载牛血红蛋白纳米微囊中高铁血红蛋白含量的控制

载牛血红蛋白纳米微囊中高铁血红蛋白含量的控制 载牛血红蛋白纳米微囊中高铁血红蛋白含 量的控制 26卷5期 20H07年l0月 中国生物医学工程 ChineseJournalofBiomedicalEngineering Vo1.26No.5 October20H07 载牛血红蛋白纳米微囊中高铁血红蛋白含量的控制 章晓兰袁媛单晓茜盛燕刘昌胜 (教育部医用生物材料工程研究中心.华东理工大学生物材料研究所,上海200237) 摘要:高铁血红蛋白(metHb)含量是影响血液代用品携氧.释氧性能的主要因素之一.以市售的牛血红蛋白(Hb) 冻干粉(90%以上已氧化)为原料,采用强还原剂连二亚硫酸钠将metHb还原成亚铁状态,进一步采用溶剂扩散.挥 发复乳化法制备载牛Hb聚合物型纳米微囊血液代用品.研究制备过程中不同工艺条件对微囊中metHb含量的影 响,并对制备过程的工艺参数进行优化.结果表明,连二亚硫酸钠与牛Hb摩尔比为2:1时原料中metHb基本被还 原.制备过程中较低的乳化强度(如初乳采用超声波输出功率27w作用12s,复乳采用10000r/min匀浆乳化 1.5rain),油相中水溶性溶剂丙酮的加入及嵌段了PEG链段的聚合物能有效抑制Hb氧化,通过优化工艺最终使微 囊内metHb含量从原料的9o%以上降为8.6%,使其具备良好的携氧.释氧性能.该方法是控制微囊型血液代用品 中metHb含量,进而实现其高效携氧.释氧功能的理想途径. 关键词:高铁血红蛋白;氧化;复乳;携氧.释氧 ControlofMethemoglobinLevelofBovineHemoglobin-loadedNanoparticles ZHANGXiao—LanYUANYuanSHANXiao—QianSHENGYanLIUChang—Sheng (EngineeringResearchCenterforBiomedicalMaterialsofMinistryofEducation,EastChinaUniversityofScienceandTechnology.Shanghai200237) Abstract:ThemetHbcontentisoneofthemainfactorsaffectingtheoxygencarrying— releasingpropertyofblood substitubs.BovineHbinlyophilizedform(withover90%oxidized)purchasedfrommarketwasusedasraw materials.Thepowerfulreductantsodiumdithionite(SD)wasemployedtoreducetheoxidizedmetHbtoferrous state,whichwasfurtherencapsulatedinpolymericnanoparticlesbloodsubstituesbythesolventdiffusion—evaporation doubleemulsionmethod.ThepreparativeconditionsinfluencingthemetHbcontentinnanoparticleswereinvestigated andoptimized.TheresultsshowedthatthemetHbintherawbovineHbcouldbereducedtoferrousstatewhenthe molarratioofSDtoHbwas2:1.Lowemulsificationstrengthinpreparationprocesswas27Wfor12sbyultrasonic and10000r/minfor1.5minofhomogenizationduringtheprimaryandsecondaryemulsion,respectively.Theaddition ofmisciblesolventssuchasacetoneandthebiodegradablepolymerswithPEGsegmentsinoilphasecouldsuppress