物质R值是常数。R值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、ff
层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。
三、实验器材
41(层析缸 2.毛细管
3(喷雾器 4.培养皿
5(试析滤纸(新华一号)
6、试剂:
(1)扩展剂:4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20 ml正丁醇和5ml冰醋酸放入分液漏斗中,与15 ml水混合,充分振荡,静置后分层,放出下层水层,加入0.1%的茚三酮。取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂,其余的倒入培养皿中备用。
(2)氨基酸溶液:赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液
(各组份浓度均为0.5%)各5 ml。
四、实验步骤:
1(将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。
2(取层析滤纸(长22 cm、宽14 cm)一张。在纸的一端距边缘2,3 cm处用铅笔划一条直线,在此直线上每间隔2 cm作一记号如右图。
3(点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上,干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3 mm。
4(扩展 用线将滤纸缝成筒状,纸的两边不能接触。将盛有约20 ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中,并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在
下,扩展剂的液面需低于点样线1 cm)。待溶剂上升15,20 cm时即取出滤纸,用铅笔描出
溶剂前沿界线,自然干燥或用吹风机热风吹干。
5(显色 将滤纸取出,置烘箱中烘烤5 min(100?)或用热风吹干即可显出各层析斑
点。
6(计算各种氨基酸的R值。 f
五、思考题:
1(何谓纸层析法,
2(何谓R值,影响R值的主要因素是什么, ff
3(怎样制备扩展剂,
4(层析缸中平衡溶剂的作用是什么,
4 本实验所用层析缸是用大的标本缸代替的。若用标准的层析缸,滤纸平衡后应用长颈漏斗从层析缸上部
小孔中加入扩展剂。
实验3 核糖核酸的分离、组分鉴定与定量分析
一、实验目的
学习从酵母中分离RNA和鉴定RNA组分的方法,并用苔黑酚法测定RNA的含量。
二、实验原理
RNA和DNA分别存在于细胞质和细胞核中,分离提出核酸,首先要将细胞破碎制成匀浆、使核酸充分提取出来。
酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液,在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。但蛋白质的存在干扰核酸的测定,因此在沉淀中加入95%乙醇溶液洗涤,以除去蛋白,由此可得到RNA的粗制品。
RNA在硫酸煮沸液中可水解成核糖、嘌呤硷、嘧啶硷和磷酸,可分别进行鉴定。
HSo 24核苷酸 核糖+(嘌呤碱or嘧啶碱)+磷酸。
?
当含有核糖的RNA与浓盐酸及3.5——二羟基甲苯在沸水浴中加热后,有绿色复合物产生。这是因为RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成醛糖,后者再与3.5——二羟基甲苯作用产生绿色络合物。 CH3
沸水浴
++鲜绿色复合物RNA 浓HClFeCl3 HOOH
可用比色法测定
绿色复合物在670 nm有最大光吸收,故光吸收值与浓度成正比。
三、实验器材
1、器材:匀浆机、离心机、试管、烧杯、水浴锅。
、试剂:酵母、酸性乙醇、95%乙醇、碱液、FeCl 浓HCl液、苔黑酚。 23
四、实验步骤
1、酵母RNA的提取:
取酵母1.0 g(5片) 冷却 研磨成 倒入玻璃试管中沸水浴20 min 匀浆 加0.04 M NaOH 8 ml
弃残渣 倒入10 ml塑料离心管中,离心(3000 rpm)10 min
留滤液
倾入小烧杯中缓慢加入10ml酸性乙醇转移至10ml塑料离心管中离心3 min(3000 rpm)
弃上清液 加5 ml 95%乙醇(或乙醚) 留RNA沉淀 洗涤沉淀RNA离心3 min(3000 rpm) 得RNA粗品。 去上清液,
2、水解RNA: 沸水浴 10min SO 将沉淀RNA转移到玻璃管中+10 ml 1.5 M H24
1作鉴定用 留 2RNA水解液 1留作定量用 2
3、RNA组分鉴定:
?嘌呤碱:取水解液1 ml + 浓氨水(5滴)+1 ml AgNO,观察嘌呤银化合物的絮状沉3
淀。
?核糖:取1 ml水解液+2 ml苔黑酚三氯化铁溶液
沸水浴 10 min观察颜色变化(亮绿色)
?磷酸: 沸水浴 取1 ml水解液+1 ml定磷试剂10 min
观察颜色变化(蓝色)
4、RNA含量测定
(1)按下表加样操作
标准管 样品管 空白管 RNA标准液 0.5 ml RNA样品水解液 0.5 ml 蒸馏水 0.5 ml FeCl 浓HCl液 2 ml 2ml 2 ml 3
苔黑酚: 0.2 ml 0.2ml 0.2 ml 摇匀 沸水浴10 min 沸水浴10 min 沸水浴10 min 取出冷却后670 nm比色OD OD OD 123测定
(2)结果计算。
RNA标准液为0.3 mg/ml。1 g酵母片提取RNA的总体积为10 ml。
(OD- OD)/(OD- OD)=C/C 标样1323
RNA含量(mg/g)= C×10/w 样
实验4 维生素C的定量测定
一、实验目的
1(学习维生素C定量测定法的原理和方法。
2(进一步熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技术。
二、实验原理
测定维生素C(抗坏血酸)的化学方法,一般是根据它的还原性。本实验即利用维生素C的这一性质,使其与2,6-二氯酚靛酚作用,其反应如下:
2,6-二氯酚靛酚钠盐的水溶液呈现蓝色,在酸性环境中为玫瑰色,当其被还原时,则脱色。
OCOCClClOHHCCOOO+NOHOHO+NOHCOHCOClCClC
CHHOCHHO
OHCH2CHOH22,6-二氯酚靛酚2,6-二氯酚靛酚抗坏血酸抗坏血酸 (还原型)(氧化型)玫瑰色(还原型)(氧化型)
根据上述反应,利用2,6-二氯酚靛酚在酸性环境中滴定含有维生素C的样品溶液。开始时,样品液中的维生素C立即将滴入的2,6-二氯酚靛还原脱色,当样品液中维生素C全部被氧化时,再滴入2,6-二氯酚靛酚就不再被还有原脱色而呈玫瑰色。故当样品液用2,6-二氯酚靛酚标准液滴定时,溶液出现浅玫瑰色时表明样品液中的维生素C全部被氧化,达到了滴定终点。此时,记录滴定所消耗的2,6-二氯酚靛酚标准液量,按下述公式计算出样品液中还原型维生素C的含量。
