抗水牛伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗原单克隆抗体的研制

抗水牛伊氏锥虫变异面糖蛋白抗原单克隆抗体的研制 抗水牛伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗原单克 隆抗体的研制 ?72?生物技术巾国畜牧兽医2009年第36卷第1O期 抗水牛伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗原单克隆抗体的研制 曾晓飞,陈汉忠,韦英益,何木荣,李晓栩 (广西大学动物科技学院,南宁530005) 摘要:用纯化的伊氏锥虫变异表面糖蛋白(variantsurfaceglucoprotein,VSG)免疫BAIB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与 SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过3次克隆和间接EIISA方法筛选,获得3D7,5B92侏稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞 株,用间接ElISA方法检测杂交瘤细胞培养液上清效价和小鼠腹水效价,其巾细胞培养上清效价分别为l:6400和1: 12800,腹水效价分别为l:10和1:1O.单抗的亚型鉴定结果表明,3D7,5B9分泌的抗体都为Ig(;1亚类链. 关键词:变异表面糖蛋白;伊氏锥虫;单克隆抗体 中图分类号:$859.79文献标识码:A文章编号:167卜7236(2009)10007203 伊氏锥虫是一种流行广泛的血液寄生虫,分布 于非洲,亚洲,南美洲和欧洲的部分地区,中国主要 分布于长江中下游,华南,西南和西北20多个省市 自治区,主要由吸血昆虫传播,马蝇和牛虻是传播伊 氏锥虫的重要媒介.引起牛,马,驴,骆驼等动物严 重的伊氏锥虫病,又称苏拉病.大多数动物感染伊 氏锥虫后可造成急性死亡或隐性感染.出现贫血,进 行性消瘦,死胎,流产,泌乳减少等症状(Onah等, 1999),给畜牧业特别是养牛业生产造成重大经济损 失,因此及时准确地诊断伊氏锥虫显得十分重要. 伊氏锥虫细胞表面覆盖着一层致密的,厚度为 12,15nm的糖蛋白(Vickerman,l969).锥虫的抗 原变异就是这层变异表面糖蛋白(variantsurface glucoprotein,VSG)引起的,变异表面糖蛋白完全位 于表膜之外,对表膜有异常的固定作用.VSG通过 糖基磷酸肌醇钩联于细胞膜,在膜上的VSG称为膜 型VSG,脱下来的VSG称为可溶性VSG,膜型 VSG被内源性磷醋酶C裂解后,转变为可溶性 VSG.VSG是一种保护性抗原.本研究以伊氏锥 虫湖北水牛株的VSG可溶性抗原为免疫原,建立抗 伊氏锥虫VSG可溶性抗原的杂交瘤细胞系,旨在为 水牛伊氏锥虫提供敏感,特异,快速的诊断方法. 1材料与方法 1.1细胞及试验动物SP2/0骨髓瘤细胞由广西 大学动物科技学院预防兽医学寄生虫保存, 收稿日期:20090317 作者简介:曾晓飞(1983一),男,江西人,硕士生,研究方向:动物 寄生虫分子及免疫学. 通信作者:陈汉忠.E—mail:chenhanz211@sohu.COFll 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30660140);广西教育厅 科研项目(200620). BALBc小鼠购自广西医科大学实验动物中心. 1.2主要试剂DE52为Whatman公司产品,弗 氏完全佐剂,弗氏不完全佐剂,HAT,HA选择培养 基均为Sigma公司产品;DMEM培养基为HyClone 公司的产品;HRP标记羊抗鼠IgG购自联科生物有 限公司;胎牛『I?清购自杭州四季青生物T程材料有 限公司;GENMED聚乙二醇细胞融合试剂盒购自 上海杰美基因医药科技有限公司;HBT鼠源性单克 隆抗体亚型测定试剂盒购自HyCuhBiotechnology b.v.公司. 1.3抗原的制备与纯化将广两大学动物科技学 院预防兽医学寄生虫实验室保存的伊氏锥虫优势变 体HbTat1.18(何木荣等,2008)复壮,增殖后,经过 DE一52纯化后伊氏锥虫虫体加入锥虫裂解液(50 mmol/LNa—HEPES,2.5mmo[/IEDTA,2mmol/ IEGTA,200~mol/ITLCK,400txmol/IPMSF, 10umol/ILeupeptin,1t2mol/LPepstatinA)和 0.3mmol/IZnC1,冰浴条件下裂解,待虫体裂解 完全将裂解液在114000g下离心1h,沉淀溶解于 含0.2TritonX一100的PBS中,然后超声波裂解 3次;接着加人DTT和EDTA,37?孵育15min; 再在4?条件下114000g离心30rain,取上清过滤 除菌,SDS—PAGE.测定浓度,分装,一2O?