日本血吸虫NP30抗体检测方法的优化

日本血吸虫NP30抗体检测方法的优化 日本血吸虫NP30抗体检测方法的优化 ? 88?中国血吸虫病防治杂志2006年第18卷第2期ChinJSchistoControl2006,Vo1.18,No.2 [文章编号]1005—6661(2006)02—0088—05 日本血吸虫NP30抗体检测方法的优化 许宁,吴玉龙,仇镇宁,陈凤.,李远林.,方文.,杨杰,冯振卿?,管晓虹 [摘要]目的为了提高单克隆抗独特型抗体NP30抗体检测系统在大山区日本血吸虫病疫区的 诊断效能,在原有的双抗体夹心ELISA方法的基础上对其进行优化,改良,建立间接ELISA血清学 诊断方法.方法通过正交,选用L(3")正交,对NP30腹水包被酶标板的浓度,血清浓度, 血清孵育时间和辣根过氧化物酶标记抗人IgG的二抗孵育时间共4个因素的3个水平进行不同组 合的实验,确定该间接法的最佳实验条件.并用建立的方法对5O份云南大山区日本血吸虫粪孵阳性 病人血清样本和5O份非疫区正常人血清样本进行检测,评价其敏感性和特异性.结果确定的该间 接法最佳检测条件为:NP30腹水4btg/ml包被酶标板,血清浓度为1:100,37?孵育60min,二抗 为37?孵育30min.该方法的敏感性和特异性分别为88和96.结论该方法具有较高的诊断 价值,可用于大山区日本血吸虫病疫区的诊断检测. [关键词]日本血吸虫病;正交试验;抗独特型抗体NP30;酶联免疫吸附试验 [中图分类号]R532.21[文献标识码]A Optimization tionmethod ofSchistosomajaponicumNP30antibodydetec— XuNing,WuYulong,,QiuZhenning,ChenFeng.,LiYuanlin,Fang Wen.,YangJie.FengZhenqing,GuanXiaohong(1KeyLabofAntibodyTechniqueofMin— istryofHealth,Na,gMedicalUniversity,Na,g210029,China;2DepartmentofPathobiolo— gY,BinzhouMedicalCollege,China;3DaliInstituteofSchistosomiasisControl,China;4Weishan InstituteofSchistosomiasisControl,Dali,China) EAbstract]ObjectiveTosetupanindirectELISAserumdiagnosticmethodbasedontheorigi— nalNP30antigen— sandwichedELISA,whichcanenhanceitsdiagnosticefficiencywhenappliedin schistosomiasisepidemicspotsofgreatmountainousareasinYunnanProvince.MethodsAccord— ingtOtherulesoforthogonaltest,tableL27(3.)waschosentOdeterminetheappropriatevaluesof fourfactors,whichweretheconcentrationofcoatingantigen(NP30ascites),theconcentrationof serum,thecultivatingtimeofserumandthecultivatingtimeofHRP—anti— humanIgG.Theim— provedmethodwasusedtodetect50serumsamplesfromthepatientswithschistosomiasisand50 onesfromthehealthypeopletoestinrateitssensitivityandspecificity.ResultsThebestvaluesof thefourfactorswere4btg/ml,1:]OO.60minand30min,respectively.Thesensitivityofthe methodwas88aswellasitsspecificity96.ConclusionThisoptimizedELISAmethodissuit— ableforapplicationingreatmountainepidemicareaswithhigherdiagnosticefficiency. EKeywords]Schistosomiasisjaponica;Orthogonaltest;Anti— idiotypicantibodyNP30;Enzyme— linkedimmunosorbentassay 我国的血吸虫病疫区可分为水网型,湖沼型和 [基金项目]国家高技术研究发展计划(863计划) (2002AA214181) [作者单位] [作者简介] 1南京医科大学卫生部抗体技术重点实验室(南京 210029);2滨州医学院病原生物学教研室;3云南省 大理白族自治州血吸虫病防治研究所;4云南省大理 白族自治州巍山县血吸虫病防治研究所 许宁(1980一),女,硕士研究生.