计算公式:
()VV,AB维生素C mg数/100 g样品= ,100W
式中:V为滴定样品提取液所用的2,6-二氯酚靛酚的平均ml数; A
V为滴空白对照所用的2,6-二氯酚靛酚的平均ml数; B
S为1 ml 2,6-二氯酚靛酚溶液相当于维生素C的mg数;
W为10 ml样品提取液中含样品的g数。
三、实验器材
1(研钵 2(吸量管(10 ml)3(容量瓶(50 ml)4(锥形瓶(50 ml)
5(微量筒定管(5 ml) 6(漏斗 7(纱布 8(滤纸 9(药物天平
10(绿豆芽 11( 10%盐酸溶液 1 500 ml
12( 2,6-二氯酚靛酚溶液 2 000 ml
称取0.21 g碳酸氢钠,0.26 g 2,6- 二氯酚靛酚溶于250 ml蒸馏水中,稀释至1 000 ml。
过滤,装入棕色瓶内,置冰箱内保存,不得超过3 d。使用前用新配制的标准抗坏血酸溶液标定。取5 ml标准抗体坏血酸溶液加入5 ml偏磷酸-醋酸溶液。然后用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定,以生成为微玫瑰红色持续15 s不退为终点。计算2,6-二氯酚靛酚溶液的浓度,以每ml 2,6-二氯酚靛酚溶液相当于抗体坏血酸的mg数来表示。
13(标准抗坏血酸溶液
准确称取纯抗坏血酸结晶50 mg溶于偏磷酸-醋酸溶液室容到250 ml。装入棕色瓶,贮于冰箱内。
14(偏磷酸-醋酸溶液
称取偏磷酸15 g,溶于40 ml冰醋酸和450 ml蒸馏水所配成的混合液中。过滤。贮于冰箱内,此液保存不得超过10 d。
四、实验步骤
制备含维生素C的样品提取液。
称取30 g绿豆芽(37?发芽3-7 d)置研钵中研磨,放置片刻(约10 min),用2层纱布过滤,将滤液(如混浊可离心)滤入50 ml容量瓶中。反复抽提2-3次,将滤液并入同一容量瓶中。最后,用酸化的蒸馏水定容,混匀,备用。
量取样品提取液10 ml于锥形瓶中。用微量滴定管,以2,6-二氯酚靛酚溶液滴定样品提取液,呈微弱的玫瑰色,持续5 s不退为终点,记录所用2,6-二氯酚靛酚的ml数。整个滴定过程不要超过2 min。
另取10 ml用10%盐酸酸化的蒸馏水做空白对照滴定。
样品提取液和空白对照各做3份。
计算结果
五、思考题
试述本实验介绍的2,6-二氯酚靛酚滴定法的优缺点。
(附)碘滴定法
原理
OCOC
COHOCOO+2HI+ICOC2OH
CC
CHHOCHHO
OHCHOH2CH2
抗坏血酸抗坏血酸(氧化型)(还原型)
铜盐(硫酸铜或醋酸铜)与过量的碘化钾进行反应形成碘化铜。碘化铜不稳定,随即分解为碘化亚铜和游离的碘。
2 CuSO+4 KI?2 CuI+2 KSO4224
2 CuI?CuI+I 2222
释放出来的碘可氧化L-抗坏血形成脱氢抗坏血酸和碘化氢。反应继续进行,直到溶液里的L-抗坏血酸被碘合部氧化为止。剩余的微量和碘与淀粉指示生成蓝色,终点明显。本法简单,快速,可准确测定L-抗坏血酸25 μg的量。对抗坏血酸纯品进行测定的结果表明
实验误差不超过?2%。
试剂
(1)标准0.01 mol/L硫酸铜(CuSO?5HO)溶液或0.01 mol/L醋酸铜42
[Cu(CHCOO)?HO]溶液:精确称取0.2497 g硫酸铜或0.1996 g醋酸铜加水定容至100 ml。 222
(2)30%和50%碘化钾水溶液(w/v)
(3)1%可溶性淀粉指示剂溶液(w/v)
(4)偏磷酸-醋酸溶液 取15 g偏磷酸溶于40 ml冰醋酸和450 ml蒸馏水的混合液中,在冰箱中过滤,滤液保存在冰箱中。超过10 d需重新配制。
操作
1(测样准备
(1)药品片剂 取10个药片称量,小心研碎,精密称取相当于1片重量的片粉,以偏磷-醋酸溶液溶解,于100 ml量瓶中定浴,摇匀后过滤。
(2)注射液 取1 ml注射液用偏磷酸-醋酸溶液稀释定容到100 ml。
(3)食品 取50 g或20 g蔬菜或水果,加仿磷酸-醋溶液到200 ml,搅匀3 mih后过滤,滤液放入碘量瓶中。
2(滴定 精确量取一定体积的样品溶液(如5 ml)于100 ml碘量瓶中,加10 ml 30%KI溶液(抗坏血酸稀溶液含量于1 mg时可用50%KI溶液)。再加数滴演粉指示剂溶液。随即用标准硫酸铜溶液(0.01 mol/L)进行滴定。边滴定边振摇,直至显示出蓝色,记录滴定量。再做一个空白试验,在计算前,需将样品的滴定量减去空白试验的滴定量得V。
计算
L-抗血坏酸含量(mg/每份)=V×c
V=0.01 mol/L标准硫酸铜溶液的ml数。
C=0.88,即1 ml 0.01 mol/L标准硫酸铜溶液相当于0.88 mg抗坏血酸。
实验5 酶的制备、活力及功能测定
? 酶的特性
一、实验目的
通过实验加深对酶的性质的认识。
二、实验原理
1、酶的催化作用受温度的影响。在最适温度下,酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为37-40?,植物酶的最适温度为50-60?。
酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂,虽加热100?,其活性并无明显改变,但在100?的溶液中却很快地完全失去活性。
低温能降低或抑制酶的活性,但不能使酶失活。
2、pH对酶活性的影响:酶的活力受环境pH的影响极为显著。不同酶的最适pH值的不同。本实验观察pH对唾液的淀粉酶活性的影响,唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。
3、酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉梅的活化剂,铜离子为其抑制剂。
4、酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例,来说明酶的一专性。
淀粉和蔗糖无还原性。唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖,但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖,但不能催化淀粉的水解。用Benedict试剂检查糖的还原性。
三、实验器材
1(器材
(1)试管及试管架 (2)恒温水浴 (3)冰浴 (4)沸水浴
2(试剂和材料:
A、(1)0.2%淀粉的0.3%氯化钠溶液 150 ml 需新鲜配制
(2)稀释200倍的唾液 50 ml
用蒸馏水漱口,以清除食物残渣,再含一口蒸馏水,0.5 min后使其流入量筒并稀释200倍(稀释倍数可根据各人唾液淀粉酶活性调整),混匀备用。
(3)磺化钾-磺溶液
将碘化钾20 g及碘10 g溶于100 ml水中。使用前释释10倍。
B、(1)新配制的溶于0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液 250 ml
(2)稀释200倍的新鲜唾液 100 ml