保 存备用. 1.4动物免疫选取6周龄雌性BAIB,/c小鼠, 用100gVSG与等体积弗氏完全佐剂充分混合 后进行腹腔及背部多点注射免疫,15d后用1O0 /xgVSG与等体积弗氏不完全佐剂充分混合后进 行腹腔注射免疫,之后每隔15d免疫1次,免疫2 次,剂量方法同二免.融合前3d尾静脉注射50 /xgVSG加强免疫. 中国畜牧兽医2009年第36卷第1O期生物技术?73? lI5细胞融合免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞以 10:1于50mL离心管内混合,按GENMED聚乙 二醇细胞融合试剂盒说明书进行融合,融合后加人 HAT培养基将融合后的细胞悬浮,将细胞悬液加 入铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中,置37?, 5CO培养箱内培养. 1.6阳性杂交瘤细胞的筛选用VSG为抗原建立 问接EIISA方法,方阵滴定法确定抗原的包被量. 将筛选的阳性杂交瘤细胞用有限稀释法进行多次克 隆,直到所有的孔都为阳性为止,将经多次传代后能 稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株扩大培养后冻存于液 氮中. 1.7单克隆抗体腹水的制备选取10周龄的 BAIB/e小鼠,每只腹腔注射0.3mI弗氏不完全佐 剂,1周后注入l0.个杂交瘤细胞于小鼠的腹腔,7 , 10d后待小鼠腹腔极度膨胀后收集腹水,5000r/ min离心10min,一2O?保存备用. 1.8单克隆抗体效价检测利用已建立的间接 ELISA方法检测杂交瘤细胞培养液上清效价和小 鼠腹水效价. 1.9单克隆抗体的亚类鉴定采用HyCultBio— technologyb.v.公司的HBT鼠源性单克隆抗体亚 型测定试剂盒鉴定单抗亚类,按说明书方法操作. 1.10抗体分泌稳定性的测定液氮冻存的杂交瘤 细胞复苏后连续传代2个月,分别取第5,1O,2O, 3O,4O,50,60天的杂交瘤细胞培养液上清用间接 ELISA方法测定其抗体效价.以SP2,/0细胞培养液 为阴性对照. 2结果 2.1纯化VSG蛋白浓度的测定和SDS—PAGE分 析经过分离纯化的VSG,测定其D..和Dzso 值,按下列公式计算蛋白质含量:蛋白质浓度(rag/ mL)一(1.55×A28.一0.76×A..)×稀释倍数 : 2.61mg/mL,进行SDS—PAGE分析,结果见图 1.由图1可知,在63.5ku处目的带清晰可见,说 明获得了较纯的可溶性VSG. 2.2杂交瘤细胞的制备及筛选小鼠脾细胞和 SP2/0细胞融合于6块96孔细胞培养板,结果有 527个孔有融合细胞生长,融合率为91.49%.经过 问接EIISA方法检测,其中101孔呈阳性,阳性率 为l9.17.经过选择培养,抗体检测,筛选和3次 克隆后,克隆孔阳性率达100,最终获得2株稳定 分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为3D7和 5B9 ku 116.O—?r 66.2? 45.O—? 35.O—+ 25.0+ 图1伊氏锥虫VSGSDS-PAGE分析 注:l,蛋白质Marker;2,提纯的VSG. 2.3单克隆抗体效价的测定经间接EIISA方法 测定3D7和5B9杂交瘤细胞培养液上清效价和小 鼠腹水效价,结果见表1. 表1杂交瘤细胞培养液上清效价和腹水效价 2.4单克隆抗体的亚类鉴定采用HyCultBio technologyb.v.公司的HBT鼠源性单克隆抗体 亚型测定试剂盒鉴定单抗亚类,结果显示,3D7, 5B9杂交瘤分泌的抗体都为IgGl亚类,轻链均 为链.其中5B9杂交瘤分泌抗体的亚型鉴定 结果见图2. 图25B9杂交瘤分泌抗体的亚型鉴定结果 2.5抗体分泌稳定性的测定将液氮冻存的杂交 瘤细胞复苏后连续培养6Od,分别取5,10,20,30, 4O,50,60d的培养液上清,分别用ELISA方法检测 ?74?生物技术中国畜牧兽医2009年第36卷第lO期 各个单克隆抗体的效价,结果表明,各批次的抗体效 价基本一致. 3讨论 伊氏锥虫病早期无特异临床症状,临床诊断比 较困难.在宿主外围血液或体液中检出虫体虽然准 确可靠,但慢性感染时虫血症水平低且波动显着,常 规的镜检法检出率低.目前检测伊氏锥虫主要有检 测抗原的PCR诊断法(王云飞等,1998)和检测抗体 的血清学诊断方法(Reid等,2003),PCR诊断伊氏 锥虫虽敏感性高,但往往血液中其他生物材料容易 对试验造成污染,造成假阳性结果,而广泛使用检测 抗体的血清学方法,但不能区分现症感染和既往感 染(Luckins等,1978),于是探索检测伊氏锥虫循环 抗原方法意义深远.VSG是伊氏锥虫暴露于体表 的唯一抗原结构,新生VSG分子大约由500个氨基 酸残基组成,成熟VSG分子C末端的氨基酸残基 具有高度的保守性.VSG为伊氏锥虫的保护性抗 原,具有良好的免疫原性,所以VSG是制备检测抗 体的首选抗原.