硅烷化气相色谱法测定注射用倍美力和倍美力软膏中结合态雌激素
硅烷化气相色谱法测定注射用倍美力和倍
美力软膏中结合态雌激素
药物分析杂志
硅烷化气相色谱法测定注射用倍美力和倍美力软膏中结合态雌激素
汪洁胡建国李建华
(上海市药品检验所上海z00233)
摘要目的:建立了GC—HI)法测定注射用倍美力和倍美力软膏台量方法:样品通过硫酸酯酶水解得到游离雌
激素,经1%三甲基氧硅烷的双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺硅烷化后,用paxIt一225(15m×025nllll×025)
弹性石英毛细管色谱柱,以3一甲氧基雌酮为内标,程序升温分离雌酮,马烯雌酮,17一二氢马烯雌酮,17n一
雌二醇,1邗一雌二醇,1邵一二氰马烯雌酮.结果:3个主要成分雌酮,马烯雌酮,17a一二氢马烯雌酮分别在8o
,
480?mL-.(09994),加一280?mL(r=0.9997),20—170?mL(r=0.9995)的浓度范围内呈
良好线性关系.雌酮,马烯雌酮,1一二氢马烯雌酮平均回收率分别为11106%,RsD=1.20%:1110.0%,RsD
=
0.98%;1?.2%,tlSD=1.50%.结论:本法选择性高,重现性好,准确,快速和应用简便.
关键词毛细管气相色谱法注射用倍美力倍美力软膏结合态雌激素硅烷化
倍美力是Wyeth—Ayerst跨国公司从怀孕母马
尿液中提取的结合态雌激素,具50多年的历史,
主要由雌酮硫酸钠(sodiumestmnesulfale,sEss),
马烯雌酮硫酸钠(sodiume~ilinsulfale,SEQS),
17a一二氢马烯雌酮硫酸钠(s(~llm17a—dihy~me.
quilinsulfate,S17aDD0s)组成,并有少量的17a一
雌=醇硫酸钠(s0diIl?I17a—estradMsulfate.S17a
F~ss),178一雌二醇硫酸钠(sodium178一e~aradiol
sulfate,S1713ESs),17口一二氢马烯雌酮硫酸钠
(sodium17B—dlhydmequilinsulf~le,S17口OEQS)等
雌激素.共轭雌激素原料和片剂的含量的测定方法
有填充柱…,毛细管[,气相色谱法,而注射用倍
美力和倍美力软膏的含量测定方法国内外均未报
道.Wyeth—Ayerst公司一直采用比色法L4,5J,将共
轭雌激素硫酸钠通过酸水解成游离甾醇(软膏需要
经过多步提取分离再水解),萃取分离,分别与马
烯雌酮及铁一苯酚试剂反应比色,根据经验公式_5J
计算得雌酮硫酸钠和马烯雌酮硫酸钠的含量,操作
步骤多,耗时长,误差太.本报道的方法可同时测
定雌酮硫酸钠,马烯雌酮硫酸钠,17a一二氢马烯
雌酮3个主要成分和17a一雌二醇硫酸钠,1717一雌
二醇硫酸钠,178一二氢马烯雌酮硫酸钠等的含量,
具选择性高,灵敏度高,准确,快速的优点.
1仪器和试剂
HP5890lI型气相色谱仪;ttP3396A型积分仪;
氢火焰离子化
器.雌酮
品(批号J),马
烯雌酮标准品(批号J)和17a一二氢马烯雌酮标
准品(批号G一3)均为美国药典标准品,含量均
为1(30.O%.17a一雌二醇标准品(含量1(30.O%),
17B一雌二醇标准品(含量99.6%),17口一二氢马
烯雌酮标准品(含量99.7%)及3一甲氧基雌酮
(含量1(30.O%)为Wyeth—Ayerst公司提供.注射
用倍美力(规格:每瓶25哗),倍美力软膏(规
格:0.625tog?g)为加拿大Wyeth—Ayerst公司生
产.1%三甲基氯硅烷的双(三甲基硅烷)三氟乙
酰胺,购于R啼T~mologies公司,硫酸酯酶(10
000u?rIlLI1)购于Duper公司,其他均为分析纯.
