人尿脱落细胞FISH检与尿脱落细胞学检查和膀胱镜检查在尿路移行

人尿脱落细胞FISH检与尿脱落细胞学检查和膀胱镜检查在尿路移行 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。研究生签名痈坦彬导师签章:蟹乏笪;级学 河北医科大学研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名:身蚴 。 导，超章:,彩 ,舛猢,日 目 录中文摘 要…………………………………………………………………?,英文摘要……………………………………………………………………”,研究论文人尿脱落细胞,，,,检查与尿脱落细胞学检查和膀胱镜检 查在尿路移行细胞癌诊断中的应用及对比研究 前 言………………………………………………………………………………………, 刖 舌……………………………………………………………………………………………………„芍 材料与方法……………………………………………………………((, 结果………………………………………………………………………………………,, 附图……………………………………………………………………(, , 附表………………………………………………………………………。,, 讨论………………………………………………………………………………………,, 结论………………………………………………………………………………………,,参考文献……………………………………………………………………(, ,综述肌肉浸润性膀胱肿瘤治疗的研究进展…………………………(,,致谢……………………………………………………………………………………(, ,个人简历……………………………………………二……………………(,, 中文摘要人尿脱落细胞,，,,检查与尿脱落细胞学检查和膀胱镜检查 在尿路移行细胞癌诊断中的应用及对比研究 摘 要 目的:尿路移行细胞癌在泌尿系肿瘤中比较常见，发病率高，复发率高，死亡率也较高，疾病的治疗占用了大量的医疗资源。而大量数据表明，越是能够获得早期的诊断治疗，预后就越好。本实验比较尿脱落细胞荧光原位杂交(,，,,)检查、尿脱落细胞学检查和膀胱镜检查对以恶性血尿为主要症状的尿路移行细胞癌诊断的临床有效性，为完善血尿病因诊断提供数据支持。 材料与方法:河北医科大学第二医院泌尿外科,,,,年,月至,,,,年,月可疑尿路移行细胞癌的血尿患者,,,例，其中男性,,例，女性,,例，中位年龄为,,岁。对, ,,例患者均行,，,,检查、尿脱落细胞学检查和膀胱镜检查。共有,,例诊断为膀胱移行细胞癌，临床病理情况:,, ,,例，,, ,,例，,, ,,例，,,,, , ,例。,,例诊断为上尿路肿瘤，其中,例肾盂移行细胞癌，,例输尿管移行细胞癌，,例肾盂神经内分泌癌。,例诊断为膀胱腺癌。,,例患者诊断为腺性膀胱炎。,例间质性膀胱炎。,例肾结核。,例前列腺癌。 荧光原位杂交技术(,，,,)是起源于,,世纪,,年代末的一种分子遗传学技术， 探针为已知的荧光标记的核酸，按照碱基互补配对原则，将待检标本中的未知的单链核酸与探针特异性结合，形成杂交双链核酸，再应用荧光显微镜检测荧光信号，从而得出结果。,，,,可以检测染色体数目异常和染色体畸变，在分子水平表现为基因片段扩增、缺失、碱基改变等。本实验使用,,,,,,,,,,,,组合探针进行检测。 通过对,,例正常人(男, ,例、女,,例)的尿液，使用相同方法进行,，,,实验，两组探针组合分别观察,,,个细胞。统计出不同类型异常细胞的百分比，建立阈值。阈值,平均值(,)，,×差 (,,)。分别建立,,号染色体?,个信号点、,,,位点,个信号点、,个信号点的阈值。此阈值为本实验室前期实验确定。 ,,,例患者的,，,,结果与阈值相比较进行,，,,判读。,，,,阳性判 中文摘要读标准为,,号染色体、,,,位点,个信号点均异常或者,,号染色体的复杂异常或者,,,位点,个信号点。,,,例患者同时行尿脱落细胞学检查和膀胱镜检查，以膀胱镜活检病理或手术切除标本病理为最终确诊依据，并对疾病进行分期，比较三种诊断方法的敏感性和特异性(尿脱落细胞学诊断为可疑按阳性结果处理)。在膀胱镜检查前取不少于,,,,,尿液标本，否则影响细胞计数，膀胱镜活检病理结果与手术切除标本病理结果不一致时，以手术切除标本病理结果为准。 结果:,，,,检查、尿脱落细胞学检查及膀胱镜检查对,,例膀胱移行细胞癌的总的敏感性分别为,,,,,(,,(,,)、,,,,,(,,(,,)、,,,,, (,,(,,)。