Hboxidation.TheresultantmetHbleveldecreasedfrominitialover90%intherawbovineHbto8.6%,which showedbettercapacityofcarrying— releasingoxygen.Themethodpresentedheremayprovideanidealwaytocontrol themetHblevelintheHb— loadednanoparticlesbloodsubstitutesandrealizethefunctionofcarrying??releasingoxygen effectively. Keywords:methemoglobin;oxidation; 中图分类号R318.08文献标识码 引言 doubleemulsion;carrying—releasingoxygen A文章编号0258.8021(2007}05.0787.06 世界范围出现的血源严重短缺以及常规输血存 在的安全隐患使得血液代用品日益成为国际医药生 物技术领域研究开发的热点.其中,以可生物降 解聚合物为壳材,模拟人体天然红细胞的组成与结 构,包埋Hb形成的微囊型血液代用品,不仅克服了 收稿日期:2006—08.31.修回日期:2007.06.22. 基金项目:十五"863"纳米专项(2004AA.302050);上海市科委纳米专项 (0452nm022). *通讯作者.E.mail:liucs@ecust.edu.ca 中国生物医学工程26卷 第一,二代交连,聚合,重组Hb基血液代用品无细 胞膜的屏障,对纯度要求极高等缺点,同时解决了脂 质体微囊型血液代用品力学性能和小分子物质通透 性差的问题,是最新一代血液代用品.' 携氧.释氧功能是血液代用品和制备最主 要的目标.对Hb为基质的微囊型血液代用品而 言,携氧.释氧功能由其中的Hb完成.Hb有三种状 态,即脱氧态(deoxyHb),氧合态(oxyHb)和高铁态 (metHb)deoxyHb在空气中易和氧气结合形成 oxyHb.deoxyHb和oxyHb分子中铁原子均处于亚铁 状态(Fe),具备携氧.释氧性能.而Hb氧化形成 的高价铁态(Fe")的metHb,则失去携氧.释氧性能. 因而血液代用品中高铁血红蛋白(metHb)的含量直 接影响着其携氧.释氧功能的发挥.研究表明,血液 代用品metHb含量低于10%才能保证其携氧一释氧 功能. 天然红细胞内强大的高铁还原系统如NADH一 高铁血红蛋白还原酶和NADPH.高铁血红蛋白还原 酶等使metHb含量低于1%,从而能够为生命组织 提供赖以生存的氧气.但脱离红细胞内还原系统 保护的血液代用品易发生氧化而使metHb增高.如 市售的脱基质牛Hb原料中metHb含量高达90%以 上,这为具有理想携氧.释氧性能的血液代用品的体 外构建带来极大的困难.为了控制血液代用品中 metHb含量,许多研究者通过提取红细胞中还原酶 系统,模拟其功能来抑制metHb的形成,但存在 还原酶组成复杂,提取工作繁琐,且脱离体内环境后 还原酶易失活等问题. 采用叮生物降解聚合物,通过改性复乳化方法 制备的载Hb纳米微囊(Hb.1oadednanoparticles, HbP).解决了高包封率和小粒径的矛盾,得到85% 以上包封率,粒径可控,表面多孔的纳米微囊,是一 类极具应用潜力的血代品.但原料采用市售的牛 Hb冻干粉,由于原料在纯化和储存过程中的氧化, -taetHh含量超过90%,因此高铁含量的控制成为本 研究的极大挑战.先采用强还原剂连二亚硫酸钠 (sodiumdithionate,SD)对原料实行还原,探讨了还原 剂的合理用量,使原料中高价铁态ttb转化成亚铁 状态,之后以可生物降解聚合物为壳材料,采用溶剂 ' 散.挥发复乳化【艺(W/O/w,)包埋还原后的Hb 制备IIbP.在制备过程中,对影响Hb氧化的工艺参 数如初乳,复乳过程中乳化强度,油相中溶剂组成及 壳材种类进行优化以控制metHb含量,最终实现微 囊内metHb含量的可控,获得具备理想携氧.释氧功 能的载牛Hb纳米微囊型血液代用品. 