铁皮石斛研究

铁皮石斛研究 : 目的：研究铁皮石斛试管苗生产中，壮苗阶段的适宜培养基。方法：对基本培养 基、天然提取物，香蕉提取物浓度和激素种类的选择进行了研究。结果：基本培 养基以Ｂ５或１／２ＭＳ为好；天然提取物应选用香蕉水提物，香蕉水提物浓度 为１０％，植物激素是２ｍｇ／Ｌ的ＮＡＡ较好。结论：以上培养基组成是铁皮 石斛试管苗壮苗的适宜培养基。 Effects of Additives on Tissue Culture and Rapid Propagation of Dendrobium canducum 1/2 MS培养基添加活性炭、植物激素及香蕉汁、苹果汁、土豆汁等对铁皮石斛 Dendrobium canducum Wall. ex Lindl.快速繁殖的影响研究,结果表明:适量的活性炭和1.0 mg/L NAA比较适合铁皮石斛原球茎的增殖;1/2 MS及添加0.5 mg/L NAA和0.5%活性炭比较适于原球茎的分化;添加0.5%活性炭和香蕉汁、苹果汁能促进试管苗根的生成和生长. : 研究结果表明，Ｎ６，ＭＳ等１４种培养基对曲茎石斛，铁皮石斛的种胚成苗率， 种胚苗生长有显著作用，其中以Ｎ６为硅。在１／２Ｎ６培养基内添加香蕉汁（１ ５０ｍｇ／Ｌ），石斛种胚苗生长最好；若添加２ｍｇ／Ｌ或１ｍｇ／ＬＮＡＡ， 可提高石斛种胚分蘖率６－７．１４倍。选曲茎石斛或铁皮石斛的茎尖，茎段， 充实幼叶及其种胚，鳞叶期原球茎，种胚苗，幼根为外殖体，可培育出大批组培 苗。栽培试验结果表明，石斛组培苗在特殊的环境 石斛属(Dendrobium 0．Sw．)的大多数种是珍贵药材植物，又是美丽观赏花卉。茎加工人药，具有滋阴 补肾、清热生津、延年益寿之效。据报道，石斛含石斛碱(dendrobine，C1 H25O。N)、石斛次碱(nobiline， C1 H23O3N)、石斛宁(shihunine，Cl 2H13O2N)等多种生物碱，并证实它具有抗菌消炎、保喉清音、 治疗多种疾病，以及可能抗癌等效能。该属植物主要分布于热带、亚热带的特殊生境内，繁殖与栽培极为 困难，因而石斛数量稀少。 : 目的：探索真菌诱导子对铁皮石斛组织培养物生长的影响。方法：以1／2MS为基本培养基，加入不同兰科内生菌根真菌的菌丝提取物对铁皮石斛的愈伤组 织、拟原球茎以及不定芽等进行诱导培养。结果：四个不同菌株对石斛组织培养 物生长的促进作用依次为：P15>P10>P01>P05。结论：四种真菌诱导子均可 不同程度地促进铁皮石斛的生长，在四种真菌诱导子中，P15的诱导效果最好。P01和P05对铁皮石斛根的分化有抑制作用。 铁皮石斛是兰科(()rchidaceae)石斛属(Dendrobium) 植物，为传统、名贵的中药材，其主要成分石斛 多糖及石斛碱具有显著的滋阴、益胃、生津止渴、润肺止咳、强壮及增强免疫活性的作用。有关研究结果 表明，石斛多糖是一类中药免疫调节荆，具有抗癌、抗衰老、抗辐射等多种功效。一但由于野生药用石斛 自然繁... In vitro Rapid Propagation of Stems of Dendrobium candicum 1 植物名称铁皮石斛(Dendrobium candicum). 2 材料类别幼嫩茎段. 3 培养条件基本培养基为MS.芽增殖培养基:(1)MS+NAA 0.1～0.5 mg*L-1(单位下同)+6-BA 0.5～2.0;壮苗培养基:(2)MS无激素培养基;生根培养基:(3)1/2MS+IBA 0.1.以上各种培养基蔗糖浓度均为3.0%,pH 5.4～5.8,培养温度(25+2)?,连续光照培养,光照强度1 500 lx. : 枫斗是石斛属的一些植物的加工品。历史上最早是以霍山产者为最著名，来源仅 限于霍山石斛及少数石属它种植物加工而成。但长期来主要为铁皮石斛，目前的 植物来源趋于复杂。 张明 夏鸿西 朱利泉 张玉进 ［摘要］ 目的：综述国内外对石斛组织培养进行的深入研究。方法：系统查阅 国内外近10年来的有关文献20余篇。结果与结论：介绍了石斛组培的多种方法， 对培养基、激素及多种条件对组培的影响作了论述，并提出了存在的问题及对策。 ［关键词］ 石斛；组织培养 ［中图分类号］S567.035.3 ［文献标识码］A ［文章编号］1001-5302(2000)06-0323-04 石斛属Dendrobium为兰科第2大属，多年生草本植物，全球计有1 500种。多生于树皮或岩石上，开花多，结果少，每果可含100万粒种子。种子细如粉尘［1］，每粒重约0.3～0.4 μg。种胚不超过球形阶段，即存在后熟现象。由于缺 乏胚乳组织，需与真菌共生(symbiotical)才能萌发，自然条件下发芽率一般不 及5%。石斛为合轴生长(sympodial)，分株是其繁殖的主要方式，对生长条件的 要求较为苛刻。 石斛属植物中有不少是名贵中药，在《本草纲目》中石斛被列为上品。我国［2］76种石斛属植物中有近40种作药用，著名的有D.nobile(金钗石斛)、D.candium(铁皮石斛)、D.huosanness(霍山石斛)等。具有强阴益精、补肾益力、［3］轻生延年等作用，其应用范围正迅速扩大。石斛属植物约有四分之一可供观赏，称为石斛兰D.orchids，以花艳丽而著称，近年作为观赏植物发展迅速，已形成 独立产业。集药用和观赏于一体的价值，加之过度的采伐利用和繁殖率低，造成 了石斛供需之间的紧张状况，我国已将其列为濒于绝灭的受保护的中药品种之 一。 