(3)0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液 600 ml
(4)0.1 mol/L柠檬酸溶液 400 ml
(5)碘化钾-磺溶液 50 ml
(6)pH试纸 pH=5、pH=5.8、pH=6.8、pH=8四种
C、(1)0.1%淀粉溶液 150 ml
(2)稀释200倍的新鲜唾液 150 ml
(3)1%氯化钠溶液 50 ml
(4)1%硫酸铜溶液 50 ml
(5)1%硫酸钠溶液 50 ml
(6)碘化钾-碘溶液 100 ml
D、(1)2%蔗糖溶液
(2)溶于0.3 %氯化钠的1%淀粉溶液 150 ml(需新鲜配制)
(3)稀释200倍的新鲜唾液 100 ml
(4)蔗糖酶溶液 100 ml
将啤酒厂的新鲜酵母用水洗涤2-3次(离心法),然后放在滤纸上自然干燥。取干酵母100 g,置于乳钵内,添加适量蒸馏水及少量细沙,用力研磨提取约1 h,再加蒸馏水使总体约为原体积的10倍。离心,将上清液保存于冰箱中备用。
(5)Benedict 氏试剂 200 ml
无水硫酸铜17.4 g溶于100 ml热水中,冷却后稀释至150 ml。取柠檬酸钠173 g,无水碳酸钠100 g和600 ml水共热,溶解后冷却并加水至850 ml。再将冷却的150 ml硫酸铜溶液倾入。本试剂可长久保存。
四(实验步骤
1、淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小,遇碘可呈现蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈现颜色,麦芽糖遇碘也不呈色。在不同温度下,淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现现的颜色来判断。
取3支试管,编号后按下表加入试剂:
管号 1 2 3
淀粉溶液(ml) 1.5 1.5 1.5
稀释唾液(ml) 1 1 —
煮沸过的稀释唾液(ml) — — 1
摇匀后,将1、3号两试管放入37?恒温水浴中,2号试管放入冰水中。10 min后取出(将2号管内液体分为两半),用碘化钾-碘溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水
?水浴中继续保温10 min后,解的程度。记录并解释结果,将2号管剩下的一半溶液放入37
再用碘液实验,结果如何,
2、操作
取4个标有号码的50 ml锥形瓶。用吸管按下表添加0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液0.1 mol/L柠檬酸溶液以制备pH 5.0-8.0的4种缓冲液。
锥形瓶号码 0.2 mol/L 0.1 mol/L PH
1 5.15 4.85 5.0
2 6.05 3.95 5.8
3 7.72 2.28 6.8
4 9.72 0.28 8.0
从4个锥形中各取缓3 ml,分别注入4支带有号码的试管中,随后于每个试管中添加0.5%淀粉溶液2 ml和稀释2 ml。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1 min。将各试管中物质混匀,并依次置于37?恒温水浴中保温。
待向第4管加入唾液2 min后,每隔1 min由第3管取出一滴混合液,置于白瓷板上,
加1小滴磺化钾-碘溶液,检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时,向所有试管依次
添加1-2滴碘化钾-碘溶液。添加碘化钾-碘溶液的时间间隔,从第1管起,亦均为1 min。 观察各试管中物质呈现的颜色,分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。
3、操作
管号 1 2 3 4 0.1%淀汾溶液(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 稀释唾液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 1%硫酸铜溶液(ml) 0.5 — — — 1%氯化钠溶液(ml) — 0.5 — — 1%硫酸钠溶液(ml) — — 0.5 — 蒸馏水(ml) — — — 0.5 37?恒温水溶、保温10min*
碘化钾-碘溶液(滴) 2—3 2—3 2—3 2—3 现 象 *保温时间可根据人唾液淀粉酶活力调整。解释结果,说明本实验第3管的意义。
4(操作
(1)淀粉酶的专一性
管 号 1 2 3 4 5 6 1%淀粉溶液(滴) 4 — 4 — 4 — 2%蔗糖溶液(滴) — 4 — 4 — 4
稀释唾液(ml) — — 1 1 — — 煮沸过的稀释唾液( ml) — — — — 1 1
蒸馏水(ml) 1 1 — — — —
37?恒温水浴15 min
Benedict试剂(ml) 1 1 1 1 1 1
沸水浴2-3 min
现象 解释实验结果(提示:唾液除含淀粉酶外还含有少量麦芽糖酶)。
(2)蔗糖酶的专一性
管 号 1 2 3 4 5 6 1%淀粉溶液(滴) 4 — 4 — 4 — 2%蔗糖溶液(滴) — 4 — 4 — 4 蔗糖酶溶液(ml) — — 1 1 — — 煮沸过的蔗糖酶唾液( ml) — — — — 1 1
蒸馏水(ml) 1 1 — — — —
37?恒温水浴15 min
Benedict氏试剂(ml) 1 1 1 1 1 1
沸水浴2-3 min
现 象 解释实验结果。
五、思考题
1(什么是酶的最适温度及其应用意义,
2(什么是酶反应的最适pH,对酶活性有什么影响, 3(什么是酶的活化剂,
4(什么是酶的抑制剂,与变性剂有何区别,
5. 本实验结果如何证明酶的专一性,
实验总结
(一)温度对酶活力的影响
管 号 呈 现 的 颜 色 解 释 结 果 1 2 2号剩一半 3 (二)pH对酶活性的影响
管 号 呈 现 的 颜 色 解 释 结 果 1 2 3 4 (三)唾液淀粉酶活化和抑制
管 号 呈现的颜色 解释结果 第3管的意义 1
2 3
4
(四)酶的专一性
(1)淀粉酶的专一性
管 号 现 象 解 释 结 果 1 2 3 4 5 6 (2)蔗糖酶的专一性
管 号 现 象 解 释 结 果 1 2 3 4 5
6
结论:
? 血液中谷-丙转氨酶活力的测定
一、实验目的
了解转氨酶在代谢过程中的重要作用,学习转氨酶活力测定的原理和方法。
二、实验原理
生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶,能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换,在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。血清中的谷-丙转氨酶,在37?、pH7.4的条件下,可催化丙氨酸与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸和丙酮酸