1材料和方法 1.1材料 牛Hb冻干粉购自上海源聚生物公司;聚合物 D,L—PLA(M48k),PLA—PEG(M43k,MwPl'^:MwPEG =7:3),PCL(Mw45k)和PCL—PEG(Mw42k,Mw唧: M眦=l:6)购自四川中科院成都有机化学研究所; 其他试剂为国产分析纯;紫外.可见分光光度计 (Spectrumlab54,上海棱光技术有限公司). 1.2方法 1.2.1载牛Hb纳米微囊(HbP)的制备 采用改性溶剂扩散,挥发复乳化(W/O/W)制备 工艺,具体实施如下:0.5mL血红蛋白溶液倒入5mL 油相中(10mg壳材溶于一定量的二氯甲烷等溶剂), 超声波(JYD.900,ZhiXinInstrumentCo.,Ltd., Shanghai)乳化形成初乳,初乳加到外水相两步匀浆 乳化形成复乳,之后倾到200mL水溶液挥发溶剂, 最后离心收集微囊.整个制备过程用4?水浴控 温,考查制备条件对metHb含量的影响时,每次只改 变一个参数. 1.2.2牛Hb冻干粉原料还原 牛Hb冻干粉溶解于去离子水中,加不同比例 的还原剂SD(SD:Hb=l:1,2:1,4:1,6:1)对原料实 行还原.通过紫外.可见光分光光度计在500, 700nm范围扫描,观察541nm,577nm和630nm处的 吸收峰,采用1.2.3方法计算相应的metHb百分 含量. 1.2.3Hb及metHb含量测定方法 1)游离Hb浓度(Hb)测定:采用氰化高 铁血红蛋白(eyanomethemoglobin)法测定Hb 浓度. 2)游离metHb浓度(metHbh)测定:采用试剂 (15%KCN溶解于0.05Mphosphatebuffer,pH 7.4).待测样品在630nm处的吸光度记OD,则 OD是混合物(oxyHb+deoxyHb+metHb)的吸光度. 一 滴KCN试剂加到待测样品混合后,读取630nm处 吸光度,记为OD,.样品中metHb和试剂中的KCN 反应生成cyanome【hemfobil1,cyanome【hemogl0bin在 630nm几乎无吸收,则OD,是样品中oxyHb+ de0xyHb的吸光度,待测样品中的metHb含量可通过 式(1)得出,其中3.7是metHb在630nm处的毫摩尔 吸光系数 5期章晓兰等:载牛血红蛋白纳米微囊中高铁血红蛋白含量的控制 metHbh(mM)=(OD.一OD:)/3.7(1) Hb(withinHbP)=HblXEE%(2) metHb%=metHb/HbX100(3) 3)HbP内Hb含量(Hb(withinHbP))测定:根据 式2得出.其中HbandEE%分别为微囊制备过 程总投入的Hb量和包封率.包封率由离心后测定 上清液中游离Hb量得出. 4)HbP内metHb含量测定:基于HbP具备多孑L 结构,允许小分子的自由扩散.加入的KCN扩散进 HbP内,HbP内的metHb含量通过方程l计算. MetHb含量最终以百分率表示,通过式(3)计算. 1.2.4HbP氧解离曲线及测定 氧解离线的测定采用经典的分光光度法..结 合临床医用脉冲血氧饱和度测定仪设计原理,利用 近红外光的强穿透性(能穿透人体组织如皮肤,肌 肉,血管等对红细胞内Hb的氧饱和度进行无损监 测),能穿透聚合物壳材对包封的血红蛋白的氧合度 进行测定.P为半氧饱和度,直接从氧解离曲线中 获得. 2结果与讨论 2.1牛Hb原料还原 制备血液代用品所用的Hb原料一般从红细胞 中提取,分离,再进一步冻干形成冻干粉剂.由于脱 离红细胞内天然的还原体系的保护,Hb在分离和储 存过程中氧化很难避免,因此多数购置的Hb冻干 粉剂中含有大量的metHb.本研究试图对已经高铁 化(90%以上氧化)的原料进行还原.常见的metHb 还原剂有抗坏血酸,谷胱苷肽,SD等.前二者还原 metHb较缓慢且不完全.SD是一种强还原剂,能迅 速还原metHb,但自身也容易被空气中的氧气氧化, 氧化的过程中会形成氧自由基等活性氧化剂,后者 进一步氧化Hb,因此SD不能过量.但是目前尚未 见有报道SD和metHb化学反应配比,因此很难定 量.基于以上认识,通过实验来确定SD的合理用 量显得尤为重要. 有报道SD在水中的分解反应为Na2SO+H:O +O=NaHSO3+NaHS04,式中Na2S04在氧化时提 供4个电子.metHb还原成亚铁态也需要4个电子 (每个Hb分子含4个铁原子),因此设想Na2S:O4和 metHb的化学配比应为l:l(Na2S:O+Hb(4Fe?) 