自1960年法国人Gmorel利用石斛基尖组织培养无病毒植株的无性繁殖技术 创立以来，石斛组织培养逐步走向深入化。近年来，石斛组织培养的最佳条件， 包括光照、温度、pH以及如何选用外植体，选用激素等取得长足进展，并利用 组培技术研究种子萌发过程中的生理生化变化等，还获得了转基因石斛植株。我 国石斛组织培养研究起步较晚，直到1984年，徐云鹏等才首次报道获得霍山石［4］斛试管苗。此后又利用铁皮石斛、束花石斛、兜唇石斛的茎尖、叶尖或种胚 获得了再生植株。 组织培养获得石斛再生植物株的途径有器官发生型和原球茎发生型两种。器 官发生型通过外植体组织培养，使预先存在的分生组织形成芽(如腋芽)或不定分生组织(如子叶、茎段、愈伤组织等)形成不定芽。此途径又可分为3种类型：无菌短枝型(又称节培法)，芽增殖型，器官发生型；原球茎发生途径通过石斛适宜 外植体诱导产生胚性愈伤组织并增殖，随后形成类胚组织原球茎进而发育成完整 的再生植株。通常由种子离体培养产生的胚性组织称原球茎(protocorm)，而上外植体叶尖、基尖等诱导形成的胚性组织称为拟原球茎(protocorm like bodies) 即PLBs。原球茎或拟原球茎转入不含任何激素或生长素的培养基(如MS)便可再生出完整小植株。 影响原球茎发生的主要有外植体的大小、来源、生理状态、培养基类型、激 素浓度，种类、处理时间及一些其它因素。 1.1.1 外植体 石斛组培拟原球茎的诱导可以选择花序枝、叶尖、茎节切段等［5］作外植体。Lam Chan LT等用D.somia的花序枝尖作外植体在VW培养基上诱导PLBs的发生，结果以1～3 mm的外植体形成的PLBs数目最多。取茎基部的分 蘖芽或茎的顶芽作外植体，前者好于后者。Kim报道取侧芽进行液体培养，在45 d内开始形成拟原球茎。以种子离体培养形成原球茎的能力与其种龄有关，叶秀［6］鳞取铁皮石斛2～6个月种龄的胚进行离体培养发现，种龄愈长；其胚细胞愈［7］多，萌发形成原球茎的频率就越高，但4，5，6个月种龄的胚差不多。曾宋君 用5种石斛的种子在N培养基上进行组培得出了相似的结论。 6 1.1.2 培养基 选择适宜的培养基对石斛的分化至关重要，常用的培养基为［8］MS，Nitch,Knudso C(KC),N等。Devi J等利用D.moschatum的茎尖在5种培6［9］养基上诱导PLBs的发生，结果以Nitch培养基的效果最好；Suman K1991年在KL，VW，MS，W，Nitch，Mitra 6种培养基上进行D.fimbria-tum种子的离体培养，结果发现在Nitch, VW上培养基上萌发率高达91%，其次是MS(85%)，在MS，Nitch，VW上培养 4～5 d便出现原球茎，其它培养基则出现较迟。MS培养基上获得的原球茎体积最大，因此作者推断D.fimbriatum的种子萌发及发育需［10］［7］要盐分较高的培养基。这与周华伟报道的石斛组培的结果相似。曾宋君以D.candium, D.loddigesi,D.wagii,D.densiflorum,D.fimbriatum 5种石斛在MS，KS，SH，VW，KC，改良N及PT培养基上进行离体培养，得出石斛的最适通6-1用培养基是改良N或PT培养基附加0.2 mgL的NAA和2%蔗糖。此外，侧芽和6 顶芽对培养基的要求也各不相同，VW液体培养基对节生花型石斛效果较好，在 4～5周内即可形成PLBs；蝶生花型和常绿类石斛的腋芽用KC固体培养基要比KC液体培养基好，以顶芽作外植体则正相反。继代和初代培养的培养基可以不 同。石斛的原球茎易分化成苗，故继代培养基以液体振荡培养可获得较佳效果。 1.1.3 激素 一般高浓度的细胞分裂素有利于诱导芽的发生，而高浓度的 2.4-D对愈伤组织的诱导形成有促进作用。愈伤组织的不分裂会导致拟原球-1基和不定芽的发生，Lan C以花枝尖作外植体在VW培养基上添加1 mgL6-BA-1-1-1和0.1 mgLNAA或添加1 mgLKintin和0.1 mgL2.4-D均能获得高比例的PLBs，［11］-1-1周月坤在MS培养基上附加0.5 mgL6-BA和0.5～2.0 mgL 2.4-D，由叶基部诱导产生愈伤组织，进而分化出拟原球茎获得完整植株，并指出2.4-D对诱导愈伤组织形成和分化有重要作用，NAA的加入对分化PLBs的有一定的促进作［12］-1用。王光远以D.candium种子离体培养，在MS上添加0.5 mgL NAA，暗处培养1周后产生大量的愈伤组织，转入光照培养，原球茎大量发生。外加激素-1ABA对原球茎的分化也会产生影响，在添加0.5 mgLABA的MS培养基上预培养-115d后转入含2 mgL6-BA的MS培养基上培养，150 d后其试管开花率达84.0%，而不用ABA预处理的，其成花率只有27.0%。如果原球茎继续在含ABA的培养基上培养则不会有培养体花芽的发生。 1.1.4 其它影响因素 除了外植体、培养基、激素影响外，光照、温度、pH以及外源添加物等也会影响原球茎或PLBs的发生及发育。石斛组培常用的温度为 (26?1) ?，光强1 600～2 000 lx，日照光8 h，pH为5.0～5.5。当然，在组织培养过程中由于培养体的代谢活跃改变培养基的pH，进而会影响到培养体的［13］生长，Sharon M等在培养D.snowfire原球茎的过程中发现，培养基的pH值在45 d后由5.1降至4.1，培养体变成褐色，但通过反复转入新鲜培养基可防 止或消除褐变现象。