丙酮酸可与2,4二硝基苯肼发生加成反应,生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙,该产物在碱性环境中可转化成红棕色的苯腙硝醌化合物,其颜色的深浅与丙酮酸的生成量,亦即与谷丙转氨酶活性的高低成正比。通过标准曲线可以查出丙酮酸的生成量。
三、实验器材
1.器具:5×15cm试管、刻度吸量管、恒温水浴、离心机、721型分光光度计。
2.试剂和材料
(1)0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液
? 0.1mol/L磷酸氢二钠溶液
? 0.1mol/L磷酸二氢钾溶液
? 0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液。
(2) 标准丙酮酸(含丙酮酸2.0μmol/mL)
(3) 谷-丙转氨酶底物溶液:(含α-酮戊二酸2 μmol/ml及DL-丙氨酸200 μmol/ml)
(4) 2.4二硝基苯肼溶液
(5) 0.4mol/L NaOH溶液 。
四、实验步骤
1(标准曲线制作:
(1)取6支试管,分别标上0,1,2,3,4,5编号。先将试管置于37?恒温水浴中保温5分钟以平衡内外温度。然后按下表所列的次序添加各试剂。
试剂(mL) 试管号
0 1 2 3 4 5
丙酮酸标准液 - 0.01 0.05 0.10 0.15 0.20 谷丙转氨酶底物 0.5 0.49 0.45 0.40 0.35 0.30
磷酸缓冲液 0.1 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 2, 4 - 硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
37? 保温 15分钟
0.4 mol/L 氢氧化钠液 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
37? 保温 15分钟, 520nm比色测定
(2)向各管内加入0.5毫升2,4-二硝基苯肼溶液,37?保温15分钟,接着分别向各管内加入0.4M氢氧化钠溶液5毫升。再37?保温15分钟,以0号管作空白对照,测定520 nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标,光吸收值为纵坐标,画出标准曲线。
2(血清样品谷丙转氨酶活性的测定
(1)取4支试管,分别标上空白、样品1、样品2、样品3。向各管内加入0.5 mL谷丙转氨酶底物、0.1 mL磷酸缓冲溶液并摇匀,37?水浴保温5分钟。
(2)向样品管中分别加入0.1 mL血清,37?保温60分钟。
(3)向空白与样品管中分别加入0.5 mL 2,4,二硝基苯肼,摇匀,水浴保温15分钟。
(4)向空白管中加入0.1 mL血清,摇匀。
(5)向所有4支试管中都加入5.0 mL 0.4 M NaOH溶液,摇匀并水浴保温15分钟后在520 nm进行比色测定。
试剂(mL) 空白 样品管1 样品管2 样品管3
谷丙转氨酶底物 0.5 0.5 0.5 0.5
磷酸缓冲液 0.1 0.1 0.1 0.1
血清 - 0.1 0.1 0.1
37? 保温 15分钟
2, 4 - 硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5
37? 保温 15分钟
血清 0.1 - - -
0.4 mol/L 氢氧化钠液 5.0 5.0 5.0 5.0
37? 保温 15分钟, 520nm比色测定
五、实验结果
1(用测定吸光值在标准曲线上查出丙酮酸的生成量
2(计算:
六、思考题
1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义,
2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点,为什么要避免溶血,
3.根据下列公式可以计算待测物的浓度,请问怎样才能减少实验误差, 附:
酶的国际单位:在最适温度(25?)下,1分钟内转化1μmol底物的酶量称为1个酶单位(U)。
Katal单位:在一定条件下,1秒钟内转化1mol底物所需要的酶量。
1 U,16.67 nKat
1 Kat ,6 , 107 U
:
1. 在测定谷丙转氨酶活力时,应事先将底物、血清在37?水浴中保温,然后在血清管中加入底物,准确记时。
2.转氨酶只能作用于α-L-氨基酸,对D-氨基酸无作用。实验室多用α-DL-氨基酸。
3. 进行样品测定时,加入2,4-二硝基苯肼溶液后要摇匀并保温15分钟。
4. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。
? 溶菌酶的提取和活力测定
一、实验目的
学习从鸡蛋清中提取溶菌酶的方法,了解溶菌酶的催化特点及反应条件,掌握测定溶菌酶的方法的
。
二、实验原理
溶液酶(lysozyme E C 3.2.1.17)存在于植物、动物和微生物中。鸡蛋清溶菌酶是目前研究和生产的重点对象,也是了解最清楚的溶菌酶之一。它由18种129个氨基酸残基组成,具有4个S,S,分子量14000,最适pH6,7。本实验提取方法采取树脂吸附、洗脱、沉淀、透析、盐析和干燥等
获得纯度较高的有活性的溶菌酶。
溶菌酶能有效的水解细菌细胞壁的肽聚糖,其水解位点是N,乙酰胞壁酸(NAM)的1倍碳原子与N,乙酰葡萄糖胺(NAG)的4倍碳原子相连的β,1.4糖苷键。由于细胞壁的分解导制细菌破裂,因此,通过分光光度计测定菌液在单位时间内OD的变化即可计算650出酶活力。
三、实验器材
1(溶壁微球菌(Micrococcsu lysodeikticus)干粉制剂。
2(冰箱,pH计,pH试纸,冷冻离心机,恒温培养箱,恒温摇床,分光光度计,水浴锅,滤网(150目),滤纸,电子天平,漏斗,透析袋,移液器,蒸气灭菌锅。
3(试剂
724树脂,新鲜鸡蛋清,pH 6.5的0.15 mol/L磷酸缓冲液,10%硫酸铵溶液,固体硫酸铵,4% NaOH, 1:5盐酸/水(V/V),丙酮,pH 6.2的0.1 mol/L磷酸缓冲液。
四、实验步骤
(一)鸡蛋清溶菌酶的提取
1(预处理:取新鲜或冷冻蛋清(冷冻蛋请让其自然融化),用试纸测pH应为8左右,过铜筛,除去蛋清中的脐带,蛋壳碎片及其他杂质。
2(吸附:将经处理过的鸡蛋清冷至5?左右,在搅拌下按14%(W/W)左右加入已经处理好的724树脂,使树脂全部悬浮在蛋清中,在0~5?条件下,搅拌吸附6 h左右,然在0~25?静置20 h以上。待分层后,弃去上层清液,下层树脂用清水反复洗4次,以除去杂蛋白,最后滤干树指。
3(洗脱:在上述脂中加入等体积的pH 6.5、0.15 mol/L磷酸缓冲液,搅拌洗脱20 min,滤除洗脱液,再重复上述操作2次。最后将除去杂物质树脂,加入等量的10%(NH)SO424-溶液,搅拌洗脱30 min,滤出洗脱液,再重复洗脱3次,滤出洗脱液,然后合半洗脱液。