研究方向:现代分子 生物技术 *通讯作者电话:025—86863100E—mail:fengzhen— qing@njmu.edu.cn ? 论着? 山丘型,各个疫区的地理环境及流行病学特点都各 不相同.有研究表明,日本血吸虫中国大陆株由于自 然隔离而产生的多个地理株之间,遗传和生物学性 状均有一定的差异l1.同时,不同亚株在其免疫学 特性上也表现出一些区别口].因此,各种诊断试剂盒 上市之前,都需在不同地区分别考察其应用的可行 性.管晓虹等建立了一株单克隆抗独特型抗体 NP30,可替代虫源性抗原.NP30双抗体夹心 许宁等:日本血吸虫NP30抗体检测方法的优化 ELISA血清学检测方法,已在湖南,湖北,江苏,安 徽,江西,广州和浙江等多个水网,湖沼型疫区应用, 证明其具有快速,简便,适用于现场的特点.但该方 法在应用于云南省大山区的山丘型血吸虫病疫区 时,效果却并不理想.考虑到血吸虫不同地理株之间 可能存在生物学和免疫学的不同,本研究在原有 ELISA检测方法的基础上进行优化,使其适用于大 山区疫区,并具有较好的敏感性和特异性. 材料和方法 1血清 日本血吸虫病人血清5O份,采自云南省大理州 巍山县鼠街乡鼠街村鼠街自然村,粪检虫卵均为阳 性;正常人血清共5O份,采自山东省滨州市(非血吸 虫病流行区)体检人群;阳性参考和阴性参考血清均 为本实验室保存品. 2二抗 辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人IgG, 购自Sigma公司,工作浓度为1:2000. 3包被抗原的制备 为NP30腹水.复苏本室保存的分泌NP30细 胞株,培养至对数生长期后收集杂交瘤细胞,注射入 经降植烷处理过的BALB/c小鼠腹腔.5,7d后,收 集小鼠腹水,离心后测蛋白浓度,一2O?保存备用. 4正交试验 选用L(3)正交表.检测样本为1份阳性参考 血清和1份阴性参考血清.4个试验因素分别为: NP30蛋白包被浓度,人血清浓度(一抗浓度),血清 孵育时间和二抗孵育时间.每个因素的试验水平详 见表1. 表1正交试验确定的试验因素及试验水平 Table1Experimentalfactorsandtheircorrespondinglevelsintheorthogonaltests 5ELlSA 采用间接ELISA法.NP30蛋白作为抗原,按不 同浓度用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释后包被酶标 板,100l/孔,4|C过夜.1脱脂牛奶封闭,4?过 夜.血清及二抗均为pH7.4PBS稀释后加入,100 l/孔,37?孵育. 6ELISA结果判读 采用TMB/HO显色系统.37?显色15rain 后加入2mol/LHSO终止显色,50l/孔.放入酶 标仪中450nm波长处读A值.当A郴?阴性参考 A.×2.1时判为阳性,反之为阴性. 结果 1正交试验结果确定最佳检测条件范围 使用上述正交表对不同的试验因素和水平进行 排列组合,共获得27种条件组合.选取1份阳性参 考血清和1份阴性参考血清,分别按照27种条件进 行ELISA检测.将得到的A.读数进行统计学分 析. 使用SAS9.1.3统计软件的响应面曲线法对上 述读数进行分析,结果见图1,6. 图1血清孵育时间与二抗孵育 时间的响应面曲线分析结果 Fig.1Responsesurfaceofcultivatingtimeof serumandHRP-—anti——humanIgG 中国血吸虫病防治杂志2O06年第18卷第2期 ChinJSchistoControl2006,Vo1.18,No.2 图2血清孵育时间与血清量的响应 面曲线分析结果 Fig.2Responsesurfaceofserumcultivating timeandamountofserum 图3血清孵育时间与包板 稀释度的响应面曲线分析结果 Fig.3Responsesurfaceofserumcultivatingtime andcoatingantigendilutionrate 00 图4二抗孵育时间与血清量 的响应面曲线分析结果 Fig.4ResponsesurfaceofHRP—anti—humanIgG cultivatingtimeandamountofserum 图5血清量与包板稀释度的响应 面曲线分析结果 Fig.5Responsesurfaceofcoatingantigendilutionrate andamountofserum 图6二抗孵育时间与包板稀释度的响应 面曲线分析结果 Fig.6ResponsesurfaceofHRP—anti—humanlgG cultivatingtimeandcoatingantigendilutionrate 图1,6分别给出了4个因素即血清浓度,包板 浓度,血清孵育时间及二抗孵育时间在其不同水平 下,阴性参考和阳性参考ELISA反应差值的比 较结果.