石斛组培过程中最常用的添加物是10%～25%的椰乳(CW)。［7］另据曾宋君的研究，CW可用廉价的香蕉汁，马铃薯汁、蕃茄汁取代。蔗糖对 胚萌发及成苗的效果不及白糖或片糖，在组培过程中加入活性炭是必要的，它可 以除去琼脂中的毒性物质或培养物产生的芳香族代谢废物、防止组织褐变，并刺 激胚胎的发生与生根。因石斛的胚性外植体即便在有生长素存在时也较难生根， 因此如何使芽生根则是成苗的关键。 影响3种类型器官发生的因素包括外植体、培养基、激素等。 1.2.1 无菌短枝型 又称节培法或微型扦插法，即将待繁殖的材料如石斛茎节、 花梗、枝等剪成带一叶的单芽茎段，转入成苗培养基中进行培养。Mosich S E［14］即是通过茎段培养获得完整小植株的，其方法是将石斛的茎段(长度＞10 cm)等 按2?3?2切成3段，上段灭菌5～7 min，中段10～15 min，下段20～15 min,灭菌后切去两端变色的组织，再横切成段，下端插入改良Knop培养基，4周后芽开始生长，随后转入MS培养基即获得石斛再生苗。 1.2.2 芽增殖型 即通过茎尖或初代培养的芽在适宜的培养基上诱导，不断发 生腋芽进而形成丛芽，随后转入生根培养基行生根培养从而获得再生植株。［15］Sobhana等利用5种石斛D.moschatum,D.fimbriatum,D.nobile,D.crumenatum 和D.pierardii腋芽分别以VW，KC，MS，Morel培养基进行离体培养，各培养基-1-1均附加3 mgL 6-BA和1mgLNAA，诱导芽的增殖，结果以VW产生的芽培养体数目最多。此外，作者以VW培养基附加BA或KT(浓度分别为1，2，3，4，5，6 -1-1mgL)添加或者不添加NAA(1 mgL)进行试验，证实6-BA可以产生最大数量的丛生芽，5种石斛中又以D.moschatum数目最多，D.pierardii添不添加NAA结果相似。这说明培养基的种类、激素的浓度及种类对不同石斛芽的增殖有很大影［16］响，如果以茎段作外植体，其取向至关重要。在Nayak Nr等的研究中，D.phylum和D.moschatum茎节切段作水平放置可以获得再生植株，而垂直放置的处理则无 任何茎芽的发生。值得注意的是Nihar Ranjan首次将一种高细胞分裂素活性的 物质thidiazuron(TDZ)应用于石斛的组织培养并与6-BA比较作用效果，结果后-1者比前者更有效。其最佳作用浓度为2.2～4.5 μmolL，提高TDZ的使用浓度会对茎芽的再生产生抑制作用。TDZ是1种杂环芳香脲，在大豆、小红萝卜的子［17］叶、烟草、金甲豆等组培中广范用于诱导芽的增殖，效果显著。在组织培养-1中若加入10.8 μmolL的6-BA，诱导生根会比NAA更有效。其特点是繁殖速度 快，是茎尖培养和脱毒菌初期必由之路，而石斛组培中的关键又在于促进生根。 1.2.3 不定芽发生型 由愈伤组织直接形成不定芽，然后转入生根培养基中可 诱导生根而形成完整的小植株。以石斛的基节，幼嫩小叶、花梗等作外植体均可 获得较好的诱导效果。此外也有由“原球茎”形成愈伤组织的报道。叶秀鳞观察 到由D.candium种子离体培养形成的原球茎，转入N培养基培养时，表面细胞6 发生不规则分裂，产生大量愈伤组织，随后由愈伤组织分化形成不定芽再发育成 幼苗。外植体的发育阶段不同也会影响其发育方向的不同，以基尖为例，带有叶 原基的茎尖顶端形成芽、基部则形成愈伤组织，而不带叶原基的茎尖只在基部形 成愈伤组织，随后分化出不定芽和拟原球茎。Madhuri Sharon等将原球茎一特定部位处作划伤处理，未划伤的作对照，结果发现划伤的原球基形成大量愈伤组 织而对照直接形成完整小植株。 在自然条件下仅铁皮石斛能传粉结果，结果率也仅有17.3%。虽然人工授粉［18］可以大大提高大多数石斛种的结果率(72.1%～100%)，但操作上费工又费时。制作人工种子则是一条可行的途径，可以原球茎或拟原球茎等为材料外加包被物［19］制得。郭顺星等已成功的以原球基为材料，3%海藻酸钠和2% CaCl为人工种2皮制成铁皮石斛人工种子，其在1/2MS+蔗糖的培养基上生长良好。但直接用于 栽培的人工种子却尚无研究。 组织培养过程中次生代谢产物的研究对石斛尤为重要，而这一研究在国内甚［20］1997年报道在石斛PLBs为鲜见或甚至是空白。国外也较少，仅Nan G L等的组织培养过程中有大量的松柏醇产生。同属于药用植物的人参、地黄等组织培 养过程中次生代谢产物人参皂苷，毛地黄苷等已进入工业化生产试验阶段。郑光［21］植等从三分三的根、茎、叶，种皮甚至是花药的愈伤组织培养产生莨菪碱及 东莨菪碱，且5种愈伤组织中以茎愈伤组织的两种生物碱产量最高，含量均超过 了原植物根的提取物。石斛植物中含有多种生物碱、抗癌菲、类黄酮等物质，这 些物质是否在组织培养中产生，产量在哪一阶段的培养中最高等，这些问题都有 待于研究，以便从根本上解决石斛生长缓慢，栽培条件要求较严的问题，并有利 于通过生物技术获取这些药用成分。 利用根癌农杆菌介导法获得转基因植物的关键是毒性基因的诱导表达，而在［20］单子叶植物中常常缺少这种诱导物质。近来的研究者Nan G L等在石斛组织 培养中发现PLBs发育早期有大量的松柏醇产生，它可诱导毒性基因的表达。如 果将在暗处培养的PLBs转入光照条件下培养，其含量呈6倍量增加。