锥虫VSG的提取方法有多种,本试 验参照Dietmar等(1998)介绍的方法稍加改变,通 过混合蛋白酶抑制剂结合超高速离心逐级提取膜蛋 白的方法成功提纯了伊氏锥虫的VSG,结果所提取 的伊氏锥虫湖北水牛株的VSG经SDS—PAGE电泳 分析,在约63.5ku处有1条条带,表明所提取的 VSG较纯. 本试验用提纯的伊氏锥虫VSG可溶性抗原采 用多点皮下注射和腹腔注射的方法免疫BALB/c 小鼠,取得了很好的免疫效果,说明免疫方法和免疫 程序是可行的.杂交瘤细胞克隆化培养过程中观察 到,没有饲养细胞的培养孔中,杂交瘤细胞也可以生 长,但状态不佳;饲养细胞较多的培养孔中,杂交瘤 细胞生长状态较好,得到的培养液上清的效价更高, 说明饲养细胞在细胞融合中的作用是不可忽视的. 本研究以水牛伊氏锥虫VSG可溶性抗原为免疫原, 获得2株能稳定分泌高效价单克隆抗体的杂交瘤细 胞系,为伊氏锥虫诊断方法的建立奠定了基础,并为 水牛伊氏锥虫的病原学,血清学,免疫学的进一步研 究提供有力工具. 参考文献 l王云飞,周勇志,淑梅.应用PCR扩增检测伊氏锥虫的研究[j]. 畜牧兽医,1998,29(2):l68,173. 2何木荣,王祥生,陈汉忠,等.伊氏锥虫抗原变异型及其优势代表 变异体的分离鉴定[J].中国兽医科学,2008,38(3):186,190. 3蔡光英.世界动物卫生组织最新法定通报性疾病名录[J].中国畜 牧兽医,2008,35(6):15O,l51. 4DietmarS,KatrinK.Animprovedmethodforthepurificationof Trypanosomabruceivariantsurfaceglycoprotein[J].Parasitol Res,l998,84:524,525. 5LuckinsAG,GrayAR,RaeP.Comparisonofdiagnosticvalueof serumimmunoglobulinlevels,anenzymelinkedimmunosorbent assayandafluorescentantibodytestinexperimentalinfection withTrypanosomaevansiinrabbits.AnnTropMedParasitol, l978,72:429,441. 6OnahDN,HopkinsJ,LuckinsA(.Changesinperipheralblood lymphocytesubpopuIationsandparasitespecificantibodyrespon— sesin1'rypanosomaevansiinfectionofsheepEJ].ParasitolRes, l999,85(4):263,269. 7ReidSA,CopemanDB.Thedevelopmentandvalidationofan antibody—EL1SAtOdetectTrypanosomaevansiinfectionincatle inAustraliaandPapuaNewGuinea.PreventiveVeterinaryMedi cine,2003,61:195,208. 8VickermanK.Onthesurfacecoatandflagellaradhensionintryp— anosomes.CellSci,1969,5:l63,193. PreparationofMonoclonalAntibodyagainstVariantSurface GlucoproteinAntigenofTrypanosomaevansi ZENGXiao—fei,CHENHanzhong,WEIYing—yi.HEMu—rong.IIXiao—XL! (CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530005,China) Abstract:TheBAI,B/cmicewereimmunizedwithvariantsurfaceglucoproteinofTrypanosomaeva;rlsi.Thespleenlymph cellswerefusedwithmouseSP2/0myelomacells,twohybridomacelllines3D7and5B9secretingmonoclonalantibodiesa— gainstvariantsurfaceglucoproteinweredeterminedbyindirectElISA.Theirtitersincellculturesupernatantwere1:6400 and1:12800,andtitersofasciteswere1:10and1:10,both3D7and5B9belongstoIgG1withKchain. Keywords:variantsurfaceglucoprotein;Trypanosomaevansi;monoclonalantibody