,，,,和膀胱镜比较，卢,(,,,,,(,,，无统计学意义;,，,,与尿细胞学比较尸,,,,(,,，有统计学意义。尿脱落细胞学与膀胱镜比较，尸,,,,(,,，有统计学意义。,，,,对膀胱移行细胞癌,,、,,、,,、,,,,各分期敏感性分别为,,(,,、,,(,,、,,(,,、,,,,。尿脱落细胞学各分期敏感性分别为,,、,,(,,、,,(,,、,,(,,。膀胱镜各分期敏感性分别为,,(,,、,,(,,、,,,,、,,,,。,,、,,、,,期，,，,,与尿脱落细胞学比较，,,,(,,，有统计学意义;,,,,期，尸,,(,,，无统计学意义。各分期,，,,与膀胱镜比较，胗,(,,，无统计学意义。三者对于膀胱移行细胞癌总的特异性分别为,,,,,(,,(,,)、,,,,,(,,,,)、,,,,,(,,,,)，三者比较，尸,,(,,,,,(,,，无统计学意义。 ,，,,检查及尿脱落细胞学检查对于,,例上尿路移行细胞癌总的敏感性分别为,,,,,(,,,,)、,,,,(,,(,,)，进行比较，氏,(,,，有统计学意义。两种检查对于整个,,例尿路移行细胞癌总的敏感性分别为,,,,,(,,(,,)、,,,,,(,,(,,)，两者比较，氏,(,,，有统计学意义。,，,,对于整个尿路移行细胞癌,。、,,、,,、,,,,各分期敏感性分别为,,(,,、,,(,,、,,(,,、,,,,。尿脱落细胞学对于各分期敏感性分别为,,、,,(,,、,,(,,、,,(,,。两种方法不同分期进行比较，均,,,(,,，有统计学意义。两种方法总的特异性分别为,,,,,(,,(,,)、,,,,, (,,,,)，尸,,(,,，没有统计学意义。 结论:对于膀胱移行细胞癌，,，,,检查的敏感性与膀胱镜检查相当，而二者明显高于尿脱落细胞学检查，三者在特异性上无明显差别。,，,,和尿脱落细胞学还可以有效检测上尿路移行细胞癌，而,，,, 中文摘要的敏感性明显高于尿脱落细胞学。因此，对于恶性血尿为主要症状的患者，,，,,可以作 为筛查移行细胞癌的有效手段;,，,,可以有效的对整个尿路移行细胞癌进行早期诊断，作为一种重要的主要或辅助手段应用于临床。 关键词:荧光原位杂交;尿脱落细胞学;膀胱镜;移行细胞癌;恶性血尿 英文摘要 ,,, ;,,,,,,, ,,,,, ,, ;,,,,,,,, ,,,,, ,，,,，,,,,, ;,,,,,,, ,,, ;,,,,,;,,, ,,,,;,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,;, ,,,,,,,,,,,, ;,,, ;,,;,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,;,,,,: ,,,,,叫 ,,,;, ,,,,,,,,,,,,, ;,,, ;,,,,,,,, ,, ,,,,;,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,,,,,巧,,,;,，,,,;, ,, ,,,, ,,曲,,;,,,,;, ,,,,;,玎,,;, ,,,, ,,, ,,曲,,,,,,诹,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,;;,,, ,,,, ,, ,,,,;,, ,,,,,,;,,(,,唱, ,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,;;,,,,, ,,,, ,,,,,,,，,, ,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,(，,,,,,咖,, ,, ;,,,,,,, ,,, ;,,,,;,, ,保,;,,,,,,,, ,, ,,,,,,;,,;,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,(,，,,),,锄,,,,,,,，,,,,, ;,,,,,,, ,,, ;,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,砷,,,, ,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,巧,,,;, ,,,,,,,,,;, ;,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,,(,, ,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,舶, ,,, ,,,,,( ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,:，, ,,, ,,;,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,;,,,,,,,,,,吼,, ,,,,,,，,,,,, ,, ,,,,,,, ,,唱,巧,,,,,,,, , ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,(, , ,,,, ,,, ,, ,,,,,,， ,,,,,, ,,, , , ,,,,,),,,,,;,,,, ,,,,,,,巧,,,;, ,,,,,,,,,, ,,,,,,，五?, ,,,,,, ,, , , ,, ,,,,,, ,, ,,(,, ,,,,, ,,,,,,,, ,,;,,,,, ,，,,、嘶,, ;,,,,,,, ,,, ;,,,,,;,,,(,, ,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,;,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ;,,;,,,,,,,,，,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,:, , ;,,,, ,, ,,，,, ;,,,, ,, ,,，,, ;,,,,,, ,,，,, ;,,,, ,, ,,,,(, , ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,拶,,,;,,,,,,，,,;,,,,,, , ;,,,, ,, ;,,;,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,，, ;,,,, ,, ,,,,,,;,,;,, ,,, , ;,,,, ,, ,,,,;,,,, ;,,;,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,(,,,,,,,, , , ;,,,, ,,;,,,,, , ;,,,, ,, ,,,,,,, ,,, ,,;,,;,,,,,(, , ;,,,, ,,;,,,,,,, ,,,,,,,,,,,， , ;,,,, ,, ,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,， , ;,,,, ,, ,,,,,,,,,,;,,,,,,，, ;,,,, ,, ,,,,,,,, ;,,;,,( ,,,,,,,;,,;, ,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,(,，,,),, , ,,,,;,,,, ,,,,,,;,,,;,,,,,,弘,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,, , ,,,,(,,,,, ,, , ,,,、,, ,,,,,,,;,,,,, , 英文摘要 ,,,,,,, ,,;,,,; 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仃,,,,,,,,,, ;,, ;,,;,,,,,; ,,,,,,,,, ,,,,,,,晒, , 研究论文人尿脱落细胞, , ,,检查与尿脱落细胞学检查和膀胱镜检查 在尿路移行细胞癌诊断中的应用及对比研究 (屿～圭? 刖 置 尿路移行细胞癌包括尿道上皮癌、膀胱癌、输尿管癌和肾盂癌，其中以膀胱癌最常见。膀胱癌是世界十大恶性肿瘤之一，在我国是最常见的泌尿系肿瘤，在美国仅次于前列腺癌，而且发病率呈逐年上升的趋势，严重威胁着患者的生存。,,,,年，全世界估计约有,,,,,,名患者发病，约有,,, ,,,名患者死亡【,】。恶性程度高、术后易复发是尿路移行细胞癌的特点，也是尿路移行细胞癌死亡率高、瘟菩Ч 畹闹匾 颉,虼四芄辉缙凇?既贰?薮吹募觳獬鲆菩邢赴 约膊〉脑缙谥瘟啤?嗖庠ず蟆?档陀写醇觳榈钠德识加凶胖匾 囊庖濉?临床上常用的检 查的手段主要是膀胱镜检查和尿脱落细胞学检查。