PLBs松柏 醇的产量是叶的11倍，这使通过农杆菌介导法可获得转基因植物，即将克隆的 花色基因、主成分表达基因等通过农杆菌介导法转入石斛PLBs成为可能。此外［22］基因枪法获得石斛转基因植物业已实现，Chia TF等已成功的将荧光素酶基因(luc)通过W粒子微弹射击导入PLBs，并在由PLBs培养成的小植株中表达。 石斛兰作为四大名兰之一，其观赏价值体现在花色艳丽、花期长。不同种、 品种的石斛兰其观赏价值又有很大区别，通过遗传转化，将克隆的具有高观赏价 值的基因导入石斛，一方面可以提高石斛价值，另一方面可以创造新品种，丰富 扩大石斛的种质资源。 在国内，石斛组织培养的研究相对其它植物来说起步较晚，与国外相比还有 一定的距离，但无论是在国内还是国外，石斛花药培养，原生质体培养等尚未见 报道。可喜的是国内的组织培养技术已相当成熟，这为石斛组织培养的研究提供 了很好的技术保证。国内有不少人研究石斛的组织培养，此间重要的是解决组培 苗的栽培问题，使石斛组织培养技术更好地为生产服务。 ［责任编辑 王康正］ ［基金项目］ 国家自然科学基金资助(3770903) 张明（重庆市中药研究院，重庆 400065） 夏鸿西（西南农业大学，重庆 400716） 朱利泉（西南农业大学，重庆 400716） 张玉进（西南农业大学，重庆 400716） ［参考文献］ ［1］ Vellupillai M,Swarup S,Chong Jingoh. Histological and Protein Chang During Early Stages of Seed Germination in the Orchid,Dendrobium Erumenatum.Journal of Horticultural. Science,1997,726:941. ［2］ 李满飞，徐国钧.商品石斛的调查及鉴定(?).中草药，1991，22(4)： 173. ［3］ 陈心启，吉占和.中国兰花全.北京：中国林业出版社，1998. ［4］ 徐云鹃，于力文.霍山石斛种子试管苗的培养.植物生理学通讯，1984， 4：35. ［5］ Lam Chan L T,Lee Sm.Inflorescence Culture of Some Tropical Orchid Varidties Singapore.Journal of Primary Industries.1996,24:35. ［6］ 叶秀嶙，程式君，王伏雄.黑节草未成熟种子的形态发育及其在离体培 养时的表现.云南植物研究，1988，10(30)：285. ［7］ 曾宋君，程式君，张京丽.五种石斛兰的胚培养及其快速繁殖研究.园艺 学报，1988，25(1)：75. ［8］ Devi J,Borthakur B,Deka P C.Clonal Propagation of Denelrobium Moschatum and Cymbidium Aloifolium Through Shoot-tip Culture Journal of the Orchid Society of India，1997,11(1～2):19. ［9］ Kumaria S,Tandon P.Asymbiotic Germination of Dendrobium Fimbratum var.oculatum H K.f.Seeds on Different Media.Proceeding of the Indian National.Science Academy,1991,57(3～4)：277. ［10］ Zhou H W,Li S J,Qian X H,et al.Effects of Some Factors on Plantlet Growth of Dendrobium in Tissue Culture.Journal of Zhejiang Agriculture University,1995,21(16):622. ［11］ 周日坤，王伏雄.兜辱石斛幼叶再生植株的研究.植物学集刊，1989， 12(4)：123. ［12］ 王光远，蔡海南，刘 培，等.石斛离体培养中ABA对诱导花芽形成的影响.植物学报，1995，37(5)：374. ［13］ Sharon M,Bagde B,Bapgle P.Regenerate Protential of Wound Inflicted Dendrobiam Snowfire Protocrms.Journal of the Orchid Society of India,1992,6(1～2):55. ［14］ Mosich S E,Ball E A,Arditti J.Clonal Propagation of Dendrobium by Means of Nodal Cuttings.A morchiol Soc Bull,1974,43:1055. ［15］ Sobhana A,Rajeevan P K.In Vitro Imltiple Shool Production in Dendrobium as Influenced by Cytokinin.Journal of Drnamental Horticulture,1993,(2):1. ［16］ Nayak N R,Rath S P,Satyanarayan P.In Vitro Progation