CTL,NK和LAK细胞对腺病毒感染细胞的细胞毒作用

CTL,NK和LAK细胞对腺病毒感染细胞的细胞毒作用 CTL,NK和LAK细胞对腺病毒感染细胞的 细胞毒作用... II电蛙学录.】旃7踅第6崩 CTL,NK~I:ILAK细胞对腺病毒感染细胞 的细胞毒作用的实验研究 欧阳毅陈远耀尹鸿轸(白求恩医科大学病理解剖教研室) [摘要]以cr标J~Hela细胞和Lcr标记感染腺病毒的Hela细胞为靶细胞}以瞧病毒fAdv 致敏的特异性杀伤性T淋巴细胞(CTL),1L:诱导的淋巴因子诱导杀伤细胞1LAK)和自然杀伤细胞 (NK)为效应细胞,进行了细胞毒实验.结果再扶显示,腺病毒诱导的特异性CTL对感染腺病毒的宿上 细胞有明显的杀伤作用,韭证毗NK细咆亦有该作甩,CTL相比,其作用较弱,而LAK细胞对Hela 细胞有杀伤作用,与Hela细胞是否感染腺病毒无*. [关键词]杀伤性T细胞}淋巴因子诱导的杀伤细胞;自然杀伤细胞j腺病毒 自1982年本教研室提出瞧病毒肺炎免疫损伤假 说以来,鬟们开展了腺病毒特异性杀伤性T淋巴 细胞的研究,证明CTL细胞对腺病毒感染的Hela 细胞有明显的杀伤作用I!该实验研究还发现,在 实验初期f4小时)存在一种非腺病毒特异性的细 胞毒作用,由于该实验采用的效应细胞即腺病毒特 异性CTL细胞群中,含有NK(自然杀伤细胞) 及LAK(淋巴因子诱导的杀伤细胞;I,因此考 虑这种非特异性的细胞毒作用为NK和/或LAK 所致.为进一步阐明腺病毒特异性CTL,NK及 LAK时腺病~Hela细胞的细胞毒作用.巾实验 以腺捕毒体外致敏的CTL,IL2体外诱导的LAK 细胞及NK细胞作为效应蜊胞分别进行r细胞毒实 验,现将结果报导如下 材料与方法 一 ,效应细胞的制备 手术切除的人扁桃体,95%酒精谩泡消毒2, 3分钟,用IMDM完全培莽液(含10小牛血清, O.2单位/mI陡大霉荣,IMDM为美国GIBcO 公司产品)冲洗2,3遍,剪成小碎块,再冲洗2 攻,在铜网上磨碎成细胞悬液.加培捧液,l5111) 转/分离心,反复3次,用HankS液配成细胞怂 磕,加等量Ficoll—Conray液,分离辩巴细胞, 经胎盘兰染色证明细胞存活率为95以上.用完全 培养蔽调至4×10/mI浓度的细胞悬液,分别 加入到玻璃培养瓶中,每瓶10mI.37C,5 COz培养2小时,待巨噬细胞贴壁后,将怂浮细胞 全部抽出,辅至细胞浓度为4×107/mJ,经两 次尼龙毛过挂,获得T辩巴细胞,接4×10’/mI 浓度重新加入含有巨噬胞的啄培养瓶中然后将 它们分为三组,第一组培养细胞中加入2o倍TCID5 的灭活?型腺病毒(紫外线照射2小时)作抗原, 并按l:4体积加入粗制1L2,37?,5”CO2继 续培养至第五天,汁细胞存活毕,以此获得体外腺 病毒诱导的特异性CTL.第二组按l:4体积加 入粗制的[L21?,37?,5%CO2培养.第五天计 存活率,获得IL诱导的LAK细胞.第三组中不 加任何诱导物即不加Adv抗原,也不加IL2,故只 存在NK细胞,同样培荐至第五天. 二,靶细胞的制备 生长旺盛的Hela细胞待生长为单层时,加入舯 倍TCIDsoJll型腺病毒,此为感染瞧病毒的Hela细 胞,感染12,b时后,全部取出}再取生长旺盛的搜 有感染腺病毒的Hela细胞,两者分别用完全培养液 配成l×10/mI浓度,在上述两种靶细胞各lmI中 加入10OlJCiNaCrO4(中国科学院原子能研究 所产品),轻轻充分混匀后置37?水梧孵育l小时, 每l5分钟混匀一次.然后用培养液分别洗三次,井 配成2×10/mI,以0.4胎盘兰染色幢查存活 率达95以上. 三,测定方法 实验分8组,包括腺病毒感染Hela细胞自然 释放管}CTL,LAK,NK对腺病毒巷染Hela细 胞细胞毒作用测定瞥;单纯Hela细胞自然释放管 CTL,LAK.NK对单纯Hela细胞细胞毒作用冽定 管.每组设四复管.效应细胞和靶细胞比例为40: l,各管按1加入各成分将上述各管充分混匀 后,1O00转/分离心2分钟,置37”C水褡孵育l0小 时,届时以1500转/分离心5分钟.吸出O.ml 上,’|r!竹?j?,用片型闪烁I1数器分别测定0.5 m1上精与余O.5mI(台细胞机淀)的cpm值 各管s,cr释放器n.: 0.5mI上~cprrix2 四,汁算方法0.5m【上请cpm+余0.5mIcpm 麦lCTL,LAK,NK细胞毒测定方浊 ×1007 结果 以?型隙病毒体外诱导的特异性CTL,IL2体 外诱导的LAK和NK细胞为效应细胞,单纯Heia 细胞和盛染m型腺病毒的Hela细胞标记Cr为靶 细胞,效应细胞攻击靶细胞后,靶细胞裂解,释放 Cr,根据释放到培养上清和底物存留的tCrcpm 值来计算每组细胞的’Cr释放率.从而判断三种效 应细胞杀伤靶细胞的毒性作用.各组Cr释放率见 表2. 从表中可看出: 1.