表皮葡萄球菌双组分调控系统的生物信息学分析_cropped

皮葡萄球菌双组分调控系统的生物信息学_cropped 表皮葡萄球菌双组分调控系统的 生物信息学分析 ???????* 扬秦智强钟张健何有裕吴 旸 江娟 ? ? ?* 涤陈洁敏罗小民瞿 (? 复旦大学医学院教育部卫生部分子病毒重点实验室, 上海 200032; ? 复旦大学生命科学学院生物多样性与生态教育部 重点实验室, 上海 200433; ? 上海生物信息技术研究中心, 上海 200235; ? 中国科学院上海药物研究所药物发现与中心, 上 海 201203; ? 中国科学院上海生命科学研究院生物信息中心, 上海 200031 . * 联系人, E - mail: yangzhong@fudan.edu.cn ;dqu@shmu. edu.cn) 摘要 应用序列同源性比较及功能域分析等生物信息学手段, 从表皮葡萄球菌全基因组序列中发现 16对双组分调控系统以及 2 个相对保守的功能域(HATPase_c 和 REC). 通过与金黄色葡萄球菌和枯草杆菌 中的双组分调控系统基因比较, 预测表皮葡萄球菌中同源双组分调控系统基因可能具有参与调控细菌 生长、生物膜形成、毒力因子表达等重要生物学功能. 对 16 对双组分调控系统基因的 2 个保守性功能域进行空间结构模建, 获得 4 个相似的组氨酸蛋白激酶 HATPase_c 功能域模拟结构以及 13 个相似的反 应调节蛋白 REC 功能域模拟结构, 其中 HATPase_c 结构在 AMP-PNP 的结合部位形成袋状结构, 而 REC 结构中均包含 3 个天冬氨酸活性位点. 初步实验结果表明表皮葡萄球菌双组分调控系统保守性功 能域的生物信息学分析可以为进一步开发相关治疗药物提供潜在的靶标. 关键词 表皮葡萄球菌 双组分调控系统 组氨酸蛋白激酶 反应调节蛋白 生物信息学 药物靶标 表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)是寄 应调节蛋白的调控区域能与磷酸化的组氨酸蛋白激居于人体皮肤表面常见的一种条件致病菌, 通常并 酶相互作用, 将激酶上的磷酸基团转移到自身的天 不致病. 然而, 随着各种人工医疗材料(如人工瓣膜、 冬氨酸位点上, 发生自身磷酸化, 并能激活效应区, 使其构像改变, 暴露不同的 DNA 结合位点, 结合不 静脉留置管和导尿管等)的普遍使用, 表皮葡萄球菌 已成为引起医院内感染主要的致病菌之一. 由于表 同的 DNA 序列产生一系列的调控反应. 本研究应用 序列同源性比较及功能域分析等生物信息学手段, 皮葡萄球菌能在医疗植入材料表面形成生物膜样结 从表皮葡萄球菌 ATCC12228 株中发现其双组分调控 构, 而该结构具有抵抗抗生素治疗和宿主免疫系统 [1,2]系统, 并对双组分调控系统的保守性功能域进行空 的作用, 从而导致耐药株发生及慢性感染. 新药 间结构模建, 以期发现可作为潜在药物靶标的保守 研究表明, 深入了解致病菌的基因结构与功能是发 结构和共有活性位点. 现药物靶标的关键, 这也为开发表皮葡萄球菌治疗 药物提供了新的思路. 近来, 我们与国家人类基因组南方中心合作在 [3 ]国际上率先完成了表皮葡萄球菌的全基因组测序. 1 材料与方法在此基础上, 对可能作为药物靶标的双组分调控系 [4] ( ? ) 细菌基因组序列 . 表皮葡萄球菌 统进行了生物信息学分析. 双组分调控系统由组氨 酸蛋白激酶和反应调节蛋白组成, 普遍存在于各种 ATCC12228 株全基因组序列 (GenBank 收 录号 : [3]原核生物中, 具有参与调控生物生长、毒力等多种重 AE015929)全长 2499279 bp, 含 2419 个编码序列, 要生物学功能. 当外界信号作用于组氨酸蛋白激酶 全基因组 G+C 含量为 32.1%. 的膜外配体结合区时, 激活激酶的 ATP 结合部位, 结 (?) 同源性比较与功能域分析. 采用 BLASTN 合、水解 ATP 为 ADP, 并将 ATP 的磷酸基团转移到 和 BLASTP 软件, 将表皮葡萄球菌序列与金黄色葡 激酶的组氨酸位点, 使其发生自身磷酸化. 随后, 反 萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)以及大肠杆菌(Escherichia coli)等序列同源性 进行比较; (G+C)含量计算采用 DNAsisst V2.0 软件; 功能域分析在 SMART 和 Pfam 蛋白序列数据库系统 说明组氨酸蛋白激酶基因序列变化大于反应调节蛋 上完成.白基因. 16 对双组分调控基因(G + C) 含量最低为 (?) 空间结构模建. 表皮葡萄球菌双组分系统 27.4%, 最高为 37.8%, 与全基因组(G+C)含量(32.1%)保守性功能域的空间结构同源模建采用: (1) Swiss- 无显著差异, 说明这些双组分调控系统基因来自其 [5~7]model 软件, 所获结构用 Molscript 软件(Avatar 公 他非亲缘菌近期水平转移的可能性很小. 