of Three Epiphytic Orchid,Cymbidium Aloifolium(L.)SW.,Denerohium Aphyuum(Roxb)Fisch,and Dendrobium Moschatum(Buch ham)sw.Through Thidiazuron Induced High Frequency Shoot Proliferation.Scientia-Horticulturae,1997,71(3～4)：243. ［17］ Huetteman C A,Preece J E.Thidiuzuron:A Potent Cytokinin for Noody Plant Tissue Lulture.Plant Cell Tissue Organ Cult,1993,33:105. ［18］ 程式君.石斛的人工授粉.中国科学院华南植物研究集刊，1986,(3)：46. ［19］ 郭顺星， 曹文芩，张集慧,等.铁皮石斛人工种子制作流程及发芽研究. 中草药，1996，27(2)：105. ［20］ Nan G L,Tang C S,Kuehnle A R,et al.Dendrobium Orchids Contain an Inducer of Agrobaterium Virulence Genes.Physioloical and Molecular Plant Pthology,1997,51(6):391. ［21］ 郑光植，梁 峥.药用植物组织培养的研究?.三分三愈伤组织的培养及 莨菪碱、东莨菪碱的产生.植物学报，1976，18(2)：163. ［22］ Chia T F,Chan Y S,Chua N H.The Firefly Gene as A Non-invasive Reporter for Dendrobium Transformation.Plant Media,1995,61(2):1778. ［收稿日期］ 1999-08-24 周根余 谢 薇 程 磊 ：比较了不同无机盐浓度、不同碳源和不同pH值对铁皮石斛原球茎生长的影响。实验结果表明：铁皮石斛原球茎生长较适宜的培养基为MS+NAA 1 .-1L+w=3%蔗糖（pH为5.0）。 mg ：铁皮石斛；原球茎；生长因素 ：S682.31；R282.71 ：A ZHOU Gen-yu XIE Wei CHENG Lei Life & Environment Science College, Shanghai Teachers University, Shanghai 200234 PRC ：In the present experiments, the effects of the concentration of inorganic salts, carbon source and pH on the growth of Dendrobium .-1canducum Wall. ex Lindl. were studied. It was proved that MS+NAA 1 mgL+3% sucrose (pH=5.0) was suitable for the growth of Dendrobium canducum Wall.ex Lindl. ：Dendrobium canducum Wall.ex Lindl； Protocorm； Growth factors 石斛属兰科的附生兰类，是名贵的室内盆花，还是一种珍稀的药用花卉。铁 皮石斛(Dendrobium canducum Wall.ex Lindl.)是石斛属的一种珍贵品种，其药［1］［2］［3］用价值最高。铁皮石斛俗称铁皮枫斗，又称黑节草。在国内主要分布于云南、安徽、贵州、浙江、江西、广西、广东等省区。铁皮石斛是多年生草本，［4］生于石上者高为5～20 cm，生于树木上高达60 cm，直径4～8 mm。据报道，从铁皮石斛中提取制备的一种不溶性多糖物质，具有显著性增强免疫功能的效应［5］。铁皮石斛植株一般生长在林下水旁陡峭的岩壁或古树上，偏阴，空气湿润 凉爽的环境，耐干旱与严寒。通常与地衣、藓类和蕨类植物混生，组成常绿的地［6］被层。因铁皮石斛多生于悬崖峭壁上，自然繁殖力极低，常规繁殖又较难， 且我国多年来对铁皮石斛的采集量远大于其生长量，试管苗的商品化生产又存在 ［7］，所以我们对铁皮石斛原球茎生长中的无机一定困难，铁皮石斛已濒临绝迹 盐、碳源和pH值的影响进行了一组试验。 铁皮石斛(Dendrobium canducum Wall.ex Lindl.)无菌外植体由复旦大学生 命科学学院植物生物组提供。 .-1.-1 1/2MS固体培养基+NAA 1 mgL，蔗糖3%，培养温度(25?2) ?，光照12 hd，.-2.-1光照强度60 μmolms。 1.3.1 不同无机盐浓度对铁皮石斛原球茎生长的影响 称取外植体约3 g，分.-1别接种于NAA浓度为1 mgL,无机盐浓度分别为1/4MS、1/2MS、MS和2MS的培养基中。30 d后观察不同无机盐浓度对铁皮石斛原球茎生长的影响。获得的数［7］据均进行统计分析。 1.3.2 不同碳源对铁皮石斛原球茎生长的影响 称取外植体约3.5 g，分别接.-1种于碳源为蔗糖、乳糖和葡萄糖，NAA浓度为1 mgL的1/2MS培养基中。30 d后观察不同碳源对铁皮石斛原球茎生长的影响。 