2溶液配制
标准储备溶液:精密称取雌酮标准品6o哗,
马烯雌酮标准品27哗和17a一二氢马烯雌酮标准
品19nag,置500rIlL量瓶中,加乙醇溶解并稀释至
刻度,摇匀,作为标准储备溶液,置冰箱中半年内
使用.
内标溶液:精密称取3一甲氧基雌酮75mtg,
置500rIlL量瓶中,加乙醇溶解并稀释至刻度,摇
匀,置冰箱中半年内使用.
醋酸盐缓冲溶液:1m0l?L醋酸钠79r玎L和1
mDl?LI1醋酸21I玎L混合,加水至5(30IIlL,用1ml
?
L醋酸钠或1nKl?LI1醋酸调DH5.2.
系统适用性溶液:取17a一雌二醇标准品,1717
一
二氢马烯雌酮标准品和17D一雌二醇标准品适
量,用乙醇溶解制成浓度分别约为6?L一,4
?
L,,2?L的溶液,取该溶液1.0r玎L,标准储
备溶液1.0r玎L和内标溶液1.0IIlL,置10rIlL具塞
离心管中,摇匀,按标准溶液自”于50?氮气流
下吹干…”起操作.
标准溶液:精密吸取标准储备溶液1.0,2.0,
3.0,4.0,5.0,6.0rIlL分别置10rIlL具塞离心管
中,精密加入内标溶液1.0IIlL,摇匀,于50?氮
气流下吹干,加无水吡啶15uL及1%三甲基氯硅
烷的双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺65,立即密
塞,摇匀,静置15min,加甲苯0.5IIlL,摇匀.
19
无过氧化物的乙醚:乙醚100mL,加水5mL,
硫酸亚铁25,振摇,分离乙醚层.
3色谱条件及系统适用性
Rtx一225(15m×O.25irmfl×0.25tan)或0V
一
225(15m×0.25him×0.25tan)弹性石英毛细
管色谱柱;进样口温度250?,检测器温度270
?;炉温205?(维持10min);程序升温速率2
??m1m_.,终止温度23O?;进样分流比为1:5,
进样量1止;载气为氢气或氦气,柱头压85kPa,
在以上色谱条件下,系统适用性溶液及供试品溶液
的色谱图见图1,17a一雌二醇,178一雌二醇,17a
一
二氢马烯雌酮,17口一二氢马烯雌酮,雌酮和马
烯雌酮相对于内标的保留时间分别为0.395,
0.462,0.476,0.551,0.876,0.892;178一二氢马
烯雌酮,雌酮和马烯雌酮的理论塔板数分别为l8
730,21334和31011;雌酮和马烯雌酮的分离度
为2.8.
02040——————
13
I色谱
ng1cbI.?q
A系统适用性溶液色谱圈
(dmmm目哪0fsystem出H哆sdufian)
B.倍美力软膏供试品溶液色谱图
(啪m目曲?0f蛳1esolufi~0f?a螂口)
I.17a一雌二醇(17a—ed)217,8一雌二醇(17B—
earadi,J)317a一=氢马烯雌酮(17a一-ho?