司)修饰; (2) 专业的蛋白结构同源模建软件 Insight? 通过与金黄色葡萄球菌和枯草杆菌中双组分调(Accelery, San Diego 公司). 蛋白表面性质分析采用 专业软件 Sybyl V6.8(Tripos 公司). 控系统基因的同源性比较, 预测了表皮葡萄球菌中 2 结果 一些双组分调控系统基因参与调控的功能(表 2). 此 外, 通过对双组分调控系统基因上下游序列的分析 2.1 双组分调控系统基因序列分析及同源性比较 对表皮葡萄球菌全基因组序列进行生物信息学 还发现至少存在 3 个操纵子(Agr, Yyc 和 Nar 操纵子) 分析, 发现了 16 对双组分调控系统基因. 同时, 参照 中含有双组分系统基因, 目前已有文献报道 Agr 操纵 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)中的双组分调 子与表皮葡萄球菌的群体感应、生物膜形成等功能密 控系统分类方法及常见信号转导分子家族的结构特 [10] 切相关 ; 而 Nar 操纵子含有数个硝酸还原酶亚单 位基因, 因此可能与细菌的氮类物质代谢相关.[8,9]2.2 双组分调控系统基因功能域分析 对所发现的 16 对双组分调控系统基因进行了 点, 亚类分析(表 1). 结果表明, 16 个组氨酸蛋白激酶中 基于 SMART 和 Pfam 蛋白序列数据库, 发现表 有 3 个不属于任何目前已知的组氨酸蛋白激酶家族,皮葡萄球菌 16 对双组分调控系统基因中所存在的已 而 16 个反应调节蛋白均属已知的反应调节蛋白家族,知功能域(表 3), 其中 16 个组氨酸蛋白激酶均存在结 表 1 16 对双组分调控系统基因及分类 合 ATP 的激酶活性功能域(HATPase_c), 而 16 个反应 a)b)c) 编号 基因 亚类 长度(aa) 调节蛋白均存在接受磷酸基团的功能域(REC), 其他 SE0019/SE0018 VicK/VicR Pho/OmpR 611/234 功能域则在不同基因中存在差异, 说明上述 2 个功能 SE0121/SE0120 Pho/OmpR 364/223 / SE0166/SE0165 513/264 /AraC 域相对保守, 为维持各自基因编码产物的正常功能 / SE0428/SE0427 347/225 Agr/OmpR / 所必需. SE0478/SE0479 322/234 Agr/OmpR SaeS/SaeR 2.3 保守功能域空间结构同源模建 SE1000/SE1001 327/201 /LuxR / SE1099/SE1100 457/220 Nar/OmpR ArlS/ArlR 用 Swiss-model 软件对上述 16 对双组分系统基 SE1175/SE1176 589/242 Pho/OmpR SrrB/SrrA 因的两个相对保守功能域片段进行了同源模建, 共 SE1368/SE1369 566/237 Pho/OmpR PhoR / PhoP 获得 4 个相似的组氨酸蛋白激酶 HATPase_c 功能域 SE1530/SE1529 378/208 Nar/LuxR / 的模拟结构以及 13 个相似的反应调节蛋白 REC 功能 SE1570/SE1569 349/210 Nar/LuxR VraS/VraR SE1637/SE1638 430/239 域模拟结构. 图 1(a)显示出其中一个组氨酸蛋白激酶 /LytR AgrC/AgrA SE1942/SE1941 452/225 (SE0019)的 HATPase_c 功能域模拟结构, 与已报道的 Pho/OmpR / SE1970/SE1969 348/219 Nar/LuxR 大肠杆菌组氨酸蛋白激酶基因 EnvZ 的 HATPase_c 功 / SE2011/SE2012 597/253 Lyt/LytR LytS/LytR SE2194/SE2195 299/222 Pho/OmpR / a) 按组氨酸蛋白激酶/反应调节蛋白排列; b) 示暂无明确命名; c) 示组氨酸蛋白激酶不属于已知亚类 表 2 双组分调控系统基因序列同源性比较及功能预测 编号表皮葡萄球菌基因参照细菌基因功能预测参照细菌氨基酸序列同源性(%) [11] SE0019/SE0018 VicK/VicR YycG/YycF 46/76 调控细菌生长、毒力、外源性 DNA 摄取 枯草杆菌[12]调控分泌性蛋白合成 金黄色葡萄球菌 SE0478/SE0479 SaeS/SaeR SaeS/SaeR 78/83 [13] ArlS/ArlR ArlS/ArlR SE1099/SE1100 69/84 调控细菌黏附、自溶、分泌性蛋白活性 金黄色葡萄球菌[14] SrrB/SrrA SrrB/SrrA SE1175/SE1176 71/90 调控毒力因子表达金黄色葡萄球菌 [15] 金黄色调控碱性磷酸酶合成 