基质效应的总结

基质效应的总结 基质效应 基质效应是指系统检测样品中的物时，处于分析物周围的所有非分析物质对分析物参与反应的影响。产生基质效应的原因与以下四个主要因素的相互作用密切相关:仪器的、试剂的组成成分、测试方法的原理、质控材料的组成及处理技术等。通过回收实验可以评估分析方法是否受基质效应的影响，而EP14A文件介绍的方法则是评估经过物理或化学方法处理过的样本在分析过程中是否存在基质效应。 一、克服基质效应的方法 克服基质效应的方法包括下面几种: (1)选择合适的样品预处理方法:常用的样品的处理方法包括蛋白沉淀，液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)。通常 利用LLE或 SPE制备的样品内源性杂质较少，有助于降低绝对基质效应。但样品前处理过程的复杂会降低分析检测的效率，增加污染的风险，并可能带来待测组分的损失，也直接影响待测组分的提取回收率。因此在样品制备方法的选择中要兼顾基质效应和提取回收率两方面的因素，选择合适的样品制备方法。 (2)改变被测物的色谱分离条件:即通过优化色谱分离条件使得内源性杂质与待测物分离。采用反相色谱法分离时，最初流出的主要是基质中的极性成分，而这些极性成分往往是引起基质效应的主要原因。当待测组分的色谱保留时间较短时(<3min)，其受基质效应影响较大。因此，改善色谱分析条件，适当地延长待测组分的保留时间(但要兼顾样品运行时间延长带来的峰展宽、灵敏度下降的问题)，有利于减少基质对测定的影响。 (3)采用性质相近或稳定同位素内标:如果绝对基质效应影响较大，但内标和被测物的绝对基质效应接近，仍可认为方法可行。但需注意的是，如果绝对基质效应太大，通常会造成方法的变异很大。而且当多个分析物同时检测时，由于存在极性差异，即使是同类物的同位素内标也很难抵消基质效应，从而造成定量结果偏差。因此在方法建立的初期，仍建议采取可行的方法降低绝对基质效应。 (4)采用小进样量。在保证灵敏度的情况下，采用小进样体积，可以适当降低基质效应。由于自动进样器的广泛应用，目前即使很小的进样体积也能实现良好的进样精密度。 (5)利用液相色谱电解质效应(LC-electrolyte effects):利用在流动相中添加极少量不同的有机酸/碱促进待测物离子化，从而减少基质效应的影响。在流动相的选择方面,有研究报道，在流动相中添加极少量的电解质可以显著提高ESI负离子模式的离子化效率和减少基质效应的影响,并将这种现象称为“电解质效应”(LC一eleetrolyteeffeet、)。 (6)使用较低的流速:在LC/MS中，尤其是使用ESI离子源时，较低的流速可以使同时离子化的化合物减少，降低了待测成分与基质成分在电离过程中的竞争，从而减弱基质效应。 (7)改用不同的离子源:目前用于定量的离子源主要是电喷雾离子源(ESI)和大气压化学离子源(APCI)，通常ESI对于基质效应的敏感程度要高于APCI。对于特定的化合物，特别是对于蛋白质沉淀法处理的样品，若采用ESI有明显的基质效应，更换成APCI源或大气压光离子源(APPI)可能是一种简单易行的方法。 ayfor提出这样的一个验证方法:3个不同的质控浓度，每个浓度的样品用(8)T 不同的试验受试者的空白血浆(n=5)，各在萃取前和萃取后添加对应浓度的对照品溶液及内标溶液,再加上所用的对照品溶液,一共45个样品进样。这样可以得到方法的基质效应、绝对回收率、提取回收率,更重要的是可以计算个体间的差异,即方法的变异系数。如果个体间的差异大于15%，就意味着需要重新调整样品的处理方法和分析方法,以消除基质效应的影响。 二、方法 目前，评价基质效应的方法主要有两种:柱后灌注法和提取后加入法。其中，柱后灌注法能直观地显示基质效应对被测物色谱保留时间的影响范围和影响程度，适合在色谱方法筛选过程中评估基质效应的影响情况，为色谱条件的优化提供信息。而提取后加入法不仅能量化绝对基质效应的程度，也能提供相对基质效应的数据，因此被广泛运用于方法学验证过程。 1.柱后灌注法 柱后灌注法属于动态分析基质效应的方法，其将针泵及液相色谱系统通过 T 型进样阀与质谱仪相连。将空白样品按待测样品的处理方法提取后，利用待测样品的洗脱条件，通过 HPLC 进行色谱洗脱，同时用针泵将特定浓度的被测物以 恒定速度注入，两种溶液一并通过 T 型进样阀进入质谱仪，进行待测物离子信号强度检测。被测物信号响应的变化将直接反应生物基质对于被测物的影响，同时，信号强度随时间变化的关系也有助于色谱条件的优化。 2.提取后加入法 提取后加入法在评定 LC-MSn 基质效应中使用得最多，而且此法还可用于评价绝对基质效应(absolute ME，基质效应影响分析的程度)和相对基质效应(relative ME，样品间基质效应大小的差异)。 (1)绝对基质效应的评价 利用下述方法制备两组待测样品。 Set 1:将被测物溶于非生物基质的空白溶液，如:配制成甲醇、乙腈等溶液。 Set 2:提取空白生物基质，浓缩复溶形成溶液，将被测物加入此溶液中。 将上述 Set 1 和 Set 2 样品引入 LC/MSn 系统进行分析，获得待测物和内标的信号强度，其中待测物或内标在 Set 2 和 Set 1 中信号强度的比值(Set 2/Set 1)为绝对基质效应，可以用基质效应因子(matrix factor，MF)来表示，待测物与内标 MF 的比值称为内标归一化基质效应因子(IS-normalized MF)。绝对基质效应结果主要影响分析方法的准确度。 (2)相对基质效应的评价 相对基质效应大小可以用 IS-normalized MF 的变异系数(CV)来判断。 具体步骤如下:选择至少六个不同来源的生物基质，利用 2.2.1 方法测定上述生物基质中待测物和内标的 MF(待测物浓度通常选择一个低浓度即可，其浓度应在 3×LLOQ 以内)，并计算内标归一化基质效应因子，利用获得的 6 个内标归一化基质效应因子计算变异系数，其值应小于 15%。 如果由于某些特殊情况(比如全自动在线样品‎‎处理、收集和测定过程无法中断程序)不能按照上述流程制备得到 set 1 和 set 2，则需要考察待测物和内标在不同生物样品(至少 6 个不同个体的来源)中响应强度的差异，以此来证明基质效应对于未知生物样本的测定结果影响可以忽略。 具体步骤如下: 利用至少 6 个不同来源的生物样品制备一定浓度(3×LLOQ 以内)的待测 标准品(每个生物样品同时至少制备 3 份); 按正常样品测试方法测定这些待测标准品的浓度;计算精密度(CV 表示)和准确度，其中 CV 应小于 15%;而准确度平均值的偏差应在 15%以内，对任何样品，如果其准确度偏差超过 20%则需要额外考察并判断原因。 对于方法验证而言，相对基质效应的结果直接影响方法的准确度和精密度，较绝对基质效应更为重要，因此 EMEA 在《生物分析方法的验证指导原则(草案)》中并没有就绝对基质效应作出限制标准，而是要求 6 份内标归一化基质效应因子的 CV<15%。不过需要注意的是如果绝对基质效应影响过大，通常会表示基质对于方法的影响很大，往往导致精密度的实验结果不符合要求， 因此在方法建立之初，如果条件允许，应尽可能降低绝对基质效应。