膀胱镜检查是膀胱癌诊断的金标准，可以直观的显示膀胱各壁的情况，然而膀胱镜为有创检查，会给患者带来一定的痛苦，降低患者的依从性。尿脱落细胞学检查虽然无创，而且特异性非常高，但是敏感性很低，无法满足临床的需要。荧光原位杂交技术(,，,,)作为一项新兴的分子遗传学工具，可以发现细胞特定的基因变异，从而可以方便、安全、无痛苦的对尿路移行细胞癌进行早期诊断。本实验采用,，,,技术诊断移行细胞癌，并与膀胱镜和尿脱落细胞学检查相比较，为完善血尿患者的诊断流程提供理论依据。 研究论文 材料与方法,试验对象 选取河北医科大学第二医院泌尿外科,,,,年,月至,,,,年,月可疑尿路移行细胞癌的血尿患者,,,例，其中男性,,例，女性,,例，年龄,,(,,岁，中位年龄为,,岁。,,,名患者均以血尿为主要临床症状，其中,,例为肉眼血尿，,,例为镜下血尿。,,例患者伴有单侧腰腹疼痛，,,例患者伴有膀胱刺激症，,,例患者伴有排尿困难症状，,,例患者伴有单侧或双侧肾囊肿。常规检查后，临床决定做膀胱镜检查前收集晨尿,,,,,左右行,，,,检查、同时行尿细胞学检查和膀胱镜检查。,,,例患者均行膀胱镜活检病理检查或手术切除标本病理检查，其中,,例行术前膀胱镜病理活检。共有,,例诊断为膀胱移行细胞癌，临床病理情况:,, ,,例，,, ,,例，,, ,,例，,,，, ,,例。,,例诊断为上尿路肿瘤，其中,例肾盂移行细胞癌，,例输尿管移行细胞癌，,例肾盂神经内分泌癌。,例诊断为膀胱腺癌。,,例患者诊断为腺性膀胱炎。,例间质性膀胱炎。,例肾结核。,例前列腺癌。,试剂和器材,(, ,，,,实验场地 实验场地有:(,)暗房:面积,,,，清洁、避光;(,),，,,操作实验室:面积,,,,，清洁、室内温度、湿度较稳定。,(,实验主要设备 暗房中的设备主要有:荧光显微镜,台(奥林巴斯(,,,,)、图像采集分析系统,个(,,,德国耶拿公司)、办公电脑,台;,，,,操作室主要设备有:电热恒温培养箱(,,?),台(,,,,,公司)、恒温水浴箱,台、烤片机,台、漩涡混合器,台、普通光学显微镜,台(奥林巴斯)、迷你离心机,台、,?冰箱,台、(,,?冰箱,台、,,,一,,,,“,移液器,支、,,(,,,,,移液器,支、,(,,,,移液器,支、,(,(,,“,移液器,支、,(,(,(,,,移液器,支。,(,实验所用耗材 实验耗材有:水银温度计(重复使用)、计时器(重复使用)、 研究论文,,,,离心管(一次性使用)、,,,,离心管(一次性使用)、,,管架 (重复使用)、立式染缸(考普林瓶)(重复使用)、一次性手套(一次性使用)、一次性口罩(一次性使用)、记号笔(重复使用)、铅笔 (重复使用)、止血钳(重复使用)、镊子(重复使用)、载玻片(一次性使用)、盖玻片(一次性使用)、吸水纸(一次性使用)、封口膜 (一次性使用)、,,管(一次性使用)、,,,,加样头(一次性使用)、,,,,加样头(一次性使用)、,,,,,,加样头(一次性使用)、滴管(一次性使用)、量筒(重复使用)、医疗废物盒(一次性使用)。,(,实验相关试剂配制,(,(,缓冲液储存液:,,×,,,，,, ,(, 氯化钠 ,,, 柠檬酸钠 ,,, 去离子水 ,,,,, 充分溶解，室温下,,, ,,,调节,,值至,(,，用去离子水定容至,,,,,。高压灭菌;使用期间,(,?储存。试剂配制,个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，立即丢弃。,(,(,缓冲液: ,×,,,， ,,,(,土,(, ,,×,,,(,,,(,) ,,,,, 去离子水 ,,,, , 充分混匀，室温下,,, ,,,,调节,,值至,(,士,(,，用去离子水定容至,,。使用期间,(,?储存。试剂配制,个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，立即丢弃。,(,(,变性液:,,,(,,,)甲酰胺,,×,,,，,,,(,(,(, 甲酰胺 ,,,, ,,×,,,(,,,(,) ,,, 充分混匀，室温下调节,,值至,(,(,(,，用去离子水定容至,,,,。使用期间,(,?储存。试剂配制,天后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，立即丢弃。,(,(,乙醇溶液:,,,乙醇、,,,乙醇 将,,,,,、,,,,,无水乙醇，用去离子水分别稀释至,,，使用期间,(,?储存。试剂配制,个月后或用于,,张玻片杂交后应丢弃， 研究论文 若试剂出现混浊或污染，立即丢弃。 ,(,(,洗涤液:,(,,,,(,,,,×,,,溶液，,,,(,土,(, ,,×,,,(,,,(,) ,,,, ,,(,, ,(,,, 去离子水 ,,,,, 充分混匀，室温下,,, ,,,,调节,,值至,(,士,(,，用去离子水定 容至,,,,,。使用期间,(,?储存。试剂配制,个月后应丢弃，若试剂 出现混浊或污染，立即丢弃。,(,(,甲酰胺洗涤液: ,,,(,,,)甲酰胺,,×,,, 甲酰胺 ,,,, ,,×,,,(,,,(,) ,,,, 充分混匀，室温下调节溶液,,值至,(,(,(,，用去离子水定容至,,,,,。使用期间,(,?储存。试剂配制,天后应丢弃，若试剂出现混浊或污染，立即丢弃。,(,(,快洗洗涤液:,(,×,,,,,(,,,,一,,洗涤液(用于快速洗涤): ,,×,,,(,, ,(,) ,,,, ,,(,, ,,, 去离子水 ,,, ,, 充分混合，室温下, ,, ,,,,调节,,值至,(,(,(,，用去离子水定容至,,。使用期间,(,?储存。试剂配制,个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染应丢弃。,(,(,固定液(甲醇:冰乙酸体积比,:,): 量取,,,,甲醇和,,,,冰乙酸，充分混合。使用前新鲜配制。,(,(, ,,，低渗溶液(,(,,, , ,,,): ,,, ,(,,,, 去离子水 ,,,,, 用去离子水定容至,,,,,，,—,?储存。试剂配制,个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染应丢弃。,(,(,, ,, ,,,: 浓,,, ,(,,, 研究论文 去离子水 ,,,,,(,(,, ,(,,, ,,,: 取,(,,,,, ,,,，加去离子水定容至,,,,。,(,(,, ,(,, ,,,: 取,,,,, ,,,，加去离子水定容至,,,,。,(,(,,胃蛋白酶工作液(,(,,,,,,,); 取,(,,,胃蛋白酶粉剂溶于预热至,,?的,,,, ,(,,?,，，混匀。使用前新鲜配制。 备注:正确的操作程序保证试剂的质量。 为得到好的结果，需确保试剂按照正确配制。 使用校准过的温度计测量考普林瓶中的溶液温度。 用于实验的,×,,,、,(,,,,(,,,,×,,,、,(,啪(,,,,(,×,,,溶液和胃蛋白酶工作液不可反复使用。,(,本实验所用,,,,,,,,,,,,组合探针包含两种,,,探针，在间期核与中期染色体上均能产生明亮的杂交信号。,,,,,探针为,,号染色体着丝粒，,,,,,,为,号染色体？,,区带探针。,,,,,,探针荧光显微镜下可见红色信号，荧光物质为四甲基罗丹明，激发波长为,,,,,，发射波长为,,,,,;,,,,,探针荧光显微镜下可见绿色信号，荧光物质为细胞绿，激发波长为,,,,,，发射波长为,,,,。探针杂交到人类的中期细胞染色体产生的荧光信号，敏感性大于,,,。,,,,,、,,,,,,研妊探针分别杂交到人类各自的染色 体附着点，产生荧光信 号，特异性大于,,,，,,,探针与非目的染色体不会产生交叉杂交反应。 荧光原位杂交(,，,,),,,探针((,,?避光保存，保存期, 年)、杂交缓冲液((,,?保存，保存期,年)、,,,，复染剂((,,? 避光保存，保存期,年)、无水乙醇(室温保存)、去离子水(室温 保存，保存期,天)。,，,, ,,,探针、杂交缓冲液和,,,，复染剂 由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供。 ,尿液标本的留取 留取晨尿,,,,,左右(过少影响细胞数目的要求)，,小时内送检， 时间不宜过久，保持尿液新鲜，以免出现细胞溶解，尿液成分变化; 研究论文盛尿容器保持清洁、干燥，最好是一次性使用，避免不必要的污染;尿液标本防止月经血、白带、精液、粪便、前列腺液、烟灰等异物的混入，给处理标本造成困难;一次收集标本较多时，容器上标明病人姓名、住院号等信息，方便标本处理，不易混淆。, ,，,,操作前的玻片制备,(,试剂耗材:,,，低渗溶液、甲醇、冰醋酸等。,(,仪器设备:量筒、移液器、塑料吸管、离心管、镊子、载玻片、盖玻片、计时器、温度计、水浴锅、显微镜等。,(, 玻片制备程序:,(,(,收集,,,,,左右尿液标本(晨尿最佳)置于,,,,离心管中,,,,(,,,,印,，离心,,分钟。反复离心，去上清，收集细胞。 注意:收集细胞后可根据情况进行胶原酶,消化(如标本蛋白、血.