4(沉淀:在洗脱液中按体积加入32%(W/V)的固体(NH)SO,搅拌使其完全溶424
解,4.0~10?处放置过夜,虹吸上清液,沉淀离心分离,得粗品。
5(透析:将沉淀物用蒸镏水全部溶解,然后装入透析袋中,在10?水中透析过夜,除去大部分(NH)SO收集透析液。 424
6(盐析:在透析液中,慢慢滴加4%的NaOH溶液,同时不断搅拌,在pH变化为8.5,9.0,如有白色沉淀,应立即于离心机上离心除去,然后用1:5的盐酸(1份盐酸:5份水)调pH值至3.5,按体积缓缓加入5%固体NaCI,搅拌均匀,冷处放置48 h左右,在4? 10000 rpm下离心20 min,收取溶菌酶沉淀。
7(干燥:沉淀加入10倍量冷至0?的无水丙酮,不断搅拌,使颗粒松细,冷处静置数 h,用漏斗滤去丙酮,沉淀采用真空干燥,直到无丙酮气味为止,得溶菌酶产品。
(二)酶活力测定。
1(菌体(M. lysodeikticus)的制备;菌体用细菌培养基(pH7.5)于37?液体培养27 h,离心收集,用蒸镏水反复洗涤,最后用丙酮干燥,离心后于真空中除尽丙酮。
2(称取5 mg溶壁微球菌,加入10 ml 0.1 mol/L、pH6.2磷酸缓冲液,于带玻璃珠的三角瓶中反复摇动将其打碎,使菌体悬浮均匀,再补加缓冲液至20~25 ml,使基OD值在68020~30%之间。
3(称取5 mg溶菌酶溶解于5 ml 0.1 mol/L、pH6.22磷酸缓冲液中,作为酶贮存在4?保存,用时稀释。
4(将菌液和酶液于25?水浴10~15 min,取4 ml均匀菌液,0.2 ml稀释酶液,迅速搅
拌均匀,于OD下每隔30 s读数一次,共读取5次,取其直线部分。 680
(三)酶活力测定
在25?、pH 6.2条件下,在OD处每min引起菌悬液透光度上升0.02%的酶量为1650
个酶活单位。
注意事项:
1(打蛋时要注意清洁卫生,尽量减少蛋黄等杂质混入蛋清,防止影响收率和树脂对产物的吸附力。
2(操作的全过程要在低温下进行(10?以下),防止原料变质和酶失活。
3(本酸碱调节pH时,要滴加均匀,同时立即搅拌,防止局部浓度过高使酶失活。
4(测定时要在酶液加入后读取第一个值,以缓冲液作为参照。
演示:
在分光光度计上演示细菌破裂后透光度的升高。
吸附前后的724脂树。
溶菌酶粉剂。
光学显微镜下溶壁微球菌用溶菌酶处理的前后情况的观察。
五、作业
1(在实验报告中记录鸡蛋清溶菌酶提取的操作程序,并标明需要的条件。
2(将重复3次测定的数据记录在实验报告中,并计算出酶活力。
六、思考题
1(溶菌酶溶壁机理是什么,在现实生活中有哪些用途,
2(微生物来源的溶菌酶有哪几大类,其作用方式有何不同,
实验6 电泳技术及其应用
一、实验目的
了解SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理及操作方法,学习醋酸纤维薄膜电泳的原理和操作,了解电泳技术的应用。
二、实验原理
任一物质质点,由于其本身的解离作用或由于上吸附有其他带电质点,在电场中便会向一定的电极移动,这种带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极移动的现象,称为电泳(electrophoresis)。例如蛋白质分子,由于它具有许多可解离的酸性基团和碱性基团,
―如-COO和-NH等,它是一典型的两性电解质,在一定的pH条件下,就会解离而带电,3
带电的性质和多少决定于蛋白质分子的性质及溶液的pH值和离子强度。在某一pH条件下,蛋白质分子所带的正电荷数恰好等于负电荷数,即净电荷等于零。此时蛋白质质点在电场中不移动,溶液的这一pH值,称为该蛋白质的等电点(pI)。如果溶液的pH小于pI,则蛋白
+质分子结合一部分H而带正电荷,在电场中就会向负极移动。反之,溶液的pH大于pI,
+则蛋白质分子会解离出一部分H而带有负电,此时蛋白质分子在电场中就会向正极移动,可表示(如图51-1):
向正极移动不移动向负极移动
--COOCOOHCOO++-H--+H-COO蛋白质COO蛋白质COO蛋白质+ 分子++ 分子+NH+ 分子NH+H3NH-H33+NH+2NHNH33
图51-1 不同pH条件下蛋白质分子在电场中运动状态示意图
不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度不同,常用迁移率(或称泳动度,mobility)来表示。迁移率的定义是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。
vd/tdlm,,, EV/tVt2式中:m为迁移率(cm/V?s);v为颗粒的泳动速度(cm/s);E为电场强度(V/cm);d为颗粒泳动的距离(cm);l为支持介质的有效长度(cm),如凝胶或滤纸与两极溶液交界面间的距离;V为实际电压(V);t为通电时间秒(s)。通过测量d, l, V, t便可计算出颗粒的迁移率。
迁移率是胶体颗粒的一个物理常数,可用来鉴定蛋白质等物质以及研究它们的某些物化性质。现将人血浆蛋白质的等电点,迁移率等列于表51-1。
表51-1 人血浆蛋白质的等电点及迁移率
2-1-1蛋白质名称 等电点 迁移率(cm?s?V) Mr
,5清蛋白 4.88 ,5.9×10 69000
,5α-球蛋白 5.06 ,5.1×10 200000
,5α-球蛋白 5.06 ,4.1×10 300000
,5β-球蛋白 5.12 ,2.8×10 9000,150000
,5γ-球蛋白 6.85,7.50 ,1.0×10 156000,300000
,5纤维蛋白元 5.40 ,2.1×10 339700
带电颗粒在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的量,颗粒的大小和形状有关。一般说,所带净电荷量愈多,颗粒愈小,愈接近球形,则在电场中的泳动速度愈快,反之则愈慢。泳动速度除受颗粒本身性质的影响外,还和其他外界因素有磁,它们之间的相互关系可用下式表示:
,ED
v,
c,由上式可看出泳动速度与电动电势(ξ),所加的电场强度(E)及介质的介电常数(D)成正比,与溶液的粘度(η)成反比。式中c是一个常数,其数值为4π,6π,由颗粒大小而定。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后,巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原;SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开,并结合到蛋白质分子上,形成SDS-蛋白质复合物。在一定条件下,SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4 g SDS/1g蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电,使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明,它们在水溶液中的形状,近似于雪茄烟形的长椭圆棒,不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样,约为1.8mm,而长轴则随蛋白质的的M成正比地变化。这样的蛋白质-SDS复合r
