日本圆叶海棠组培苗的快速繁殖

日本圆叶海棠组培苗的快速繁殖 日本圆叶海棠组培苗的快速繁殖 面北虐趾2010,19(2):183—188 ActaAgriculturaeBorealioccidentalisSinica 日本圆叶海棠组培苗的快速繁殖 陈宗礼,高彦,刘娜.,齐向英,李霞,张向前,李宁 (1.延安大学生命科学学院,陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心,陕西延安716000 2.陕西省果树良种苗木繁育中心,陕西铜川727031;3.陕西省延安中学,陕西延安716000) 摘要:以日本圆叶海棠初代培养获得的茎段为外植体,采用正交和随机区组设计培养基进行继代和生根培 养.建立了El本圆叶海棠试管苗快繁体系,并优化获得其适宜继代的培养基MS+IBA0.2mg/I+6-BA 0.3mg/I+蔗糖3+琼脂O.55,适宜的生根培养基为1/2MS+IAA0.5mg/I+蔗糖2+琼脂 0.55.研究明,MS基本培养基附加低浓度水平的6-BA与IBA的激素组合,有利于丛生芽的诱导,1/2 MS基本培养基附加低浓度的IAA,有利于根的诱导,NAA与IBA不适用于生根.生根苗的移栽可采用温室 自然光过渡法炼苗后,以蛭石为基质的营养钵移栽法. 关键词:日本圆叶海棠(Maluspruniliavar.ringo);茎段快繁;继代与生根培养;生根苗移栽 中图分类号:Q943.7;$722.3文献标识码:A文章编号:1004—1389(2010)020183—06 RapidPropagationofTissueCultureSeedlingofthe JapaneseMalusprunifoliavat.ringo CHENZongli,GAOYan,LIUNa.,QIXiangying,LIXia, ZHANGXiangqianandLINing (1.ShaanxiEngineering&TechnologicalResearchCenterforConservation&Uti lizati0nofRegional BiologicalResources,CollegeofLifeScience,YananUniversity,YananShaanxi716000.China: 2.ShaanxiProvinceFruitTreeImprovedVarietyNurseryStockBreedingCenter,TongchuanShaanxi 727031,China;3.YananMiddleSchoolofShaanxi,YananShaanxi716000.China) Abstract:TakentheoriginalculturedstemsectionsofJapaneseMaluspruniJoliavar.ringoasex— plants,themediumsforsubcultureandrootingcultureweredesignedbyusingtheorthogonalandthe randomizedblockexperiments.Then,therapidpropagationsystemoftubeseedlingofJapaneseMa— lusprunifoliavar.ringoW3Swellestablished.Theresultsshowedthatthesuitablemediumforsub— culturewascomposedofMS+IBA0.2mg/L+6-BA0.3mg/L+sucrose3+agar0.55%,and mediumforrootingculturewascomposedof1/2MS+IAA0.5mg/I+sucrose2+agar0.55. ItindicatedthattheadditionofthelOWconcentrationof6一 BAandIBAtoMSbasicmediumiSadvan— tageoustotheinductionofaxillarybud.Moreover,1/2MSbasicmediumcombinedwiththelowcon— centrationofIAAwasusefultotherootinginduction.However,NAAandIAAwerenotsuitablefor therootingculture.Transp1antingOfrootingseedlingsmayusethemethodofgreenhousenatural lighttransitiontobuilduptheseedlingafter,usethenutritionearthenbowltransplantsingreenhouse takethevermiculiteasthematrix. Keywords:JapaneseMalusprunifoliavar.ringo;Stemsectionsregeneration;Subcultureandroo— tingculture;Transplantingofrootingseedlings 优质苹果苗木及其砧木的选育与生产一直是苹果商品生产中倍受关注的课题.