山慈姑体外抑菌活性的初步研究.doc
山慈姑体外抑菌活性的初步研究
作者:郭东贵 王寒 朱晓鹤 周英
【摘要】 目的探讨山慈姑的体外抑菌活性。方法将山慈姑提取物经大孔树脂(D-101)分离得到4个组分A,B,C和D,用倍比稀释法测定其抑菌活性。 结果金黄色葡萄球菌(Staphylococcus
aureus)对组分D有很强的敏感性,MIC?12.5 mg/ml,对组分B有中等强度的敏感性,MIC为12.5,25 mg/ml;白色念珠菌(Candida albicans,ATCC-10231)对组分B和组分D有中等强度的敏感性,MIC为12.5,25 mg/ml,大肠杆菌(Escherichia coli)对各组分的敏感性都较低,MIC,50 mg/ml。结论山慈姑提取物B和D对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌具有较强的抑菌效果。
【关键词】 山慈姑 体外抑菌 倍比稀释法 最低抑菌浓度
山慈姑为兰科植物杜鹃兰Cremastra appendiculata(D.Don)Makino,独蒜兰Pleione bulbocodioides(Franch.)Rolfe或云南独蒜兰Pleione yun-nanensis Rolfe的干燥假鳞茎,前者习称“毛慈姑”,后二者习称“冰球子”,1, ,主产于贵州、四川、云南等长江以南各省区。作为传统的中药材,山慈姑始载于唐《本草拾遗》,具有清热解毒、消肿散结的功效。本文旨在探讨山慈姑的体外抑菌作用,为进一步开发利用山慈姑奠定基础。
1 材料与仪器
1.1 材料 山慈姑由贵州信邦中药发展有限公司GAP种植基地提供。大孔树脂(D-101,天津化学试剂公司)。
1.2 试剂 氯仿(AR,四川鸿鹤精细化工有限责任公司),醋酸乙酯(AR,四川鸿鹤精细化工有限责任公司),95,乙醇(AR,重庆川江化学试剂厂),蒸馏水(自制),无菌水(自制)等。
1.3 菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)由中国微生物菌种保藏中心提供,白色念珠菌(Candida albicans)由广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心提供。
1.4 培养基 营养肉汤固体培养基:蛋白胨 10 g,牛肉膏 3 g,氯化钠 5 g,琼脂 15 g,定容至1 000 ml,pH值调至7.0;沙氏固体培养基:葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,酵母膏5 g,琼脂15 g,定容至1 000 ml, pH调节5.0。液体培养基组成除了不加琼脂外,与相应的固体培养基相同。
1.5 仪器 高低温恒温培养箱(上海一恒科技有限公司),旋转蒸发仪(BUCHIR-200),SHZ-D(III)循环水式真空泵(河南省巩义市予华仪器有限公司),电子天平(OHAUS),净化工作台
(上海市纯昱科学仪器有限公司),真空冷冻干燥机
(LABCONCO),超低温冰箱(海尔),双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司 TU-1901)。
2 方法
2.1 样品的制备 取粉碎后的山慈姑100 g,用70%乙醇浸提3次,72 h/次,合并提取液,减压浓缩至适量,依次用氯仿、醋酸乙酯萃取后,取水层减压浓缩,浓缩液用95%乙醇溶解,过滤,滤渣以蒸馏水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇为流动相,D-101为固定相得到四组分,分别减压浓缩、冷冻干燥后得组分A(水洗脱物),B(25%乙醇洗脱物),C(50%乙醇洗脱物)和D(75%乙醇洗脱物)。
2.2 菌种培养 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌用营养肉汤培养基(组成成分见上)活化培养,白色念珠菌采用沙氏培养基(组成成分见上)活化培养,分别将各菌种浓度调至OD600?1,2,,备用。2.3 最低抑菌浓度(MIC)的测定取A、B、C、D四组分各100 mg溶于1 ml无菌水中使其充分溶解后,用细菌过滤器过滤,取滤液0.3 ml,用相应的液体培养基倍比稀释,3,成样品浓度分别为50,25,12.5 mg/ml和6.25 mg/ml。取稀释后的样品各300 μl,分别加入活化的菌悬液30 μl(OD600?1)后培养16 h,培养温度为:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为35?,白色念珠菌为27?。培养后分别取100 μl均匀涂布在相应的固体培养基上,在各自的温度下恒温培养24 h,并以相应溶剂作对照,测定其最小抑菌浓度(MIC),4,。
3 结果
3.1 实验结果 山慈姑不同组分对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的 MIC 结果见表1。
表1 山慈姑不同组分的最低抑菌浓度(略)
3.2 分析目前国内外尚无统一中草药对细菌的MIC标准,结合本实验结果,笔者参照同类实验,5,的标准作为判断指标,金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌对山慈姑各组分表现出不同的敏感性: 金黄色葡萄球菌对组分A和C的敏感性较弱,MIC,50 mg/ml;对组分B有较强的敏感性,12.5 mg/ml,MIC?25 mg/ml;对组分D有很强的敏感性,MIC?6.25 mg/ml。 大肠杆菌对山慈姑各组分的敏感性都较弱,MIC,50 mg/ml。 白色念珠菌对组分A和C的敏感性较弱,MIC,50 mg/ml;对组分B和D有较强的敏感性,12.5 mg/ml,MIC?25 mg/ml。
4 结论 中药抗菌药物具有安全性高、不易引起耐药性等特点,使中药抗菌药物的研究与开发越来越受到人们的重视。山慈
姑作为中药抗菌药物之一,由于地理和气候等条件的影响,其野生资源越来越匮乏,本实验用大孔树脂层析柱将山慈姑提取物分段,以致病细菌和真菌为测试菌种进行研究,研究发现,山慈姑提取物中组分B和D对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌表现出较强的抑菌活性,初步确定了山慈姑的抗菌性能和抗菌活性的有效组分,为进一步完善其抗菌谱、寻找活性成分以及更合理地开发利用奠定基础。
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