曲线最高处阳性参考和阴性参考A差值 最大,所对应的水平是最佳的.图1反映的是不同血 清孵育时问和二抗孵育时间下,阳性参考和阴性参 考ELISA反应后的差值变化,图2,6则分别 比较了血清孵育时间和血清量,血清孵育时间和包 板浓度,二抗孵育时间和血清量,血清量和包板浓 度,二抗孵育时间和包板浓度在不同水平下,阳性参 考和阴性参考反应后A的差值变化.纵坐标代表 其图中两个因素不同水平时阴性参考和阳性参考 的差值.由此而得到的初步条件组合是:NP30 包板浓度为3.25,6.5t~g/ml,血清量为15l/孔, 许宁等:日本血吸虫NP30抗体检测方法的优化 血清孵育时间为6Omin,二抗孵育时间为30min. 2最佳实验条件的进一步确定 由于NP30包板浓度范围跨度较大,根据其响 应面曲线,在其他条件按上述组合不变的前提下,再 次设定5~g/ml和4>g/ml两个包板浓度,分别对5O份粪孵阳性病人血清和5O份正常人血清进行检 测,比较其检测的敏感性和特异性.结果见表2,3. 表2血吸虫病人血清不同NP30包板浓度系统敏感性比较 Table2Comparisonofsensitivityofthesystemusingdifferentconcentrationsofcoatingantig en(,l50) 表3正常人血清不同NP30包板浓度系统特异性比较 Table3Comparisonofspecificityofthesystemusingdifferentconcentrationsofcoatinganti gen(,l一50) NP30包板浓度为4~g/ml时的系统检测敏感 性为929/6,特异性为9O9/6,均优于包板浓度为 5~g/ml时的结果,确定4~g/ml为最佳包板浓度. 3检测系统特异性的提高 在保持系统敏感性较高的前提下,为提高该系 统的特异性,一定程度地降低血清浓度,寻找最适条 件.选取1:100(1/,I/~L)和1:5O(2l/孔)两个 血清浓度,分别用上述5O份粪孵阳性病人血清和5O 份正常人血清样本检测其敏感性和特异性,并进行 比较.结果见表4,5. 表4血吸虫病人不同血清浓度系统敏感性比较 Table4Comparisonofsensitivityofthesystemusingdifferentserumconcentrations(,l一 50) 表5正常人不同血清浓度系统特异性比较 Table5Comparisonofspecificityofthesystemusingdifferentserumconcentrations(,l一 50) 从比较结果可以看出,在血清浓度稀释之后,系 统的特异性有了大幅升高,其中血清1:100浓度的 特异性为96,略高于1:5O浓度时的949/6.在其 敏感性均为889/6的情况下,1:100的稀释浓度更为 合适. 因此,最终所确定的优化方法最佳条件为: NP30腹水包板浓度4~g/ml,血清浓度1:100 (1/,I/~L),血清孵育时间37?,60rnin,二抗孵育 时间37?,30min. 讨论 我国血吸虫病流行区分布范围广泛,长江中下 游流域及其以南的12个省(市,自治区)均为血吸虫 病流行区,地理上的隔离,分化,变异使分布于这些 地区的血吸虫株在遗传,生物学及免疫学特性上均 有一定的不同.云南的大山区属于山丘型血吸虫病 流行区,该处的地理环境复杂,有报道这里的血吸虫 株与湖南,湖北,安徽的血吸虫株相比较,多种同工 酶都存在地理株之间的多态性?6].曾有学者对不同 地理株日本血吸虫抗原的免疫应答表位进行过深入 研究,证实由不同亚株的同类血吸虫抗原刺激所产 生的人相应抗体,其针对的抗原表位有很大差别,这 一 差别在对成虫抗原表位的识别上尤为明显-".由 此提示,各地理株可能在抗原表位的表达,免疫应答 ?92?中国血吸虫病防治杂志2006年第18卷第2期 ChinJSchistoControl2006.Vo1.18,No.2 的类型上都有所差异.而NP30双抗体夹心法与 NP30间接ELISA法在云南大山区与平原水网区的 检测结果的差别,也很有可能是这一原因所造成的. 本次实验中,选用L.(3")正交表,对阳性参考 血清和阴性参考血清分别进行4因素3水平的分 析.如用普通的排列组合方法,每份样品需进行34 次实验,而采用正交法则只需27次即可.实验数据 经响应面曲线法分析,可确定候选的条件组合,再通 过比对这些组合检测样本的敏感性及特异性,获得 最佳的实验条件.如有需要,可在候选的条件组合范 围内进行第二次正交试验. 该检测方法的阳性判定值],即Cutoff(c.o) 值的确定,可根据公式计算:c.O一?×2.1.?为阴 性对照的A均数.