【doc】口腔鳞癌组织中人乳头瘤病毒16型的原位杂交研究

【doc】口腔鳞癌组织中人乳头瘤病毒16型的原位杂交研究 口腔鳞癌组织中人乳头瘤病毒16型的原位 杂交研究 386JournalofOralScienceResearch,Aug2004,Vol20,No.4 口腔鳞癌组织中人乳头瘤病毒16型的原位杂交研究 杨成丁涛 (1.华中科技大学同济医学院附属协和医院口腔医学中心 东耀峻 湖北武汉430072;2.武汉大学口腔医学院) [摘要]目的:探讨HPV16一E6基因在口腔粘膜白斑,口腔鳞状细胞癌组织中的表达及其在口腔鳞癌发生,发展 过程中的意义及分布特征.:应用地高辛标记的HPV16一E6的寡核酸探针分别对口腔鳞状细胞癌组织,口腔 粘膜白斑组织,宫颈癌组织及正常组织中进行原位杂交,以检测各组织中HPV16型的DNA表达和分布情况结 果:口腔鳞状细胞癌组织HPV16阳性率46.67%;口腔粘膜白斑组织阳性率60%HPV16E6基因阳性信号集中分 布于癌细胞胞核中.结论:原位杂交方法可用来检测OSCC组织中HPV16型DNA的存在并能准确组织定位;较高 的阳性率进一步支持高危型HPV16型的感染与口腔鳞状细胞癌的发生有关;在癌前病损组织中的高危型HPV16 的检率高于口腔鳞癌组织,HPV在口腔鳞癌发生的早期阶段可能具有致癌作用. [关键词]口腔鳞状细胞癌原位杂交乳头瘤病毒人 [中图分类号]R739.85[文献标识码]A[文章编号]1671—7651(2004)o4—0386—03 DetectionofHumanPapillomavirus16E6geneofOralSquamousCellCarcinomasbyInSitu Hybridization. YANGCheng,DINGTno,DONGYao-jung.OralMedicalCentureofUnionHospital,rong~ MedicalCollege,HuazhongU- niversityofScienceandTechnology,Wuhan430022 [Abstract]Objective:TodetecttheexpressionofHPV16E6onoralleukoplakiaandoralsquamouscellcarcinomaandex— ploreitssignificanceduringthedevelopmentandprogressionoforalsquamouscellcarcinomaanditscharacteristi(.ofdistri— bution.Methods:Usingdigoxinlabelledhumanpapillomavirns(HPV)16probesandhybridizationinsitutet'hniqueto detectexpressionofHPV16E6geneinOSCCandOLktissuesanditspositivesignaldistributiononthesetissues.Results: Theresultsshowedthatthepositiveratiowas46.67%inOSCC,60%inbeginorallesionsandl00%incervixcancer,no caseofnormaltissueswaspositive.Thosepositivesignaldistributeinnucleolus.Conclusions:Itwassuggestedthathy— bridizationinsitutechniquecandetectHPV16E6geneandpreciselylocationinnucleolus;Inthesametime,HPV16E6 genemaybecloselyrelatedwiththecauseofOSCCespeciallyinearlydevelopmentofOSSC. [Keywords]SquamouscellcarcinomasInsituhybridizationPapillomavirnsHuman 口腔鳞状细胞癌(OSCC)是口腔颌面部最为常 见的恶性肿瘤,占口腔颌面部恶性肿瘤的80%以 上,外科手术往往造成患者面部毁容及功能障碍. 随着分子生物学技术的发展和应用,国内外不少学 者做了关于HPV与口腔鳞癌的研究?J.他们应 用点杂交,原位杂交及免疫组化方法,PCR及rtPCR 等方法,已证明HPV在口腔病变组织中异常表达. 本文采用原位杂交方法检测正常口腔黏膜,口腔白 斑(oralleukoplakia,OLK)和口腔鳞状细胞癌(oral squamouscellcarcinoma,OSCC)组织中的表达和分 布特征,探讨其与口腔鳞癌发生,发展之间的关系, 为进一步研究高危型HPV16型的致癌机理筛选病 作者简介杨成(1965一),男,湖北人,副教授,主要从事口腔颌面 部肿瘤的研究. 通讯作者杨成.