物,在凝胶电泳中的迁移不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质的M的函数。 r
不同蛋白质的SDS复合物的m值很接近,M相差5倍的蛋白质之间,m值只相差10%,0r0如果忽略这个差别,就可以认为,各种蛋白质-SDS复合物的m基本上是一个定值。这表明,0
不同蛋白质的SDS复合物都带有相同密度的负电荷,并具有同样的构象,因此,它们的争电荷量与摩擦系数之比(q/f)都接近于一个定值而受各种蛋白质原来的电荷、分子大小和形状的影响,因而,在溶液中,自由迁移率就表现出一致性;但在一定浓度的凝胶中,由于引入了凝胶的分子筛效应,电泳迁移率m就成为蛋白质的M的函数。 r
现将影响颗泳动速度的外界因素讨论如下:
1、电场强度:电场强度是指每1 cm的电位降,也称电位梯度(电势梯度)。电场强度对泳动速度起着决定性作用。电场强度愈高,则带电颗粒泳动愈快。例如进行纸上电泳时,滤纸两端相距20 cm处测得电位降为200 V,则电场强度为:
200,10V/cm 202、溶液的pH值:溶液的pH值决定带电颗粒解离的适度,亦即决定其所带净电荷的多少。对蛋白质两性电解而言,pH值离等电点越远,则颗粒所带净电荷越多,泳动速度也越快,反之,则越慢。因此当分离某一蛋白质混合物时,应选择一个合适的pH,使各种蛋白质所带的电荷量差异较大,有得于彼此分开。为了使电泳过程中溶液pH值恒定,必须采用缓冲溶液。
3(溶液的离子强度:离子强度影响颗粒的电动电势(ξ),溶液的离子强度越高,电动电势越小,则泳动速度越慢;反之,则越快。一般最适的离子强度在0.02,0.2之间。溶液离子强度的计算方法如下:
12ICZ,, 2
式中:I为溶液的离子强茺;C为离子的摩尔浓度;Z为离子的价数。
例1( 求0.01 mol/L氯化钠溶液的离子强度。
1 22I,(0.01,1,0.01,1)2 ,0.014、电渗:在电场中,由于多孔支持物吸附水中的正或负离子使溶液相对带电,在电场作用下,溶液就向一定方向移动,称为电渗现象。在电泳中,由于支持介质(纸或凝胶)吸
,附OH离子带负电荷,而与支持介质相接触的水溶液带正电荷,液体更向负极移动,移动时可携带颗粒同时移动。所以电泳时颗粒泳动的表面速度是颗粒本身的泳动速度与由于电渗影响而被携带的移动速度两者的加和。若是颗粒原来向负极移动,则其表观速度将比泳动速度快,若原来向正极移动,则其表观速度将比泳动速度慢。
为了校正这一误差,可用一中性物质如糊精(dextrin),蔗糖或葡聚糖(dextran)等与样品平等作电泳,然后将其移动距离自实验结果中除去。
5、支持介质的选择:
支持介质均匀和吸附力小,否则电场强度不均匀,使结果不能重复,并得不到好的图谱。如果吸附力大,则蛋白质或其他胶体在它们泳动的过程中有一部分被支持介质所吸附,以致泳动快的部分其相对含量降低。
6、其他因素:例如缓冲溶液的粘度。缓冲溶液与带电颗粒的相互作用以及电泳时温度的变化等因素,也都影响泳动速度。
目前所采用的电泳方法,大致可分为三类:显微电泳,自由界面电泳和区带电泳。区带电泳应用比较广泛,按其支持物物理性状的不同可分成4大类:
(1)滤纸及其他纤维(如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤维)薄膜电泳。
(2)凝胶电泳:如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶电泳。
(3)粉末电泳:如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。
(4)线丝电泳、如尼龙丝,人造丝电泳。此为微量电泳方法。
血清蛋白质的纸上电泳已成为临床生化检验的重要方法。电泳结果可作为多种疾病,如肝炎、肝癌、肾病、血吸虫病等的生化指标,为临床诊断提供重要依据。本实验以人血清为材料,用纸上电泳法分离血清中的不同蛋白质,并测定它们的迁移率及各种蛋白质的相对百分含量。
三、实验器材
(一)用品与仪器器材
垂直板型电泳槽,水平式电泳仪、电泳仪烘箱,72型分光光度计,白搪瓷盘,点样管,喷雾器,玻璃缸,玻璃板,挂纸用水架,竹板夹,米尺,刀片,铅笔,杭州新华滤纸或Whatman No.1号滤纸
(二)溶液与试剂
纯品标准蛋白质(细胞色素C,12.5 kD; 胶凝乳蛋白质原A,25 kD;胃蛋白酶,35 kD;卵清蛋白;43 kD;牛血清清蛋白,67 kD),0.2 mol/L,pH7.2磷酸盐缓冲液, 样品溶解缓冲液0.014 mol/L,pH7.2磷酸盐缓冲液(含1%SDS,1%巯基乙醇,10%甘油,0.02%溴酚蓝),电极缓冲液(0.1%SDS,0.1 mol/L,pH7.2磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液),考马斯亮蓝R-250染色液,脱色液,SDS,硼酸缓冲液(离子强度0.05,pH9.0),巴比妥缓冲液(离子强度0.05,pH8.6),溴酚蓝染色液,0.5%乙酸溶液,0.01 mol/L氢氯化钠溶液。
四、实验步骤
(一)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量
1、贮液及凝胶的配制
贮液及凝胶溶液的配制方法如表51-2
表51-2 聚丙烯酰胺凝胶电泳配制方法
20 ml凝胶溶液混合比 贮液
5%凝胶 10%凝胶
Acr 29.2 g
I 30%凝胶贮液 Bis 0.8 g 3.33ml 6.67ml
加蒸馏水到10 ml
SDS 0.2 g
加0.2 mol/L, PH7.2磷酸盐缓冲液 II 凝胶缓冲液 10 ml 10 ml 至100 ml或加0.2 mol/L, pH7.2Tris-HCl
缓冲液至100 ml
? TEMED 2 ml 2 ml ? 蒸馏水 4.57 ml 1.23 ml
以上溶液混合抽气10min
过硫酸铵 1 g ? 10%过硫酸铵 0.1 ml 0.1 ml 加蒸馏水至10 ml
注:表中Acr:丙烯酰胺;Bis:亚甲基双丙烯酰胺;TEMED:N,N,N′,N′-四甲基乙二胺。贮液置冰箱保存:SDS在低温下析出,使用前微温使溶。贮液N每2周新配1次。
SDS-凝胶电泳采用垂直板型。由冰箱取出的贮液平衡到室温后,按表51-2中10%凝胶的比例混合,混合液置真空干燥器中用水泵抽气10 min后,加入10%过硫酸铵溶液,混匀后立即用细滴管将胶液加到凝胶板模具中。
2、样品的制备
一般是将蛋白质溶解在含20%甘油、1% SDS、1% 巯基乙醇的0.01 mol/L,pH7.2的磷酸盐缓冲液中,在100?加热2,5 min。蛋白质的最后浓度一般为0.5 mg,1 mg/ml。100?加热3 min一般都能使蛋白酶失活,得到满意的结果。