PhoR/PhoP PhoR/PhoP SE1368/SE1369 34/68 枯草杆菌调控毒力因子表达 [16] AgrC/AgrA AgrC/AgrA SE1637/SE1638 60/87 葡萄球菌金黄色调控细菌自溶 [17] LytS/LytR LytS/LytR 葡萄球菌SE2011/SE2012 62/56 枯草杆调控蛋白酶生成及外源性 DNA 摄取 [18] DegS/DegUDegS/DegU SE1970/SE1969 33/40 菌 表 3 双组分调控系统基因中的已知功能域 a)b) 功能域 功能描述 蛋白类别 组氨酸蛋白激酶HAMP(5) 可能与形成活性组氨酸蛋白激酶二聚体有关结合并水解 ATP 的激酶活性 HATPase_c(16) 含有组氨酸蛋白激酶自身磷酸化位点, 并与组氨酸蛋白激酶二聚体形成 HisKA(9) 有关 cGMP 或感光色素结合部位GAF(2) 黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、血红素或肉桂酸结合部位 PAS(3) 结合特异的 DNA 序列 反应调节蛋白HTH-ARAC(1) 结合特异的 DNA 序列HTH-LUXR(4) 结合特异的 DNA 序列 含有接受自组氨酸蛋白激酶LytTR(2) 转移的磷酸基团的位点 结合特异的 DNA 序列 REC(16) Trans_regC(9) a) 括号内为功能域数目; b)来自 SMART 和 Pfam 数据库 [19] 能域的 NMR 结构非常相似(PDB 号: 1BXD), 尤其上盖, 保守基序 N box(Asn53~Tyr61), G1 box(Ile85~ 是在 AMP-PNP(一种 ATP 类似物)的结合部位形成一 Ile92), F box(Asp98~Phe101), G2 box(Gly117~Gly121) 个袋状结构, 且其周围有一些保守的基序(N box, G1 围绕形成了一个结合 ATP 的口袋, 而从 Asp102 到 box, G2 box 和 F box)围绕. 图 1(b)显示出其中一个反 Ala129 形成大的柔性 loop 区漂移在口袋区外侧. 我 应调节蛋白(SE0018)的 REC 功能域结构, 与大肠杆 们又用 Sybyl 软件的 Molcad 模块对 HATPase_c 功能 菌的反应调节蛋白基因 CheY 的 REC 功能域的 NMR 域表面性质进行分析. 如图 2(b)所示, HATPase_c 功 [20]结构也非常相似(PDB 号: 3CHY). 整个结构由 5 个 能域结合 ATP 的口袋前部是一个疏水区(褐色表示, 螺旋和 5 个 折叠组成, 其中存在 3 个天冬氨酸残基 越深表示疏水性越强), 由底部的 折叠中的 Thr82, (D7, D8 和 D51)构成接受磷酸基团的活性位点, 且该 Ile83, Ile136, Ile150 和 Thr151 等残基构成, 主要是与 2+2+过程需要二价阳离子(Mg或 Mn)的辅助. 上述 3 个 天然配体 ATP 中的腺苷酸环发生疏水相互作用, 中 活性位点在我们所获得的其他 REC 功能域模拟结构 间深绿色的是一个马鞍状表面, 是 ATP 糖环部分的 中同样存在. 结合部分, 也是表面性质转换的部分, 后部主要由上 盖的 螺旋中的残基构成 , 具有很强的极性( 深由于 REC 功能域中 3 个天冬氨酸活性位点形成 绿 色和蓝色), 主要与 ATP 的三磷酸结构发生氢键的结构比较狭小, 用于虚拟小分子化合物库寻找阻 相互 作用 . 总之 , 该模建结构的合理性通过对模 断这些活性位点的小分子抑制物存在较大困难, 而建的 HATPase_c 功能域整体结构和表面性质的分析HATPase_c 功能域的袋状结构更适于筛选工作. 同时, 而得 以验证. 为了进一步验证并完善 Swiss-Model 软件的模拟结构, 我们对 SE0019 的 HATPase_c 功能域(全长 136 个氨 基酸)用专业软件 Insight?再次进行空间结构的同 源模建. 模建的模板采用大肠杆菌组氨酸蛋白激酶 基因 EnvZ 的 HATPase_c 功能域的 NMR 结构(PDB 号: 3 讨论 1BXD), 与目的序列(SE0019)的同源性比较显示, 一 在表皮葡萄球菌全基因组测序的基础上, 对表 致性为 34%, 相似性为 51%. 我们利用 Insight?的 皮葡萄球菌双组分调控系统进行生物信息学分析, Homology 模块进行结构模建, 并用 Discovery模块 发现了 16 对双组分调控系统, 且这些双组分系统基 在 cvff94 力场下进行能量优化, 获得 SE0019 的 因分散在基因组中, 并不局限于某一区域, 表明表皮 HATPase_c 功能域的三维模建结构, 经 Profile-3D 评 葡萄球菌内存在一个复杂的调控网络. 通过对这些 价结果基本合理. 图 2(a)所示为 Insight?