一Hb(4Fe)+NaHSO+NaHSO4).扫描图谱(图 1)显示,SD:Hb=l:l时,630nm处(metHb的特征吸 收峰)的吸收峰略有降低,577nm和541nm处出现两 吸收峰(还原后的亚铁态Hb与氧气结合形成OxyrHb 的特征吸收峰),但OxyHb的特征峰不明显.当SD: Hb=2:l时,OxyHb的特征吸收峰非常明显,经测定 高铁含量约1.2l%,证明原料中的metHb已基本被 还原.当SD与Hb的比例超过2时,metHb含量再 次升高.如SD:Hb=4:l时,metHb含量约 (80.43%),SD:Hb=6:l时,metHb含量约(88.3%) (表1).原因分析是过量的SD自身氧化产生的氧 自由基充当氧化剂作用,氧化亚铁态Hb,使metHb 含量进一步升高.这意味着当SD与Hb的比例为2 时是最佳用量,能实现原料中metHb的还原. 2.2复乳化工艺影响HbP内metHb含量的主要因 素 复乳化工艺制备条件相对温和,包封率高,近年 来成为包载药物的常规使用方法.但该过程涉及到 机械剪切力,有机溶剂,疏水性壳材等,这些因素对 蛋白均有不同程度的影响….复乳化工艺对亚铁 态Hb的氧化规律目前未见文献报道.本研究采用 扩散.挥发复乳法制备HbP,考察了初乳和复乳过程 的乳化强度,油相中壳材及溶剂类型对Hb的氧化 规律,从而达到优化工艺参数的目的. 图1连二亚硫酸钠(SD)与lib厣尔比对lib原料的还原 效果 Fig.1EffectofmolarratiosofSDtoHbonthereduction oftherawHb 2.2.1初乳过程乳化强度的影响 初乳(W1/O)阶段采用超声波乳化,实验过程发 现,输出功率小于27W时无法有效分散乳液,因此 本研究在W1/O阶段选择27W为最小输出功率.实 验考察了27W,50W和70W三档输出功率作用不同 时间对Hb氧化程度的影响.壳材采用PCL,溶剂为 二氯甲烷(dichloromethane,DCM),复乳阶段采用 中国生物医学工程26卷 10000r/min匀浆分散2min,收集的HbP中metHb含 量按1.2.3方法测定,结果以三次测定的平均数表 示,见图2.初乳采用27W作用12s,经测定metHb 含量为(23.50?1.62)%,50W和70W作用12s后高 铁含量分别为(26.56?2.42)%和(39.42?2.31)%, 随着输出功率的增大,Hb氧化加剧,metHb含量明 显增加,同时Hb氧化呈超声时间依赖性,超声时间 越长,metHb含量越高.70W作用18s时可见乳液 由鲜红色变暗,经测定metHb含量达(71.6? 1.9)%,说明Hb严重氧化. 表1连二亚硫酸钠(SD)与Hb摩尔比对Hb原料中高铁血 红蛋白含量的影响 Tab.1EffectofmolarratiosofSDtoHbonthemetHblevel intherawHb sD与lib摩尔比高铁血红蛋白含量/% l:l 2:l 4:l 6:l 91.6O?1.05 1.2l?0.32 80.43?0.96 88.3?1.24 \ ? 正 l罡【 担 图2初乳过程中超声波乳化强度对微囊内高铁血红蛋 白含量的影响 Fig.2Effectofemulsificationstrengthbyultrasonicinthe primaryemulsiononthemetHblevelinHbP W1/O过程是复乳化工艺制备微囊的第一步, 此时,Hb处于裸露及半包封状态,直接处于超声波 输出的机械应力及有机溶剂作用下,对Hb的氧化 还原状态影响明显.另外,超声波输出的能量引起 的局部温度升高和产生的气穴n,也促进Hb氧化. W1/O乳化强度越高,Hb氧化越严重,因此后续实验 采用较小的输出功率(如27W作用12s)比较理想. 2.2.2复乳过程乳化强度对HbP内metHb含量的 影响 HbP的制备中复乳阶段采用匀浆分散乳化.上 述结果表明,乳化强度越强,Hb氧化越明显,因此采 用10000r/min(本实验匀浆机最小输出功率),初乳 采用超声波27W输出功率作用12s,壳材用PCL,溶 剂为DCM,分别考察0.5mln,1rain,1.5min和2mln匀 浆时间对Hb的氧化程度. 