(1)标准蛋白质样品的制备
称取细胞色素C、胰凝乳蛋白酶原A、胃蛋白酶、卵清蛋白、牛血清清蛋白各0.2 mg左右,分别放入小试管中,按0.5 mg蛋白质/1 ml溶液的比例,向样品加入“样品溶解液”,使充分溶解并将离心管盖上,将小试管放入沸水浴中加热3 min,取出冷至室温。
(2)待测蛋白质样品的制备
固体样品的制备与标准蛋白质相同;处理好的样品溶液可在冰箱中保存较长时间,使用前在100?水浴中加热1 min,以除去可能出现的亚稳态聚合物。
3(电泳
将聚合好的凝胶连同制胶模具装置在电泳槽上,拔掉样品梳,用电极缓冲液清洗样品孔,然后将上下电极槽注满电极缓冲液,检查上槽无泄漏,即可加样。
用微量注射器按号向凝胶样品孔内加样,每孔加20 μl(含蛋白质1,5 μg),稀的样品可适量增加其体积。
加样完毕,打开直流稳压电源(负极接上槽,正极接下槽,事先接好),将电流调至50,80 mA(根据凝胶板的横截面积适当调节增减),保持电流强度不变,待染料(染料已事先加在“样品溶解液”中)迁移至距凝胶下端约1 cm处,停止电泳。
4(染色、脱色
将凝胶取出,滑入一白瓷或大培养皿内, 大染料区带的中心插入细铜丝作为标志。加
入染色液,染色1 h左右,倾出染色液,用蒸馏水冼凝胶数次后加入脱色液,数小时换液一次,直至背景清晰。
染色液:0.8 g R溶于160 ml ddHO,再加240 ml甲醛溶液过滤,400 ml R滤液与3502350400 ml 20%乙醇混合即为染色液。
脱色液:200 ml甲醛,60 ml冰乙酸,540 ml HO。 2
(二)血清蛋白质纸上电泳
1(仪器与样品的准备
(1)、将电泳仪(见图51-2)洗净、晾干、放平。然后量取约700,800 ml缓冲液先倒入电泳槽一端,打开中央活塞,使液体通过导管流入另一端,这样可使管中气泡排出,然后再向另一端倒入缓冲液,并使两端液面达到平衡。
图51-2 水平式纸上电泳仪装置
1. 滤纸架;2. 电极;3. 活塞
(2)、血清的准备:将取好的血液放入干燥离心试管中,让其自行凝固,或是用套有橡皮管的玻棒搅拌除去血纤维蛋白,然后离心,上层清液即为血清,置冰箱中保存备用。
2(滤纸的剪裁
用刀片将新华滤纸或Whatman No.1号滤纸,裁成长28 cm,宽3 cm的滤纸条,并按以下规格用铅笔作上正负记号。
3、点样
(1)(原点的位置和形状:对于一个未知样品,初次实验时,应将样品点在滤纸条的中央,观察区带的两极泳动情况,即可选择出点样位置。用血清进行电泳时,样品点在滤纸条靠负极端离心线3 cm处为宜。
样品可点成长条形,或圆点状。一般长条形分离效果较好,但样品很少时,点成圆点,样品比较集中,便于显色。但双向电泳或一向电泳,一向层析结合使用时则必须点成圆点或椭圆点,不能点成长条。
(2)(点样量:随滤纸的厚度,原点的宽度,样品的溶解度,显色方法的灵敏度,样品迁移率的差异而有所不同。样品量过多时拖尾和扩散比较严重,不能获得最有效的分离。样品量太少时,将无法检出(血清蛋白电泳时一般以5 μl为宜)。
(3)、点样方法:可分干点法和湿点法两种。
湿点法:先将滤纸用喷雾器均匀地喷上缓冲液,或将滤纸浸于缓冲液中,浸透后取出,夹在两层普通滤纸中,轻压,将多余缓冲液吸去。缓冲液与干纸重量比为1.2:1,2.5:1。然后架起滤纸,在纸上用点样管将样品画成长条形。注意画线要直,且粗细均匀,造成不可将滤纸画毛,损伤纸面。以湿点法点样品时,点的次数不宜多,因此如果样品浓度较低时,必须事先浓缩。
干点法:将样品点于纸上,待第1次样品晾干,再点第2次。画线必须细直,粗细均匀,直到将所需要的样品全部点完为止。可用吹风机冷风加速干燥,而后小心地用喷雾器将滤纸两端喷湿,有样品处空出,让其缓冲液经扩散而自行湿润。或将滤纸除样品部分外浸于缓冲液中,放置片刻,样品部分靠毛细管作用而湿润,多余缓冲液用普通滤纸吸去。
干点法和湿点各有利弊,干点法虽然在点样过程中起浓缩的作用,但点的次数多时,纸
面容易受损,样品干坏。湿点法虽不宜用作稀的样品,却可保持样品的天然状态。
4、电泳
将滤纸架放于电泳槽中,标有正号的一端应放在正极槽内,负号的一端入在负极槽内。并把滤纸条拉紧,使其成为平面,避免中间下垂。
盖上玻璃盖,关闭电泳槽中间活塞,检查好线路。然后打开电源开关,调整电压到250V左右,并观察或测量其电流数值,记下通电时间。
为了计算迁移率,要用万用电表测量滤纸的有效长度两端的实际电压,记下读数。
5、烘干
通电4,5 h后,关闭电源开关,在滤纸与溶液交界处作上记号(以便测量长度l),然后将滤纸条由滤纸架上了下,分别平插在具有两排细针的木架上放入105?烘箱中烘干15 min。
6、染色
用竹板夹将滤纸条浸入氯化高汞饱和的1%溴酚蓝乙醇溶液中染色10 min。
注意:氯化高汞是剧毒物质,因此使用染色液时,不能用手直接接触染色液。实验后,要将手洗干净才能离开实验室。
7、洗涤
将染色过的滤纸条用0.5%乙酸洗涤3次,每次约用200 ml,浸洗10 min,以除去吸附在滤纸上的颜色。第一次洗涤可在玻璃缸中进行,其余数次可在白瓷盘内进行。在有蛋白质存在的部分即出现有蓝绿色的区带,区带的颜色深浅取决于蛋白质含量的多寡。
8、定量(选作)
将滤纸条放在室温或37?温箱中晾干,测量滤纸的有效长度(l)和原点到各蛋白质区带中心位置的距离(d),以便计算迁移率。然后用洗脱法或光密度计法定量测定各区带蛋白质的含量。
洗脱法:
(1)把分出的蛋白质区带分别剪下,剪成梳状小条放入试管中,加入6 ml 0.01 mol/L氢氧化钠溶液,间歇振荡45 min。或用5 ml 1%碳酸钠的25%甲醇溶液洗脱30 min。然后于520 nm处比色测定溶液的光吸收。
在同一滤纸条上剪下或蛋白质区带同样大小的空白纸条,按上述方法操作,作为空白对照。
根据每种蛋白质洗脱液所测得的光吸收与各种蛋白质光吸收总和之比,可求出各条区带蛋白质的相对百分含量。
(2)将图谱剪成若干条,每条宽3,5 mm,分别以0.01 mol/L氢氧化钠溶液或1%碳酸钠的25%甲醇溶液洗脱后比色。以纸上距离为横坐标,光吸收为纵坐标绘制曲线,然后计算各区带蛋白质的相对百分含量。
光吸收计法:将干燥的纸电泳图谱放入自动扫描光吸收仪(或色谱扫描仪)内,在记录器上自动绘出血清蛋白质各组分曲线图。横坐标为纸的长度,纵坐标为光吸收(或光强度)。每一个峰代表一种蛋白质组分。然后用面积仪测量出各峰的面积。计算每个峰的面积与它们总面积的百分比,就代表血清中各种蛋白质组分的百分含量。或者,将曲线图上的各峰沿曲线剪下,称取各峰的重量,计算每个峰的重量与它们总重量的百分经,也可代表血清中各种蛋白质组分的百分含量。在使用具有电子计算机附件的自动扫描光吸收仪时,可以由数字显示部分或打字带上直接获得血清蛋白纸电泳图谱上每条区带所代表的蛋白质组分的含量。正常人的血清电泳图谱和图形见图51-3。
图51-3 正常人的血清电泳图谱和图形
α为清蛋白;α、α、β、γ为球蛋白。 12
五、实验结果与分析
1、通常以相对迁移率来表示迁移率,相对迁移率的计算方法如下: 用直尺分别量出样品区带中心及铜丝与凝胶顶端的距离(见图51-4),