电话:(027)85726167 例作准备. 1材料与方法 1.1标本收集来源于华中科技大学同济医学院 医院附属协和医院口腔科手术切除的30例OSCC, 20例口腔粘膜白斑,30例正常的口腔粘膜组织及2 例宫颈癌组织.所有标本经10%甲醛固定,石蜡包 埋,HE染色,切片均经病理证实为鳞癌. 1.2探针制备HPV16型基因片段根据NuovoGJ 的:碱基序列为5'一CA1丫rACAATA1丫rGTA- ACCTITI'GTI'一3'和5'一TAGACATFATFGTrAT— AGT1Tr一3',并在3'端尾段用地高辛标记,由上海 申友生物工程有限公司定做. 1.3原位杂交试剂原位杂交的试剂从武汉博士 德生物工程有限公司订购.实验步骤及注意事项严 格按试剂盒说明进行. 1.4对照组设计经病理证实且多次实验证实 口腔医学研究2O04年8月第20卷第4期 圈1正常粘雕上皮,细胞核中无阳性信号 DAB法显乜.14E复染.×200 围2口腔磷状ceil癌组织中细胞}窭中呈现 出此兰色阳性信号DAB法显色.HE 复染.×4(Xl HPV16一DNA阳性的宫颈癌组织切片作为阳性对 照;正常组织为阴性对照组. 1.5判片400倍的显微镜下观察染片,每片 选5个视野判读并依核染色个数计分,计算均数,用 SPSS软件方差分析,P=005. 2结果 HPVI6DNA阳性表达定位于口腔鳞癌,口腔牯 膜向斑和官颈癌组织的细胞核内,呈深紫蓝色.集中 分布于细胞的饱核中.分别见图1,图3. OLK组织中HPV16DNA的表达阳性率为 60%,高于OSCC组织中的HPV16DNA的阳性率 46.7%.阳-性反应产物呈紫蓝色并集中位于口腔鳞 癌细胞胞核中.OSCC和宫颈癌中阳性信号的密度 分布计分明显高于OLK中的表达,且具明显的有统 计学意义,P<0.05另外,宫颈癌中的阳性信号的 密度分布计分高于OSCC,也具有统计学意义.P< 0.05结果见表1. 裹H?占差昆高焉薹墨器;暑嚣癌,口腔粘胰 注:A正常组织B口腔粘睦白斑,c口腔鳞癌,D官颈癌B:c ?P<0.05:C【】.?P(0.05 3讨论 HPV(humanpapillomavirus)是一类重要的致瘤 病毒,其感染具有嗜鳞状上皮特性目前已知的 HPV约有100多种亚型,其中某些型别的感染与人 类某些良一性或恶性上皮肿瘤的发生密切相天,主 要分为低危型(例如HPV6/11)和高危型(例如 HPV16/18)两大类一般认为低危型HPV感染与 某些良性上皮性肿物的发生有关,高危型HPV感染 围3口腔粘臃白斑中蛔胞核中出现觜兰色 阳性信号DAB法显色,HE复染,× 400 与某些恶性肿瘤的发生有关.口腔鳞状细胞癌是口 腔颌面部最为常见的恶性肿瘤,但是其病因仍不很 清楚.自1985年首次在口腔鳞癌中发现H1 DNA,以后不同的学者应用不同方法研究证实口腔 鳞癌患者HPV感染率有差异,从24%至77%不 等,这可能与所采用检测方法不同或不同地区人群 差异性有关近年来,MillerCS等对1980,1998 年间在Medline上以英文发表的有关HPV与口腔鳞 癌关系的文章进行Meta分析,结果显示口腔粘膜 HPV阳性率为l0%.而口腔鳞癌为46.5%,口腔 癌中高危型HPV(16,18)的检出率是低危型(6, 11)的2.8倍.其研究结果显示HPVI6感染与口 腔鳞癌的发生存在相关关系.文中应用Meta定量 分析显示其合并优势比为6.81,也即感染HPV16 后导致口腔鳞癌发生的危险性是未感染者的6.8l 倍.以上的结果显示HPVI6感染具有较高的口腔 鳞癌发生的危险性,虽然该研究并不能说明HPV是 口腔鳞癌的病因,但分子生物学的研究以及本研究 的结果显示HPV16是口腔鳞癌的致癌因素.Sugiy- amaM等运用PCR法检测了HPv16/18DNA,其 结果:在异常的上皮细胞中HPV检出率为31/51 (60.78%),高于口腔鳞癌的30/86(34.88%),其结 果证明HPV16在早期的口腔鳞癌发展阶段的致癌 作用.作者应用Dig标记的HPV16DNA探针进行 原位杂交.在30例OSCC组织中HPVI6DNA阳性 14例(4667%);20例口腔粘膜自斑组织中 HPV16DNA阳性12例(6o%),这与SugiymrmM等 人的研究有一定的相似之处. 另外,我们从阳性信号在病理切片组织中的分 布密度计分统计结果来看:OSCC组织中阳性信号 分布密度明显高于OLK组织,且具有统计学意义 这是否说明了:HPV与细胞核发生整合后,其转化 388JournalofOralScienceResearch,Aug2004,Vol20,No.4 能力和复制能力大大增强.有关HPV的分子生物 学的研究指出:依据其功能不同分为三区:早期 区(E),晚期区(L)和非编码区(URR).E区编码 E1,E2,E4,E5,E6和E7六个早期蛋白,主要与转化 有关.L区编码IJl和L2两个衣壳蛋白,URR区可 调节基因转录.研究表明:E6蛋白主要与p53结 合,导致细胞转化.而E7蛋白主要与Rb蛋白结 合,使细胞永生化.