日 本圆叶海棠 收稿日期:200905—06修回日期:2009—0903 基金项目:陕西省教育厅重点项目资助. 作者简介:陈宗礼(1954一),男,陕西扶风人,教授,硕士生导师,从事遗传学教学与植 物遗传育种研究.Email:Zongli—chen@ya hoo.com.cn 西北农业 (Malusprunifoliavar.ringo)为秋海棠科,秋海 棠属多年生草本植物,生长势好,抗逆性强,是用 于苹果嫁接的一种优良砧木,并与苹果具有良好 的嫁接亲合性,且生长量大l1],以挂果早的独特 优点成为取代传统海棠品种的优良砧木,在生产 上有很重要的应用价值.目前,引种的日本圆叶 海棠的数量比较少,大大地限制了优质苹果的生 产,而组织培养是良种苗木快速繁育的有效途 径嘲.Saito等嘲进行了富士苹果叶片原生质体 培养再生植株的研究,国内有对银星海棠,丽格海 棠,玫瑰海棠和球根秋海棠等组织培养研究 的报道,而对日本圆叶海棠组织培养的研究很少. 本试验通过研究基本培养基与外源激素对日本圆 叶海棠茎段的组织培养以及基质对组培苗移栽成 活率的影响,旨在筛选适合日本圆叶海棠茎段继 代增殖和生根的培养基及移栽条件,提高其快繁 效果,为市场提供大量的优质苹果砧木. 1材料与方法 1.1材料 日本圆叶海棠(Malusprunifoliavar.rin— go)由陕西省果树良种苗木繁育中心提供.在无 菌条件下选生长健壮,生长势好且基本均匀一致 的日本圆叶海棠试管苗,截取约1cm长的单芽茎 段作为试验外植体. 1.2试验设计 1.2.1继代增殖培养基设计按照3因素两水 平的L4(2).正交试验设计方法口_】8_,因素A为 基本培养基,设为MS,3/4MS两水平.因素B 为6-BA,设0.3,0.5rag/L(单位下同)两个浓度 水平.因素C为IBA,设0.2,0.4两个浓度水 平.4种试验处理见表1.各处理均附加3蔗 糖,0.55琼脂,pH为5.8,继代增殖培养每瓶 中接人6个外植体,每处理接入20瓶置培养室培 养.重复两次. 1.2.2诱导日本圆叶海棠茎段生根培养基设计 按照单因素随机区组试验设计方法,设计5种 培养基如下:?1/2MS+IBA0.3;?1/2MS+ IBA0.5;?1/2MS+NAA0.5;?1/2MS+IAA 0.5;?1/2MS+IBA0.3+IAA0.5.以上5种培 养基均附加2蔗糖,0.55琼脂,pH为5.8, 诱导生根培养每瓶中接人5个外植体,每种处理 接人2O瓶,置培养室中培养.重复3次. 以上试验的培养条件均为:温度24,27?, 相对湿度为60,65,光照强度为1500, 20O0lx,每日光照12h. 1.2.3日本圆叶海棠试管生根苗移栽试验设计 按照单因素随机区组试验设计方法,设计4种 移栽基质:蛭石;蛭石+腐殖土(3:1);蛭石+沙 (3:1)和沙+腐殖土(3:1).以上4种基质均用 800倍2O多菌灵消毒处理,然后装入六棱营养 钵中.当生根苗长至5cm左右时,参照陈宗礼 等口方法将其放入温室自然光下封口炼苗7d, 再开口炼苗2d.之后,小心取出生根苗并洗净 根部琼脂,用0.3高锰酸钾液消毒根部,移栽 装有不同处理基质的营养钵中,每种处理移栽 200棵苗,浇透水置温室苗床上,立即盖好小棚, 棚上覆遮光率60,709/6的遮阳网,维持棚内温 度20,33?,相对湿度85以上.重复3次. 待小苗长高到10cm左右时,逐渐撤网揭棚并加 强管理. 1.3试验结果的统计与处理 外植体培养至4,7d后定时进行观察统计, 分别测定其新增殖芽数,苗高和生根率,以培养至 30d时的繁殖系数,增生度,生根度作为统计分 析指标.试管苗增殖阶段,繁殖系数和相对苗高 相矛盾,单位时间内,繁殖系数过高有效苗则减 少,单枝芽生长快能很快形成有效苗但繁殖系数 相对降低,实际栽培中既要求有较高的繁殖系数, 又要求新增芽能很快长高以形成较多的有效增殖 苗,所以单凭分析任何一个单一指标很难判断试 管苗的增殖生长程度,为此笔者采用增生度来衡 量试管苗增殖培养阶段繁殖和生长的程度,增生 度:繁殖系数×相对苗高,繁殖系数=新增殖芽 数/接种数,相对苗高一实测苗均高/接种外植体 均高;同样试管苗生根培养阶段,既要求其生根率 高,又要求其生根数多且生长快,以尽快形成有效 生根苗,为此笔者采用生根度来衡量试管苗在这 一 阶段根发生和苗生长的程度,生根度一生根率 (生根苗数/接种数)×平均生根数×相对苗高. 试管苗移栽40d后,生长到10cm左右时,统计 其移栽成活率. 