图3结果显示,同样的匀浆功率下,HbP内 metHb含量呈匀浆时间依赖关系.如匀浆时间 0.5rain,1min,1.5rain和2rain的条件下metHb含量分 别为(13.64?0.73)%,(15.37-t-1.16)%,(18.20? 1.10)%和(23.50?1.62)%.匀浆时间长,乳化强 度大,Hb在高的机械剪切力作用下,氧化加剧,因此 较小的乳化强度有利于抑制Hb的氧化.但复乳化 工艺中,匀浆乳化强度和最终的微囊粒径及粒径分 布有较大关联性,即乳化强度大,粒径小且粒径分布 窄. 由于人体内最小的毛细血管直径约为4m, 7m,因此输入体内的粒子直径应小于4m以防栓 塞.Kllbanov等报道粒子直径超过200nm的粒子 很快从血循环中清除,在脾脏中累积.另外还观察 到小于70nm的粒子易被肝脏捕获.这就是说, 能在体内达到长循环的粒子合理粒径应在70nm, 200nm之间.本研究中制备的HbP动物体内分布实 验也表明大的粒子较易从血循环中清除(见后续报 道).因此为获得合理的粒子直径,第二步匀浆乳化 强度不能过低.综合Hb氧化的因素,把初乳和复 乳的乳化强度分别优化为超声波27W输出功率作 用12s,匀浆10000r/rain作用1.5rain. \ 皿 嘲 鲁 担 图3复乳过程中匀浆乳化时间对微囊内高铁血红蛋白 含量的影响 Fig.3Effectofhomogenizationtimeinthesecondary emulsionOI1themetHblevelinHbP 2.2.3油相中有机溶剂的影响 图3结果表明,在优化的乳化强度条件下,HbP 内metHb含量为(18.2?1.10)%.为进一步降低 metHb含量,实验考察了不同有机溶剂的影响. 5期章晓兰等:载牛血红蛋白纳米微囊中高铁血红蛋白含量的控制79l DCM能溶解大量聚合物壳材而成为一种常规溶剂. 本实验考察在DCM中分别加入部分或完全水溶性 有机溶剂乙酸乙酯(ethylacetate,EA)或丙酮 (acetone,Ace)(DCM/EA,DCM/Ace,1:1,V/V),经测 定metHb含量从(18.2?1.10)%分别降为(15.7? 1.23)%和(11.60?1.51)%(图4).EA和Ace的加 入,相对单纯采用DCM为溶剂时Hb氧化得到抑制. 分析原因是复乳化工艺中溶剂的脱除导致壳材沉 降,壳材的沉降速率取决于溶剂的脱除速率.溶剂 的脱除过程包括从油相中溶解,扩散至外水相,然后 再挥发.在整个过程中,低沸点的有机溶剂挥发相 对快,因而溶剂溶解,扩散成为溶剂脱除的主要步 骤.DCM在水中的溶解度低(2%,W/V),使得溶解, 扩散速率相对较慢.而加入溶解度高的EA(8.7%, W/V),Ace(完全水溶)之后,当W1/O加到外水相 时,水溶性溶剂迅速扩散进入外水相,使高分子壳材 很快沉降形成微囊包裹Hb,大大缩短Hb和机械应 力,有机溶剂等外部环境的接触时间,有利于保护 Hb.且随着溶剂在水中溶解度的增加,壳材沉降速 率增加,Hb氧化抑制增强,说明水溶性溶剂有利于 抑制lib氧化.因此把溶剂优化为DCM/Ace(1:1, V/V)比例的混合溶剂. 2.2.4油相中聚合物壳材的影响 考察了常用的几种可生物降解聚合物(PCL, PCL—PEG,PLA,PLA—PEG)对Hb氧化程度的影响. 采用以上优化的乳化强度和溶剂组成.图5结果显 示,PCL,PCL—PEG,PLA,PLA—PEG制备的HbP内的 metHb含量分别为(1l,60?1.50)%,(9.20? 1.50)%,(13.50?1.80)%和(8.60?1.60)%.结 果显示无论是PLA还是PCL,嵌段了PEG链段的共 聚物形成的微囊内metHb相对低.研究表明,PEG 嵌段的共聚物在微囊形成过程中,由于其亲水性特 性,使包载的蛋白倾向于排列在微囊深部,这样弱化 了外部因素如机械应力,溶剂的影响",使Hb氧化 得到抑制.另外,PLA—PEG作为壳材制备的微囊由 于PEG的亲水性修饰,能显着延长微囊血循环时 间,达到长循环的目的".因此,把PLA—PEG优化 为最终壳材. 