而我们的实验结果是否正好能 从宏观的角度解释我们的结果:E6蛋白在口腔粘膜 白斑(癌前病损,作为口腔鳞癌的早期阶段)扮演着 重要的角色,即E6蛋白起到早期的转化作用.而 E7蛋白在转化的后期使细胞永生化后,从而使癌细 胞失控后过度表达的结果.因而,病理图片上反映 出:口腔鳞癌组织中E6蛋白的表达率明显高于口 腔粘膜白斑. 从我们的结果可以得出:原位杂交技术敏感性 较高,特异性强,尤其能定位特异性核酸分子序列在 组织中的位置,这为探讨HPV感染与OSCC发生的 关系提供了新的手段;并进一步支持高危型HPV16 感染与OSCC的发生与发展关系密切同时也说明其 在OSCC的早期阶段可能起到了一定的致癌作用. 参考文献 ,曹俊,陈万涛,等.El腔鳞状细胞癌高危型人乳头状瘤 [1]帕提曼 病毒感染的检测.上海口腔医学,2000,9(4):212—215 [2]布静秋,庞劲凡,钟梅,等.口腔鳞状细胞癌与人乳头瘤病毒感 染的相关性研究.解放军医学杂志,2000,25(6):447—449 [3]GhasaqAI—Bakka1.Humanpapillomavirustype16E6geneex? pressioninoralexophyticepitheliallesionsasdetectedbyinsitu rtPCR.OralSurgOralMedOratPatho1.1999,87(2):197—208 [4]NuovoGJ,editor.PCRinsituhybridization:protocolsandappli- cations.NewYork:RavenPress,1994:169—349 『5]PalefskyJM,SilvermanSJr.Abdel—SalaamM,etal:Association betweenproliferativevermeousleukoplakiaandinfectionwithhu- manpapillomavirustype16.JOralPatholMed,1995,(24):193 [6]MillerCS,JohnstoneBM.Humanpapillomavirusasariskfactor fnroralsquamouscellcarcinoma:Ametaanalysis,1982—1997()? ralSurgOralMedOralPatho1.2001,91(6):622—635 [7]SugiyamaM,BhawalUK.Detectionofhumanpapilloma~ires一16 antiHPV18DNAinnormal,dysplastic,antimalignantoralepithe- lium.OralSurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod,2003,95 (5):594—600 [8]IshijiT.Molecularmechanismofcarcinogenesis1)humanpapillo- mavirus一16.JDermato1.2000.27(2):73—86 [9]MoustafaAE,FoulkesWD.E6/E7proteinsofHPVtype16anti ErbB一2cooperatetoinduceneoplastictransformationofprimary normaloralepithelialcells.Oncogene,2004,15,23(2):350—358 [收稿日期:2004—03—16](本文编辑汪喻忠) 亚历山大直丝弓矫治技术(AlexanderVSD) 学习班及Typodont模拟矫治训练班通知 由武汉大学口腔医学院主办,香港杨氏牙科器材有限公司协办,美国Ormco公司赞 助,将邀请Alexander教授于2004年 l0月28—30日来华亲授亚历山大直丝弓矫冶技术,并从美国携AlexanderTypodont 模拟颌架来汉,亲自指导其模拟矫治训练 (学员人数控制存30人,按回执顺序安排).参加学习班的学员,将获得国家级继续教育I类学分l0分,同时获赠中文版"亚 历山大直丝弓矫治技术"等着(2001年版)一本(价值人民币168元).有关事宜通知如下:1)学习班时间:2004年l0月2813 , 30日(共计3天).2)报到时间:2004年l0月27日全天.3)报到地点:武汉大学口腔医学院正畸科.4)报名方式:?网上 报名邮箱地址:orthowhu@163.con.?电话报名:027—87165166或027—62772761.?信件报名:武汉市洪山区珞瑜路237 号武汉大学口腔医学院正畸科赵英利.5)会务费:仅参加l0月28,29日学习班者:500人.参加学习班及l0月30日Ty- podont模拟矫治训练者:800人.6)住宿:学习班可帮助联系住宿,120,1802人/标准间.7)交通方法:武昌火车站 乘66,518,538公汽至广埠屯,汉口火车站乘715,536至广埠屯. 亚历山大直丝弓矫治技术学习班及Typodont训练班回执(复印有效)