2结果与分析 2.1培养基组成对日本圆叶海棠继代培养效果 的影响 日本圆叶海棠试管苗茎段继代增殖培养至 10d左右,外植体基部切口处生长出少量淡黄 2期陈宗礼等:日本圆叶海棠组培苗的快速繁殖 色,致密的愈伤组织(图1—1A),叶腋处有芽点生 成(图1-1B).继代培养至15d左右,由外植体基 部(图1—2),基部愈伤组织(图1—3,图1—4B)及叶 腋(图1-4A)上陆续分化出小芽,约至30d左右 形成健壮的丛生芽苗(图1_5).试验结果见表1, 繁殖系数,相对苗高和增生度三因素的主成分分 析结果见表2. 1,5.在Ms+IBA0.2mg/I+6BA0.3mg/I培养基E继代培养的日本园叶海棠的生长发育状况:1.培养至10d时外植体基部 切口生长出淡黄色,致密的愈伤组织(A),叶腋处有芽点生成(B);2.培养至l5d时外植体基部生出丛生芽的生长状况;3.培养至15d 时外植体基部愈伤组织上生出丛生芽的生长状况;4.培养至20d时叶腋处生出丛生芽的生长状况(A)及外植体基部愈伤组织上生出丛 生芽的生长状况(B);5.培养至30d时日本园叶海棠的生长状况;6.在Ms+1AA0.5mg/I培养基上生根培养至30d时日本园叶海棠 根的萌发生长状况;7.在附加蛭石的营养钵中移栽4Od后成活的日本园叶海棠组培茁GrowthconditionoftheJapancseMaluspruni— foliavar.ringoofsubcuhuredintheMS+IBA0.2mg/I+6BA0.3mg/Lmedium:1.(;rowingcal lioflightyellowwithfineand closeofsubculturetO10daysfromcutofendofexplant(A).Growingbadofsubculturetol0da ysfromleafaxil(B):2.Growingcondi— tionofclumpedbadofsubcuhuretol5daysfromendofexplant(A);3.Growingcondilionofclumpedbadofsubculturetol5daysfrom calliofendofexplant(A);4.(;rowingconditionofclumpedbadofsubcultureto2Odaysfromleafaxilofexplant(A),andgrowingcon— ditionofclumpedbadofSUbcuhureto20daysfromcalliofendofexplant(B);5.(;rowingconditionoftheJapaneseMalusprunifolia var.ringoofsubcultureto30days;6.RootgerminationgrowthconditionoftheJapanescMalusprunifoliavar.ringoofrootingculture to30dintheMS+IAA0.5mg/Iculturemedium;7.CultivarsurvivaltissuecultureseedlingofJapancseMalusprunifoliavar.ringoin theadditionalvermiculitenutritionearthenbowl(40d). 图1日本圆叶海棠组培苗生长发育状况 Fig.1GrowthconditionofthetissuecultureseedlingsoftheJapaneseMalusprunifoliavar.ringo 表2矩阵分析结果表明,第一主成分X1代(R)分析表明,试验因子对主成分影响的 主次顺 表了繁殖系数,相对株高和增生度这3个指标 94.44的信息,所以可用主成分X1来衡量日本 圆叶海棠试管苗茎段继代培养的效果.通过转化 矩阵得X1的计算公式:X1—0.581047×繁殖系 数+0.479858×相对苗高+0.560739×增生度, 通过该公式计算出试验H1,H4的X1数值后再 进行方差分析和多重比较(表3).主成分极差 序为IBA>6BA>基本培养基;说明如果基本 培养基的盐浓度在适宜范围内,适宜的IBA和6一 BA浓度水平组合可有效地提高日本圆叶海棠茎 段的继代培养效果.各试验因子对主成分影响的 方差分析表明,基本培养基MS和3/4MS盐浓 度间无显着差异,IBA和6一BA的1水平浓度 (0.2和0.3mg/L)均极显着地优于其2水平浓 ? 186?西北农业19卷 度(0.4和0.5mg/L).本试验筛选出适宜的继mg/L+蔗糖3+琼脂0.55%,培养30d增 代培养基为:MS+IBA0.2mg/L+6-BA0.3生度可达6.66. 表1培养基组成对日本圆叶海棠继代培养的L|(2)正交试验结果 Table1TheL4(2)orthogonalexperimentOilmediumcompositionstothesubcultureofMalu sprunifoliavar.ringo 注:表中数据为培养30d的观察结果.