综合以上影响Hb氧化程度的因素,把制备HbP 的复乳化工艺参数优化为:初乳过程采用超声波,输 出功率为27W作用12s,复乳采用10000r/min匀浆 乳化1.5min,溶剂为DCM/Ace(1:1,V/V),壳材采用 PLA.PEG,最终HbP内metHb含量约8.6%.而牛 Hb未经原料还原步骤及制备过程优化,微囊内 \ 嘲 鲁 姬 图4油相中有机溶剂组成对微囊内高铁血红蛋白含量 的影响 Fig.4Influenceoforganicsolventcompositionintheoil phaseonthemetHbcontentinHbP \ ? 随 鲁 键 图5油相中壳材种类对微囊内高铁血红蛋白含量的影 响 rig.5Effectofthepolymertypesintheoilphaseonthe metHblevelwitlIinHbP metHb含量接近100%. 2.3氧离曲线及P蜘 血液代用品携氧.释氧能力通常考察其氧 解离曲线(oxygendissociationcurves,ODCs)及Ps0. ODCs表示氧分压(oxygenpartialpressure,PO2)与Hb 氧结合量或Hb氧饱和度(oxygensaturation,SO2)关系 的曲线.表示氧饱和度达到50%时的氧分压,体 现氧亲和力高低. 每个Hb分子由1个珠蛋白和4个血红素组成, 每个血红素和一个0,分子结合.Hb的4个血红素 无论在结合0,或释放0时,是一个高度协同的变 构过程,即1个血红素与0.结合后,由于变构效应 的结果,其它血红素更易与0:结合;反之,当结合氧 的Hb的1个血红素释出0后,其它血红素更易释 放0,,因此Hb的ODCs呈S形.S形的ODCs对人 体有重要的生理意义.曲线上段平坦,相当于PO 在60mmHg,100mmHg之间,此范围,P0的变化对 792中国生物医学工程26卷 Hh的sO影响不大,如即使肺泡中氧分压变化较 大,血液中的SO仍可以维持在较高水平,变化较小 (98,96)%,有利于维持组织供o,.ODes的中段较 陡,相当于PO,在40mmHg,60mmHg段,是oxyHb释 放0的部分.曲线下段斜率大,相当于pO,在 15mmHg,40mmHg之间,表明在此范围内,组织PO, 稍有下降,血液中的SO就迅速降低,从而释放出更 多的0,供组织需要. 正常天然牛Hh的ODCs及P与人的相似, 为27mmHg.由于在复乳制备过程中涉及到机械剪 切力,有机溶剂等,Hh有可能失活或氧化,而使 ODCs及P偏离正常值.本研究测试的天然牛Hh 及HbP的ODCs接近(见图6).意味着HbP中的Hb 在整个制备工艺过程中其活性得到保持,具备同天 然Hb的携氧,释氧能力. \ 犀 盈 麻 氧分压/mmHg 性能,解决了前期制备工艺,为进入后续的动物体内 实验奠定基础. 参考文献 2 3j 4 5: 6 [7j [9 图6天然牛Hb和载Hb纳米微囊氧解离曲线和半氧 饱和度(P5o) Fig.6OxygendissociationcllrvesandPsoofnativebovine HbandHbloadednanoParticles[10] 3结论 1)连二亚硫酸钠是强还原剂,能快速有效还原 氧化严重的牛Hb冻干粉原料.经分析,用量与原 料摩尔比为2:1时能还原其中的metHb. 2)探讨溶剂扩散.挥发复乳化工艺对Hb氧化规 律.初乳和复乳过程中乳化强度促进Hb的氧化. 水溶性溶剂Ace的加入及嵌段PEG链段的共聚物 如PL~.PEG能有效抑制Hb的氧化. 3)经最佳条件下获得的载牛Hb微囊内metHb 含量从原料的90%以上降为8.6%.而牛Hb未经 原料还原步骤及优化的制备过程,微囊内metHb含 量接近100%. 所制备的载牛Hb纳米微囊型血液代用品携氧一 释氧曲线和天然牛Hh接近,具备良好的携氧一释氧 [12] [13] [14] [15] LiShuliang,NickelsJ,PalmerAF hemoglobin(LEAcHb)artificial Biomaterials.2005.26:3759—3769 WinslowRM.Bloodsubstitutes:J]. 40:l3l—l42. 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