1.3.3 不同pH值对铁皮石斛原球茎生长的影响 称取外植体约4 g，分别接种.-1于pH值为4.5， 5.0， 5.4， 5.8以及6.4，NAA浓度为1 mgL的1/2MS培养基中。30 d后观察不同pH值对铁皮石斛原球茎生长的影响。 1.3.4 叶绿素含量的测定 采用分光光度法(752型分光光度计)测定叶绿素含［8 ］量。 1.3.5 可溶性糖含量的测定 采用蒽酮比色法(752型分光光度计)测定可溶性［8］糖含量。 在不同无机盐浓度中生长的原球茎，经30 d培养后，统计生长量见表1。 无机盐浓接种数/生长率平均生长率始重/g 鲜重/g 增重/g 度 个 /% /% 1/4MS 3.053 7 15 6.703 7 3.65 119.5 3.195 9 15 6.515 3.319 1 103.9 105.1 3.041 4 15 5.838 4 0.797 92.0 1/2MS 3.215 7 15 10.745 8 7.530 1 234.2 2.815 2 15 9.080 9 6.265 7 222.6 229.0 2.529 1 15 8.353 7 5.824 6 230.3 MS 3.214 6 15 13.368 8 10.154 2 315.9 3.167 8 15 12.965 2 9.797 4 309.3 298.9 2.938 15 10.916 7 7.978 9 271.6 2MS 3.165 3 15 6.317 1 3.151 8 99.6 2.700 1 15 5.330 5 2.630 4 97.4 96.0 2.526 8 15 4.827 8 2.301 91.1 从表1可以看出在MS中，原球茎生长最快。在1/4MS和2MS培养基中生长最慢。而且在2MS培养基中，原球茎有褐化、死亡现象。这表明无机营养浓度太 高，原球茎的生长不仅受到抑制，而且还会死亡。而营养太低，则不能满足石斛 生长所需的营养。对不同无机盐浓度的差异显著性进行了方差分析，结果表明： 不同的无机盐浓度对原球茎生长有极显著性差异(P<0.01)，所以有必要对其进行 q测验。结果发现除1/4MS和2MS之间无差异外，其余各浓度之间均有极显著性 差异。 由于生长在不同无机盐浓度中的铁皮石斛原球茎有色泽上的差异，生长在 1/4MS培养基中的原球茎色泽绿中偏黄，而其余三种颜色大致相同，所以对其进 行了叶绿素含量测定，结果见表2。 无机盐浓度 OD OD C C C C/C 663645abTab 1/4MS 1.295 0.645 14.84 7.59 22.43 1.95 1/2MS 1.189 0.501 13.75 5.01 18.76 2.74 MS1.067 0.452 12.34 5.36 17.7 2.30 2MS 1.110 0.467 12.84 5.50 18.34 2.33 表2的结果显示：在1/4MS培养基中生长的原球茎，其叶绿素总量比其它三 者稍高，而值得注意的一点是它的叶绿素a/叶绿素b含量最低。由于叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，这和我们观察到的其颜色比其它三种显得黄的现 象是相符的。 在不同碳源上生长的原球茎，经30 d培养后，统计生长量见表3。 碳 源 始重/g 接种数/个 鲜重/g 增重/g 生长率/% 平均生长率/% 乳糖 3.881 4 15 7.081 3 3.199 9 82.4 96.3 3.154 2 15 6.100 2 2.946 93.4 3.676 2 15 7.834 0 4.157 8 113.1 蔗糖 3.647 9 15 11.027 0 7.379 1 202.3 3.246 7 15 9.938 1 6.691 4 206.1 201.4 3.146 3 15 9.307 7 6.161 4 195.8 葡萄糖 3.957 6 15 10.618 6.660 4 168.3 3.669 0 15 9.741 2 6.072 2 165.5 168.4 3.437 1 15 9.328 3 5.891 2 171.4 从表3中可以看出，原球茎在蔗糖中生长最快，葡萄糖中其次，而乳糖中最 慢。方差分析的结果显示：不同碳源对铁皮石斛原球茎的生长有极显著性差异 (P<0.01)。因此，进行q测验，结果表明：不同碳源之间均存在极显著性差异。 生长在不同的碳源中，原球茎对外源糖的吸收量也不相同，可以从可溶性糖 测定中反应出来(见表4)。 .-1碳 源 OD 糖浓度/mg L 糖含量/% 625 蔗糖 0.306 79.63 1.59 乳糖 0.523 135.27 2.70 葡萄糖 0.556 143.73 2.87 结果表明：生长在葡萄糖和乳糖中的原球茎，其可溶性糖含量比在蔗糖中高 得多。这可能是由于在高温灭菌过程中，蔗糖和乳糖都会有不同程度的水解，石 斛对其吸收效率有所不同所致。据报道，铁皮石斛生长时对营养要求不是很高， 可溶性糖含量太高对其生长不利。本实验中,石斛原球茎在蔗糖中生长最好也从［10］侧面反映了这一点。宁玉祥等在黄皮(Clansena lansium(Lour) Skeels.)芽［11］外植体萌发试验中，发现果糖和乳糖最好。Borkowska B也曾进行了不同碳源对欧洲酸樱桃苗培养物转化酶适性和生长的影响的试验。蔗糖和葡萄糖的增殖率 相似，果糖的增殖率最低，但相应长苗的形成率最高。