增生度=繁殖系数×相对苗高.相对苗高一实 测苗均高/接种外植体均高(以下生根度计算同 此). Note:Thetentativedataintablelwastheobservedresultsbycultureto30day.Multiplygrowin gdegree—propagationcoefficient×re1一 ativeheightofseedling.Therelativeseedlinghigh— actualseedlingsAveragehigh/averageheightofincubatedexplants(thesameas followingtablesofrootingdegree). 表2繁殖系数,相对苗高和增生度3因素的主成分分析结果 Table2Analysisofprincipalcomponentonpropagationcoefficient,relativeseedlingheighta ndmultiplygrowingdegree 表3基本培养基及激素组合对日本圆叶海棠继代培养的影响 Table3Effectsofthebasalmediumandhormoneonthesubcultureof thestemsectionsfromJapaneseMalusprunifoliavar.ringo 注:表中数据为培养30d的观察结果.主成分x1为试验数据繁殖系数,相对苗高和 增生度通过转化矩阵计算的数据X1—0.581047 ×繁殖系数+o.479858×相对苗高+O.560739×增生度.增生度=繁殖系数×相对 苗高.相对苗高一实测苗均高/接种外植体均高 (以下生根度计算同此). **LSR检验结果.大写字母表示差异达0.01极显着水平,小写字母表示差异达0.05 显着水平(下表生根度平均值中的字母同 此). Note:Thetentativedataintable3wastheobservedresultsbycultureto30day.TheprincipalcomponentX1wastentativedataofprop— agationcoefficient,relativeheightofseedlingsandmultiplygrowingthroughthetransformationmatrixrepresentationdata.X1— 0.581047×propagationcoefficient+0.479858×relativeheightofseedlings+0.560739× multiplygrowingdegree.Multiplygrowing degree—propagationcoefficient× relativeheightofseedling.Therelativeheightofseedling=actualseedlingsAverageheight/average heightofincubatedexplants(thesameasfollowingtablesofrootingdegree). **ResuItsofLSRtest.Thecapitalletterexpressedthedifferencereaches0.01extremelyremarkablelevel,thelowercaseletterex— pressedthedifferencereaches0.05remarkablelevel(innexttablerootingdegreemeanvaluelettersynchronousnote). 2.2培养基组成对日本圆叶海棠生根培养效果培养至7d后苗基部长出白色辐射 状根的生长 的影响 将日本圆叶海棠试管苗剪成约1cm左右含 芽茎段,接种在设计好的5种生根培养基中培养. 点,到15d左右,根长约2cm左右,30d左右根 长至3cm左右;处理4的平均生根率达93.33%, 每株平均生根6条以上,相对苗高3.99cm.生 2期陈宗礼等:日本圆叶海棠组培苗的快速繁殖?187? 根培养至30d的生根度测定结果与方差分析见 表4,生长状况见图3.表4F检验结果:F处理阃=== 2017.83>>F?1(4,10)一5.994,说明5种处理 间差异极显着.各处理生根度均数的多重比较 (R检验)显示,处理4极显着于2,1,3,5,处理2, 5极显着于1,5,3,处理1显着于5,3,处理3,5 浓度水平(0.5mg/L)下,以IAA诱导生根效果 最好(23.20q-0.09),IBA次之(8.52?0.46), NAA最弱(4.83?0.27).IBA与IAA的协同作 用(5.o6?0.28)与单独使用NAA相当而弱于 单独使用IBA.试验筛选出日本圆叶海棠生根的 适宜培养基为1/2MS+IAA0.5mg/L+2 相互问无显着差异.