软件同源模 双组分调控系统基因序列进行同源性比较, 发现大 建结果, 与 Swiss-model 软件的结果大体相似, 但修 部分系统可能具有参与调控细菌生长、生物膜形成、 正了一些细节上的缺陷, HATPase_c 功能域的模建结 毒力因子表达等重要生物学功能, 而阻断这些系统 构由 5 个 折叠和 3 个 螺旋共同构成典型的三明治 可能起到有效的抑菌作用. 结构, 5 个 折叠平行组成底部, 3 个 螺旋平行形成 通过对双组分调控系统基因的功能域分析, 发 现了 2 个保守功能域: 组氨酸蛋白激酶的 HATPase_c 功能域和反应调节蛋白的 REC 功能域. 空间结构模 图 1 组氨酸蛋白激酶 HATPase_c 功能域(a)和反应调节蛋白 REC 功能域(b)的同源模建结构 采用 Swiss-model 软件进行同源模建, 结果经 Molscript 软件修饰, 红色为 螺旋, 蓝色为 折叠, 绿色为连接片段, 黄色为氨基酸残基. AMP-PNP 为 ATP 的类似物, N, G1, F 和 G2 box 是围绕在 ATP 结合口袋区的保守基序(a); D7, D8 和 D51 代表 3 个保守的天冬氨酸残基, 与二价阳离子(如 2+ Mg, 图中绿色小球所示)协同作用, 为维持功能域活性所必需(b) 图 2 组氨酸蛋白激酶 HATPase_c (SE0019)功能域的同源模建结构(a)及其表面性分析结果示意图(b) 同源模建采用 Insight?软件, (a)中红色为 螺旋, 绿色为 折叠, N, G1, F 和 G2 box 是围绕在 ATP 结合口袋区的保守基序; 表面性质分析采用 Sybyl 软件, (b)中箭头所指为 ATP 结合的袋状结构, 疏水性部分用棕色显示, 亲水性部分按程度不同分别用绿色和蓝色显示建表明, HATPase_c 功能域在 AMP-PNP 结合部位形 有人对其他细菌进行基因组分析, 筛选出一些针对 成一个明显的袋状结构, 而 REC 功能域均包含 3 个 双组分调控系统的小分子抑制物(如 RWJ-49815 和 接受磷酸基团的天冬氨酸活性位点. 由于上述袋状 Closantel 等), 经体外实验证实这些小分子抑制物在 结构和活性位点在表皮葡萄球菌的大多数双组分调 金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa) [21,22 ] 控系统中存在, 提示它们有可能是潜在的药物靶标.中具有良好的抑菌作用 . 有关研究还表明 Mol Microbiol, 2000, 35: 566~576 大部分此类抑制物的作用机制是与 ATP 竞争以阻断 Lange R, Wagner C, de Saizieu A, et al. Domain organization and 9 [23,24] HATPase_c 功能域的激酶活性.molecular characterization of 13 two-component sy stems 目前 , 我们应用计算机辅助设计方法, 根据identified by genome sequencing of Streptococcus pneumoniae. HATPase_c 功能域的同源模建结构来筛选小分子化 Gene, 1999, 237: 223~234 Vuong C, Gerke C, Somerville G A, et al. Quorum-sensing control 10 合物库寻找能在空间结构上阻断 ATP 结合部位(袋状 of biofilm factors in Staphylococcus epidermidis. J Infect Dis, 结构)的小分子抑制物, 并通过抑菌实验和生物膜形 2003, 188: 706~718 成抑制实验验证这些候选小分子抑制物的效能. 初 11 Fabret C, Hoch J A. A two-component signal transduction system essential for growth of Bacillus subtilis: Implications for anti-infective 步的实验结果表明: 在总共验证的 76 个候选小分子 therapy. J Bacteriol, 1998, 180: 6375~6383 中, 13(17%)个小分子抑制物在体外可有效抑制表皮 Giraudo A T, Calzolari A, Cataldi A A, et al. The sae locus of 12 葡萄球菌的生长, 30(39%)个小分子抑制物可有效抑 Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory 1)制表皮葡萄球菌生物膜的形成 . 