腺病毒特异性CTL加腺病毒巷蛰Hela细胞组 的cr释放率最高,为38.64?3.40,与其他组相 比,P<0+0l,有极显着的差异,说明CTL对感染 腺病毒的Hela细胞有明显杀伤作用. 2.LAK细胞加腺病毒感~FIela细胞组的SlCr 释放率为l6.17?1.56,LAK加单纯Hela细胞组 的’Cr释放率为l4.43?0.72,两蛆P>0.05,无 明显差异,但均明显高于He|a细胞组?cr自然释 放率(3.54?0.70),P<0.Ol,说明LAK能攻 击肿埔性的Hela细胞,与Hela是否感染腺病毒 关系不大. 3.NK细胞加单纯Hela组的”Cr释放率仅为 4.80?1.o9,与Hela的Cr自然释放率接近,P >0.05,说明本实验NK细胞对于HeJa细胞无明 显攻击作用.但是NK细胞加感染腺病毒的Hela 组的’Cr释放率却商达l7.93?1.19,与上两蛆比 P<0.0l,说明-K细胞对感染腺病毒的Hela有 杀伤怍用,与C’lL相比,其伤杀能力较嚣 讨论 奉研究利用,LCr同位索释放法再次证明了腺病 毒致敏的特异性CTL对腺病毒感染的He】a细胞有 明显的杀伤作用,并首次证实NK细胞也有相同作 用,但其作用较弱.上次研究已说明1,NK细胞 的杀伤怍用不象CTL那样具有腺病毒的型特异性 此外本实验结果还证实,LAK细胞对肿窟性的Hela 细胞有杀伤作用,Hela细胞是否感染腺病毒韭无 明显差别 应该提出,本实验的CTL,LAK及NK均未纯 化,与上次实验”一一样,CTL细胞群中也含有LAK 细胞厦NK细胞.由于本实验已排除了LAK细胞 对感染腺病毒的Hela细胞的杀伤作用,韭证实NK 细胞对感染腺病毒的Hela细日包的杀伤作用.井证 实NK细胞对感染腺病毒的HeJa细胞的细胞毒作用要比 CTL组小得多,因此CTL车身对感染腺病毒Hela 细胞的杀伤作用是完全能够肯定的.由此,我们不 难看出,乖实验结果是对我们以往实验结论l’的有 益补充,为以往实验中出现的非特异性细胞毒作用 找到r原因,即是由NK细胞对感染Adv的HeIa 细胞和LAK细胞对Hela细胞二者的毒性作用造成 的 众所周知,参与机体细胞免疫的活性细胞包括 巨噬细胞,ADCC中的K细胞,CTL,NK,LAK 和弓l起迟发型变态反应的Td?吨h—I.这些作用有 利于清除细胞内的病毒,同时卫可造成感染病毒的 宿主细胞的损伤.奉实验进一步证实了CTL与NK 细胞对感染腺病毒的Hela细胞具有杀伤作用,也就 为腺病毒感染的免疫损伤机理再一次提供了直接证 明. 本实验中NK细胞对单纯He]a细胞的细胞毒 作用不明显,这同其它人的研究结论不相一致I, 是否由于方法上的原因所造成,还有待进一步研究 证实.此外怍为抗原的腺病毒悬蔽中有Hela细胞 成份存在,Hela细胞成份有可能致敏cTL,导致 He]a细胞特异性的cTL的细胞毒作用.本实验结果 显示,致敬的CTL细胞群(包含有LAK细胞)加 单纯Hela细胞的ICr释放率监不比LAK细胞加单 纯Hela细胞的高,可见Hela细胞特异性的CTt的 细胞毒作用很小或不存在,可能由于对人T细胞来 说,Hela细胞的抗原性是很弱的. 从方法学上,对CTL的细胞毒实验测定方法常 用的有染色法及同位素释放法I…II.我们分别用两 种方法进行了CTL细胞毒实验,结果是肯定的.形 态学方法需观察大量细胞,比较繁琐,而且要求效 应细胞和靶细胞在形态上有较大差别(我们的实验 中淋巴细胞要比Hela细胞小得多),此外还应采取 双盲浊扑际viiIedauIoig0us humanpeript’eralbl0odlympt’ocyte,JExpMed, I982,155:l823 4,扬贵贞,等.免症话性细胞的效应.北京:科学出版祉, i986. 5.Dal1egriF,eIaJ,JcJinlab[ramuno1.1984.15: 35. 6,叶世豢.等,实变态厦应学.北京:人民卫生出龋仕. 1987~ 7.HerbermanRB{lnnaIura1celJreediatedin1rnl1. niIYalgallistIum0rsedltedbyHerbermanRB AcademicPre5s.NeYork1980. 8.李桎枝,尹廷贵.淋巴因f融话舶杀伤细胞—LAK细 胞.目外医学免痤学丹册,l986,9:285. 9,束炳法,等.,~lltela钿胞测定NK与ADCC括性的初步 探讨.中华微生物学和免疫学杂志,1983,3(2);120. 10.SchiagerSIandAlUmsAC.UseofDyesal1d Radi0isofopicMarketsinCyt0xicitYTests. MethodinEnzy~nology.1983,93:233. 1t.向志敏,等.医学病毒学.上海t上海科学技术出版社 l9帅. ~|991年1月嘘幅] [编辑荣杰)