这也说明了在组织培养中， 每种植物在其生长的不同阶段对碳源的要求是不同的。 在实验中还发现，生长在以乳糖为碳源上的原球茎，其颜色比其它两种培养 基中的绿，所以进行了叶绿素含量的测定，见表5。 OD C C C C/C 碳源 OD663645abTab 蔗糖 0.932 0.542 10.38 8.05 18.43 1.29 乳糖 1.072 0.504 12.26 6.52 18.78 1.88 葡萄糖 1.125 0.630 12.59 9.16 21.75 1.37 叶绿素含量测定表明：三者之间的叶绿素总量相差不大。而在乳糖中生长的 原球茎,其叶绿素a/叶绿素b的比值最大。事实上，在乳糖中生长的原球茎色泽 确实是为深绿色，这同无机盐浓度实验中叶绿素测定的结果相符。 在不同pH值培养基中生长的原球茎，培养30 d后，统计生长量见表6。 pH值 始重/g 接种数/个 鲜重/g 增重/g 生长率/% 平均生长率/% 4.5 3.314 9 15 8.321 8 5.006 9 151.0 4.361 5 15 10.631 1 6.269 6 143.7 145.6 4.426 7 15 10.718 9 6.292 2 142.1 5.0 3.406 4 15 11.829 5 8.423 1 247.3 3.821 2 15 12.346 3 8.525 1 223.1 236.9 4.395 3 15 14.955 6 10.560 3 240.3 5.4 4.173 7 15 13.190 5 9.016 8 216.0 3.984 6 15 13.266 4 9.281 8 232.9 225.1 3.659 8 15 11.948 6 8.288 8 226.5 5.8 3.641 9 15 11.178 5 7.529 4 206.3 3.080 8 15 9.922 6.841 2 222.1 213.9 4.253 6 15 13.327 1 9.073 5 213.3 6.4 3.389 5 15 8.134 6 4.745 1 134.0 3.909 7 15 8.816 2 4.906 5 125.5 133.7 4.114 1 15 9.935 2 5.821 1 141.5 表6的数据显示：在pH为5.0的培养基中，其生长最快，5.4和5.8其次,4.5和6.4中生长最慢，而且生长在pH为6.4的培养基中的原球茎有褐化死亡现象。 对其进行方差分析，结果显示：不同pH值之间均有极显著性差异(P<0.01)，所 以进行q测验。结果表明：除5.0和5.4, 5.4和5.8间无差异，5.0和5.8间有显著性差异外，其余各pH间均有极显著性差异。pH值在5.0～5.4之间，对［12］。 铁皮石斛原球茎生长最好。这与兰花在自然界中偏喜酸性土质的特性相一致 作者简介：周根余(1946-)，男，江苏省溧阳市人，上海师范大学副教授，1968年12月毕业于上海师范大学生物系，现从事教学和植物遗传研究. 作者单位：周根余 谢 薇 程 磊 上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234 ［1］李立安.石斛组培技术的改进［J］.植物杂志,1990，（2）：30. ［2］徐建华,李 莉,陈立钻,等.铁皮石斛与西洋参的养阴生津作用研究［J］.中草药,1995，26（2）：79～80. ［3］张治国,刘 骅,王 黎,等.铁皮石斛原球茎增殖的培养条件研究［J］.中草药,1992，23（8）：431～433. ［4］沈保安.中国常用中草药石斛［M］.合肥:安徽科学技术出版社,1992.310～311. ［5］黄民权,黄步汉,蔡体育,等.铁皮石斛多糖的提取、分离和分析［J］.中草药,1994，25（3）：128～129. ［6］王立安. 铁皮石斛生境小记［J］.植物杂志,1990，（4）：29. ［7］曾采君,程武君,张京丽,等.五种石斛兰的胚培养及其快速繁殖研究［J］.园艺学报,1998，25（1）：75～80. ［8］裴洪平.生物统计学［M］.杭州:浙江教育出版社，1991.97～101，108～109. ［9］张志良.植物生理学实验指导［M］.第2版.北京:高等教育出版社,1994.88～ 92,160～162. ［10］宁玉祥,董昌贞.黄皮的试管繁殖［J］.园艺学报,1988,15(4):233～239. ［11］BORKOWSKA B. 不同碳源对欧洲酸樱桃苗培养物转化酶活性和生长影响［J］.［英］ J Exp Bot, 1991，42（240）：911～915. 摘自生物技术通报,1992，(5)：67. ［12］王康正,范 磊,高文远,等.药用石斛栽培的研究概况［J］.中国中药杂志,1998，23（6）：340～343. 收稿日期：1999-06-16 : 以铁皮石斛Dendrobium candidum Wall.ex Lindl.的茎段作外植体，比较 不同的培养基、激素等因素对茎段分化丛生芽的影响，以及不同浓度的香蕉汁和 活性炭对试管苗生根的影响。结果表明：1／2MS较好，BA作用优于KT、ZT， 最适浓度为2．0mg/L；丛生芽培养于1／2MS+10％香蕉汁+0．5％AC的培养基上，生根效果最好。 铁皮石斛快速繁殖和离体种质保存的研究 对铁皮石斛种子发芽、原球茎增殖、丛芽分化和壮苗培育进行了试验、观察和分析，研究了 培养基、植物激素、光强和添加剂等对其分化和生长的影响。