按照优化后确定的检测条件,对 50份非疫区正常人血清进行检测,结果可以得到此 检测方法的C.o值为0.15. 通过上述实验,对基于NP30的诊断方法进行 了优化,确立了实验的条件,方法和步骤,并证明对 大山区血吸虫病人血清学诊断的敏感性及特异性均 较好.NP30双抗体夹心法可用=F平原水网型疫区, 而经改良优化的NP30间接ELISA法则可用于各 种不同地区.此法有待在更大的样本和更多的血吸 虫病疫区中使用并验证. (感谢江苏省血吸虫病防治研究所的各位老师在云南血吸虫病 现场给予的热情帮助.) [参考文献] [1]周晓农,洪青标,孙乐平.等.中国大陆钉螺种群遗传学研究? 遗传变异与地理分布的关系口].中国血吸虫病防治杂志.1995,7 (4):202—206. [2]周晓农,胡晓抒,孙宁生.等.地理信息系统应用于血吸虫病的检 测?流行程度的预测lJ].中国血吸虫病防治杂志,1999,11(2): 66—70. r3]KresinaTF,GuanXH,PosnerM,eta1.Differingimmunere— sponsetOsolubleparasiteantigensofChineseandPhilippinepa— tientsinfectedwithS.japonicum[J].ClinRes.1990,38(2): 557A. [4]管晓虹,仇镇宁,马磊,等. NP30的建株及初步鉴定[J] 1991,9(4):26i-264. 日本血吸虫单克隆抗独特型抗体 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. [5]GuanXH,WuGL,QiuZN,eta1.Amonoclonalanti—idiotypic antibodyNP30asan"antigenreagent"usedintheimmunodiag— nosticassaysbasedOnantibodydetectionofschistosomiasis japonica口].JNanjingMedCoil,1993,7(1):14. [63路群,詹希美,李卓雅,等.中国大陆4地日本血吸虫蛋白质及 同工酶的多态性研究lJ].寄生虫与医学昆虫学报,1997,4(2): 77—82. [7]KresinaTF,GuanXH,PosnerM,eta1.Comparisonofimmune repertoiresofChineseandPhilippinepatientsinfectedwith SchistosomajaponicumlJ].InfectImmun,1991,59(12):4698— 47OO. [83杜锐,王树志.程业军,等.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测鹿 布氏杆菌抗体的研究lJ].吉林农业大学学报,2002,24(4):103 1O6. [收稿日期]2006—02—08[编辑]沈怡平 II___.i______=!::!___'__::I__!|!:::!___=:!; ? 信自,? 全国血吸虫病防治研究青年学术交流会征文通知 为深入宣传介绍我国血吸虫病防治工作取得的伟大成就,保证血防工作的可持续发展.培养和锻炼我国血防队伍的新生 力量,激发更多的有志青年对血防工作的兴趣及投身血防事业的热情,使更多的优秀中青年技术骨干脱颖而出,为我国血防 事业的可持续发展提供人才保证,由卫生部血吸虫病专家咨询委员会,中华预防医学会主办的全国血吸虫病防治研究青年学 术交流会定于2006年第四季度召开,属时将邀请国内外血吸虫病科研和防治领域的着名专家,学者作专. 大会现开始征文,征文内容为:血吸虫病流行病学与防治;钉螺生物学与钉螺控制;血吸虫病诊断;免疫学与分子生物学; 血吸虫病临床与治疗;家畜血吸虫病科研与防治;血防健康教育与社会医学;其他与血防科研有关的内容.征文要求:凡未在 国内外学术刊物或会议上发表过的论文均可投稿,会议只接受论文摘要.论文符合国家和各单位保密规定,文责自负.论文摘 要用Word文档编排,不超过一个版面(A4页面;页边距:上2.5cm,下2.0cm,左2.5cm,右2.0cm),内容包括题目(加粗楷 体三号字),作者,单位,地址,邮编(均为楷体小四号字),摘要正文(楷体五号字)及图表等.摘要不得少于400字.论文经过会 议学术委员会评审后发录用通知.请于2006年6月31日前将论文摘要用电子邮件传送到中国疾病预防控制中心寄生虫病预 防控制所,E—mail:discourse11@yahoo.com.cn联系人:冯婷地址:上海市瑞金二路207号邮编:200025电话:021— 64377008—8305. 欢迎各疫区省(自治区,直辖市)疾病预防控制中心(寄生虫病防治研究所),高等医药院校,科研院所,医疗及防治机构等 部门从事血吸虫病科学研究和防治或相关领域的青年科技工作者(年龄45岁以下)踊跃投稿. 卫生部血吸虫病专家咨询委员会 中华预防医学会