图51-4 标准蛋白质在SDS-凝胶上的分离示意图
a( 样品迁移距离;b. 染料迁移距离
1. 细胞色素c;2. 胰凝乳蛋白酶原A;3. 胃蛋白酶;4. 卵清蛋白;5. 牛血清蛋白
图51-5 37种蛋白质的MT对数与电泳迁移率作图
蛋白质Mr范围为11 000~70 000。10%凝胶,pH7.2 SDS磷酸盐缓冲系统 以标准蛋白质Mr的对数与相对迁移率作图,如图51-5,根据待测样品的相对迁移,从
标准曲线上查出其Mr。
(1)(计算分离出的各种血清蛋白质的迁移率:测量出滤纸条的有效长度(cm),各蛋白质的泳动距离(cm)。根据实际电压(V),泳动时间(s),计算分离出的各种蛋白质的迁移率。
(2)(计算分离出的各种血清蛋白质的相结百分含量。
个别蛋白质的光吸收值 蛋白质含量%,,100光吸收值总和
实验7 柱层析法分离蛋白质混合物
一、实验目的
学习柱层析法的工作原理和分离蛋白质混合物的基本操作技术。
二、实验原理
凝胶过滤是广泛应用于蛋白质、酶、核酸等生物高分子分离分析的有效方法之一,它是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析方法。此类层析的固相载体是具有分子筛作用的凝胶。目前使用较多的是具有各种孔径范围的葡萄糖凝胶(商品名为Sephadex),其它还有聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Biogel)以及琼脂糖凝胶(商品名为Sepharose)。
葡聚糖凝胶是由一定平均分子量的葡聚糖(右旋糖)和甘油基以醚桥(-O-CH-CH-CH-O)形式相互交联形成的三维空洞网状结构(图52-1)。是一种不溶于水22
的物质。通过控制交联剂环氧氯丙烷和葡聚糖的配比以及交联时的反应条件可控制交联度而获得具有不同“网眼”的凝胶,“网眼”的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。在凝胶中加入欲分离的混合物后,再以同一溶剂洗脱,在洗脱过程中,大分子不能进入凝胶内部而沿着凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外,从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。层析分离过程见示意图52-2。它们可分离的分子量从几百到数十万不等。
O
OCH2CH2
HCHOH O2OHCH2CH2OOOHCHOH2OCH2CHOH O2HOOHOHCHOH2OOOCHO2OHCH2HOOH CH2OHCH2OCHH2OOHOOHCH2OHOOHOHOH
O
OH
图52-1 葡聚糖凝胶的基本结构
图52-2 凝胶层析的原理
A( 小分子由于扩散作用进入凝胶内部而被滞留,大分子被排阻在凝胶颗粒外面,在颗粒之间迅速通过。 B.1. 蛋白质混合物上柱;2. 洗脱开始,小分子扩散进入凝胶颗粒内;大分子则被排阻于颗粒之外;3. 小分子被滞留,大分子向下移动,大小分子开始分开;4. 大小分子完全分开;5. 大分子行程较短,已洗脱出层析柱,小分子尚在行进中。
三、实验器材
1、材料与仪器(层析柱(直径1.5 cm,长65 cm的玻璃管,玻管下端有一合适的胶塞,胶塞中央插一截去庞大端部的输血针头,胶塞上置一与柱内径同样大小的人造丝或尼龙丝填片,内水体积大于100 ml),恒压瓶,部分收集器,紫外及可见光分光光度计,细长滴管,锥形瓶。
2. 试剂。葡聚糖凝胶G200,蓝葡聚糖2000,细胞色素C,0.025 mol/L KCl,0.2 mol/L乙酸溶液,Sephadex G-75或G-100。
四、实验步骤
1(凝胶的选择与处理溶胀。根据预计的总床体积和所用干胶的床体积,计算所需的凝胶干粉的重量,将称好的干粉凝胶放入过量的洗脱液(0.025 mol/L KCl,0.2 mol/L乙酸溶液)中,放置在室温,使之充分吸水溶胀;为了缩短时间,可以在沸水浴上加热将近100?,这样可以大大缩短溶胀时间至几个小时,而且可以杀死细菌或霉菌,可以排除凝胶内部的气泡。
2(装柱。装柱前将溶胀的凝胶减压抽气10 min以除尽气泡,将凝胶上面多余的溶剂倒掉,在层析柱中加入一定量的洗脱液,然后将浓浆状的凝胶一次缓缓加入倒柱中,使之自然下沉,注意颗粒间没有夹杂气泡,最好不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。凝胶沉集后,将溶剂放出,并且再通过2,3倍柱床体积的溶剂使柱床稳定。
3(柱的检验。称取2,3 mg蓝葡聚糖2000溶于0.4 ml 0.025 mol/L KCl,0.2 mol/L乙酸溶液中,等到凝胶床面上的液体快要流干时,用滴管将蓝葡聚糖加到凝胶床面上,注意不要破坏床面。要从床面中央开始加,逐渐转到外围;要避免沿柱壁滴加,以免样品从柱壁滑下(加完后如不够均匀,可用玻棒浅浅地、缓缓地搅动床面)。待其正好流干时再加少量洗脱液,等到快要流干后再加洗脱液,使床面上液体高度不小于3 cm。流速控制在1 ml/2,3 min。注意观察蓝色区带向下移动的情况,如前沿平滑,区带均匀,说明柱是均匀的,可以
使用。
4、加样。待分离样品一般以浓度大些为好,但因为用凝胶分离的物质多为Mr较大的物质,浓度大时,溶液的粘度也随之变大,粘度过大也会影响分离效果,因而要照顾到浓度与粘度两个方面。分析用量一般100 ml床体积为1,2 ml(1,,2,),制备量一般100 ml床体积为20,30 ml左右。将柱中多余的液体放出后,将样品溶液小心地加到凝胶柱上,打开管夹,使样品溶液流入柱内,然后加入洗脱液进行洗脱。将1,4 ml蓝色葡聚糖200,细胞色素C混合液上柱。
5、洗脱。洗脱用的液体应与浸泡膨胀凝胶所用的液体相同,否则由于更换溶剂,凝胶体积会发生变化而影响分离效果。流速与洗脱液加在柱上的压力(由液面差造成)有关,加压超过一个极限值时,不仅不能增加流速,反而使流速急剧下降。流速对交联度大小不同的凝胶是不同的。对交联度大的凝胶(G-10至G-50型),流速与柱的压力差成正比,与柱长成反比,与柱的直径无关;对交联度小的凝胶,(G-75至G-200型),流速与柱的直径有关,并在一定的操作压下有最大的流速(操作压示意图见图52-3)。流速也受颗粒大小的影响,颗粒大时流速大,但是流速大时洗脱峰形常较宽,颗粒小时流速较慢,分离情况较好。样品流入凝胶时,用0.025 mol/L KCl,0.2 mol/L乙酸溶液洗脱,流速控制为3 ml/10 min,3 ml/管,用部分收集器收集,蓝色葡聚糖以及细胞色素C的洗脱峰可以根据颜色判断。
图52-3 各种层析柱装置的操作压(或静水压)
A和B. 操作压等于柱或贮液器内液面和出水接管末端的高度差;C和D. 压力的大小是由恒压瓶内空气入口管的底部至出口接管末端的高度计算,下向(C)或上向(D)流动无关重要。
6、检测。每10 min收集一管,然后在280 nm波长下测出溶液的吸光值。
五、作业
画出A-T洗脱曲线。