这一结果表明表皮 system. FEMS Microbiol Lett, 1999, 177: 15~22 13 Fournier B, Hooper D C. A new two-component regulatory system 葡萄球菌双组分调控系统保守性功能域的生物信息 involved in adhesion, autolysis, and extracellular proteolytic 学分析为相关药靶的发现提供了重要的理论依据,activity of Staphylococcus aureus. J Bacteriol, 2000, 182: 3955~ 并对其后的生物学实验也具有一定的指导意义.3964 近年来, 随着抗生素耐药株细菌的发生率日益 Yarwood J M, McCormick J K, Schlievert P M. Identification of a 14 novel two-component regulatory system that acts in global 增加, 急需研发新型抗微生物感染的药物. 由于双组 regulation of virulence factors of Staphylococcus aureus. J 分调控系统广泛存在于各类微生物中, 且调控多种 Bacteriol, 2001, 183:1113~1123 重要生物学功能, 其作用机制也十分相似, 因此被认 Pragai Z, Eschevins C, Bron S, et al. Bacillus subtilis NhaC, an 15 为是极有希望的靶基因. 本研究表明, 运用生物信息 Na+/H+ antiporter, influences expression of the phoPR operon and production of alkaline phosphatases. J Bacteriol, 2001, 183: 学手段可以全面而快速地从表皮葡萄球菌全基因组 2505~2515 序列中筛选出有价值的信息, 从而为进一步开发相16 Recsei P, Kreiswirth B, O' Reilly M, et al. Regulation of 关治疗药物提供潜在靶标.exoprotein gene expression in Staphylococcus aureus by agar. Mol Gen Genet, 1986, 202: 58~61 致谢 本工作为国家高技术研究发展 ( 批准号 : Brunskill E W, Bayles K W. Identification of LytSR-regulated 17 2001AA223011) 、国家重点基础研究发展规划 ( 批准号:genes from Staphylococcus aureus. J Bacteriol, 1996, 178: 2002CB5128)和上海市科技发展基金(批准号: 02DJ14002) 5810~5812 资助项目.18 Dartois V, Debarbouille M, Kunst F, et al. Characterization of a novel member of the DegS-DegU regulon affected by salt stress in 参考文献Bacillus subtilis. J Bacteriol, 1998, 180: 1855~1861 1 Rupp M E, Archer G L. Coagulase-negative staphylococci: Tanaka T, Saha S K, Tomomori C, et al. NMR structure of the 19 Pathogens associated with medical progress. Clin Infect Dis, 1994, histidine kinase domain of the E. coli osmosensor EnvZ. Nature, 19: 231~243 1998, 396: 88~92 Thylefors J D, Harbarth S, Pittet D. Increasing bacteremia due to 2 Cho H S, Lee S Y, Yan D, et al. NMR structure of activated Che 20 coagulase-negative staphylococci: fiction or reality? Infect Y.J Mol Biol, 2000, 297: 543~551 Control Hosp Epidemiol, 1998, 19: 581~589 Stephenson K, Hoch J A. Virulence- and antibiotic 21 3 Zhang X Q, Ren S X, Li H L, et al. 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