结果显示：种子在1／2MS＋蔗糖2％的培养基上，30d萌发95％以上。原球茎在1／2MS＋椰子汁25％＋蔗糖3％的培养基上，45～60d原球茎增殖速度可达1：10。丛芽分化较适宜的培养基为1／2MS＋BA2mg?L^-1＋NAA0．2mg?L^-1＋IBA0．1mg?L^-1＋蔗糖3％，45～60d芽丛增殖速度为1：4～5。试管苗在MS＋香蕉泥20％＋蔗糖2％培养基上，大约60d苗快速长高，茎粗壮且根系发达。 离体保存材料可采用试管丛芽和原球茎两种方式，以保持其遗传多样性。保存方法是：在 15?左右条件下，保存离体材料，继代间隔期为12～18个月；也可以采用室温保存，在1/2MS＋蔗糖1％培养基上，继代间隔期可延长至10～12个月。[ 铁皮石斛不同繁殖代数遗传稳定性RAPD的研究 研究铁皮石斛单蒴果种子内不同无性繁殖代数的遗传稳定性.利用从100个随机引物筛选出23个稳定性较好的10碱基引物,对来自单蒴果的7代无性繁殖种苗进行RAPD.发现7代无性繁殖的组培苗内代代之间遗传距离很小,但代数相差越大其遗传距离就越大,在0～0.043 5范围内.其中在1～3代未探查到变异,但从第4代始,有部分引物RAPD带型发生变化,但变化甚微.23个稳定引物只探查到了7个变异位点.铁皮石斛组培过程中种内存在一定 的变异,但变异甚微,所以建立铁皮石斛稳定的无性快繁体系是切实可行的. 铁皮石斛原球茎生长分化及生根壮苗研究 目的：筛选适宜铁皮石斛原球茎生长分化及生根壮苗的培养基，提高继代扩繁系数和组培苗 的质量．方法：在相同的培养条件下，把相同发育阶段的原球茎接种于含不同激素比例的培 养基中生长；把丛生芽接种于蔗糖浓度不同的培养基中生长；把相同高度的幼苗接种于含不 同附加物的培养基中生长；对结果所产生的不同生长状况进行综合分析．结果：原球茎的增 殖以1／2MS添加BA2．0mg／L＋NAA0．5mg／L或BA30mg／L＋NAA0．5mg／L的激素比例为佳；原球茎分化以1／2MS添加BA2．0mg／L＋NAA0．2mg／L或BA3．0mg／L＋NAA0．2mg／L的激素比例为佳；丛生芽的生长中以30％蔗糖浓度的培养基为佳；生根壮苗中最佳的附加 物为香蕉。 铁皮石斛组织培养及试管苗营养器官和原球茎的结构观察 以铁皮石斛的茎尖为外植体，诱导产生原球茎，进一步培养形成幼苗。结果表明：原球茎诱 导以1／2MS＋6-BA0．3mg?L^-1＋KT0．1mg?L^-1＋LH 1．0g?L^-1为最优，而生根培养以MS＋NAA0．05mg?L^-1＋KT0．1mg?L^-1＋叶酸2．0mg?L^-1＋La稀土10mg?L^-1为佳。对铁皮石斛试管苗营养器官及原球茎的解剖学研究表明，根由复表皮、皮层和维管柱组 成，皮层发达，初生木质部五原型，中央具髓；茎由表皮、基本组织和散生维管束构成；叶 为等面叶，在上下表皮处分巾有厚壁组织；原球茎是由顶端分生组织后面的薄壁细胞脱分化 形成胚性细胞经球状胚发育而来。 铁皮石斛原球茎液体悬浮培养的研究 目的 研究铁皮石斛Dendrobium candidum原球茎液体悬浮培养的可行性以及接种量和培养 液体积对原球茎生长的影响。方法 利用完全随机实验设计和正交试验设计研究不同基本培 养基、接种量和培养液体积对原球茎生长的影响。结果 无论鲜重还是干重，铁皮石斛原球 茎在液体培养基上均极显著好于固体培养基(P<0．001)。不同基本培养基对铁皮石斛原球茎 生长影响的研究表明，培养天数为30d时，对于鲜重：67-V极显著好于B。(P<0．01)，B5极显著好于1／2MS(P<0．01)，1／2MS显著好于MS(P<0．05)；对于干重：67-V与B5没有显著性差异(P>0．05)，B5极显著好于1／2MS(P<0．01)，1／2MS极显著好于MS(P<0．01)。接种量和培养液体积对原球茎生长影响的研究表明，接种量影响最大，体积其次，互作最小， 若不考虑互作，对于鲜重和干重，最佳处理为：接种量6．194g／瓶+培养液体积150mL／瓶或100mL／瓶；对于干重，若考虑互作，接种量为6．194g／瓶时，应选培养液体积150mL ／瓶或100mL／瓶，接种量为3．102g／瓶时，应选培养液体积150mL／瓶或100mL／瓶，接种量为1．693g／瓶时，应选150mL／瓶或50mL／瓶。结论液体悬浮培养对铁皮石斛原球茎 的生长有利，获得了最佳基本培养基、接种量和培养液体积的最佳搭配，表明通过液体 悬浮培养生产铁皮石斛原球茎具有较好的开发应用前景。 建立铁皮石斛原球茎悬浮系，作为人工种子繁殖体。方法 对铁皮石斛原球茎悬浮培养条件 进行比较选择，并测定生长增殖状况。结果 悬浮培养的原球茎分散性好、整齐均一。悬浮 培齐的最适培养基为1／4MS+40mg／L Vc，pH5．6，摇床转速为50r／min，15d继代一次，黑暗培养。培养基中添加0．5mg／L ABA预培养30d，原球茎的质量提高、同步性更好。 异噻唑啉酮对铁皮石斛组培生产中细菌污染的防治作用 铁皮石斛Dendrobium candidum是我国传统的名贵药用植物。近年来从事铁皮石斛组培生产 的企业13趋增多，为实现盈利，生产中污染率的控制是关键技术之一。在实践中，我们逐 步摸索出控制细菌污染的有效方法，找到一种既能达到防治污染，又能促进试管苗生长发育 的杀菌剂——异噻唑啉酮(isothiazolone)。