表明外源植物生长素在相同蔗糖+0.559/6琼脂. 表4培养基对日本圆叶海棠生根培养的影响 Table4EffectsofmediumcompositionsonrootingcultureofJapaneseMalusprunifoliavat.ri ngo 注:基本培养綦为1/2MS;*生根厦一生根翠×半均生根数×相对苗商(30day—old). Note:Thebasicculturemediumisl/2MS;*Rootingdegree—Rootedrate×No.ofaveragerooted×Relativeheightofseedling(30 day—old). 2.3不同处理对日本圆叶海棠组培苗移栽成活显着优于蛭石+腐殖土,蛭石+沙和沙+腐殖土 率的影响3种基质,其次是蛭石+腐殖土(82.67),极显 生根苗移栽后40d的成活率统计分析结果着优于蛭石+沙和沙+腐殖土两种基质,沙+腐 见表5,生长状况见图1—4.表5方差分析显示,殖土的移栽成活率(54.00)最低,试验筛选出 F处理一73.85>F(3,6)一9.78,说明不同的日本圆叶海棠生根苗适宜的营养钵移栽基质为蛭 移栽基质对海棠组培苗的移栽成活率有极显着的石.不同基质处理的移栽苗的生长状况调查显 影响.各处理成活率均数的多重比较(R检验)显示,以蛭石+腐殖土为基质的长势较好,蛭石基质 示,以蛭石基质的移栽成活率(91.17)最高,极次之,蛭石+沙基质再次,沙+腐殖土基 质最差. 表5不同处理对移栽苗成活率的影响(40d) Table5EffectsofthedifferenttreatmentsOilsurvivalrateoftransplantingseedlings 3讨论 试验建立了日本圆叶海棠组培苗的试管块繁 体系.其中筛选出继代培养的适宜培养基为MS +IBA0.2mg/L+6BA0.3mg/I+3蔗 糖十0.55Y00琼脂,30d左右可长成高3,4ClTI 的丛生芽苗,增生度达6.40;生根培养的适宜培 养基为1/2MS+IAA0.5mg/L+2蔗糖+ 0.55%琼脂;生根苗的移栽可采用以蛭石为基质 的营养钵移栽法.利用该继代,生根培养与移栽 系统,对日本圆叶海棠取得了满意的快繁效果. 培养基中的盐浓度水平既反映出海棠在不同 西北农业19卷 生长发育阶段器官发生和增长对营养素需求的特 点,又影响培养基中渗透压的变化,从而影响到细 胞,组织和器官生长发育的生理生化代谢过程. 一 般而言,速生树种宜用高盐培养基,慢生树种需 要适当降低盐浓度;继代培养时需提高盐浓度,生 根培养时则需适当降低盐浓度.这是因为培养基 内无机盐浓度高时有利于发生茎和叶,而较低时 有利于生根_2.海棠是较速生树种,选择盐分适 当较高的基本培养基对其组织生长分化有利.本 试验表明,海棠继代培养中,以MS全量盐浓度 和3/4MS盐浓度较适宜,生根培养则以1/2MS 盐浓度较适宜. 培养基中,营养素和激素协同作用于外植体 而影响其生长发育.一般认为,在一定的营养素 水平下,植物器官的分化(如丛生芽的诱导)取决 于内源激素的平衡,外源激素通过改变内源激素 的平衡而产生作用,为了使内源生长素和细胞分 裂素达到平衡,外加的细胞分裂素及生长素要求 达到一定的浓度和比例,才使器官发生达到预期 目的].李任珠和卢海强等报道,在银星海棠 组织培养中较高细胞分裂素与生长素浓度对芽的 生长产生抑制作用.在本试验中,以MS为基本 培养基,附加低浓度水平的6-BA与IBA的激素 组合,使日本圆叶海棠外植体形成明显的丛生芽 苗(如H1处理),而6一BA/IBA一0.5/0.4较高 浓度水平的组合则极显着降低培养效果(如H2 处理),说明圆叶海棠组培中对激素的配比浓度水 平要求相似于银星海棠.同时显示,当6-BA/ IBA<1时抑制芽的发生(如H3处理),>1时则 可显着促进芽的发生(如H4处理). 试管苗主要以异养为主,茎叶幼嫩,其组织 发育不佳,叶表皮缺乏蜡质和气孔关闭功能,对 外界环境的适应能力极差.因此,试管苗移栽的 关键是要把握让其逐渐适应,使之能迅速形成保 护组织,增强抗性,防止根茎霉烂,尽快扎根,以 获得自养能力而提高移栽成活率.温室自然光过 渡法炼苗,可使苗叶生长健壮,促使保护组织的 形成,从而增强光合能力和对外界环境的适应能 力;消毒处理过的蛭石透气性好,并有利于保湿排 水,可防止移栽苗根茎部霉烂;移栽初期扣小拱 棚保湿保温,适度遮阳,这些措施可保证小拱棚 内微环境相对保持在类似于培养瓶的高湿高温条 件下,可防止幼苗失水萎蔫,进一步促使其保护 组织和自我调节能力的完善,以尽快生根转变为 自养.采取以上综合移栽措施都有利于提高移栽 成活率. 参考文献: [1]白海霞,高彦.圆叶海棠苹果自根苗培育技术[J].果农 之友,2007(11):15,24. 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