4.1卵一二氢马烯雌酮(1邛一-,b-I)5.雌酮(nm)
6.马烯雌酮(呻n)(均以三甲基硅醚的形式存在,衄
删r0Bpc,ea~且Btdmethylsilyld)7.内标(哪号1日rdd)
4标准曲线的绘制
精密吸取标准储备溶液I.0,2.0,3.0,4.0,
5.0,6.0mL分别置10mL具塞离心管中,精密加
人内标溶液I.0mL,摇匀,按标准溶液自”于50
?氮气流下吹干…起操作.取标准溶液I分
别注人气相色谱仪,以各组分的质量与内标的质量
之比为横坐标,各组分的峰面积与内标的峰面积之
比为纵坐标,进行线性回归,得17a一二氢马烯雌
酮,雌酮,马烯雌酮的回归方程分别为:
Y=一0.03345+1.4514Xr=09995
y:一0.04348+1.2818Xr:0.9994
y=一0.03134+1.2585Xr=0.9997
17一二氢马烯雌酮在20—170ttg?mL_.,雌酮在8o
,
480g?mL..马烯雌酮在40—280ttg?mL..的浓度
范围内呈良好的线性关系.
5重现性
取注射用倍美力按样品测定项下方法,于日内
重复进样5次,测得S17aDEQS,SKSS,SEQS的日
内相对误差分别为0.36%,0.75%,1.28%,于0,
24,48h测得S17aDEQS,SESS,SEQS日间相对误
差分别为0.42%,0.86%,0.92%.
6回收率
采取标准加人法,精密吸取供试品溶液2mL4
份,分别置10mL具塞离心管中,精密加人标准储
备液1.0,2.0mL,精密加人内标溶液1.0mL,摇
匀,按标准溶液自”于50?氮气流下吹干…”起
操作,结果见表1.
表1回收率测定结果(=4
Tab1_Ieq删bclit=4
7样品测定
7.1注射用倍美力的含量测定取本品4瓶,置
100mL量瓶中,用醋酸盐缓冲液溶解并稀释至刻
度,摇匀.精密吸取2.0mL,置50mL量瓶中,加
醋酸盐缓冲液(pH5.2)8mL,氯化钡1g,振摇
20rain,加人硫酸酯酶25OO单位,在50?水浴中
振摇20rain,趁热精密加人二氯乙烷15.0mL,密
塞,振摇15min,离心10min至下层澄清,二氯乙
烷层通过无水硫酸钠快速过滤,滤液作为供试品溶
液.精密吸取样品溶液3.0mL,置5mL具塞离心
管中,精密加人内标溶液1.0mL摇匀,于50?氮
气流下吹干,加无水吡啶15止及1%三甲基氯硅
烷的双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺65血,立即密
塞,摇匀,静置15min,加甲苯0.5mL,摇匀.取
1止分别注人气相色谱仪,按内标法计算,测定
结果见表2.
药物分析杂志
表2注射用倍美力的台?霸定结果(标示量%.=4)
Tab2AmYn0f缸叫hie
(%出叫mt.=4)
7.2倍美力软膏的含量测定精密称取本品3.2g
(约相当于主药2),置装有15mL醋酸盐缓冲液
(pH5.2)的分液漏斗中,加氯化钡1g,振摇使溶
解,加入无过氧化物的乙醚50mL,振摇10-nirI,
去除乙醚层,另取无过氧化物的乙醚5omL×2重
复此操作.将水层转移至50mL量瓶,加入硫酸酯
酶25OO单位,按注射用倍美力的含量测定自”在
5o?水浴中振摇20milI…”起操作,测定结果见
表3.
表3倍美力软膏的含量霸定结果(标示量%,H;4l
Tab3A哪r0f岫血口m
(%出叫mt.=4)
8结果与讨论
8.1文献报道结合态雌激素原料中雌酮硫酸钠的
含量为52.5%,61.5%,马烯雌酮硫酸钠的含量为
22.5%一30.5%,17n一二氢马烯雌酮硫酸钠的含
量为13.5%一19.5%,17a一雌二醇硫酸钠的含量
为2.5%,9-5%,170一二氢马烯雌酮硫酸钠的含
量为0.4%4.O%【.本法测得倍美力注射液和倍
美力软膏中的雌酮硫酸钠的含量为57_8%一
60.%,马烯雌酮硫酸钠的含量为25.17%一
27.?%,17n一二氢马烯雌酮硫酸钠的含量为
12.88%一16.72%,17”一雌二醇硫酸钠的含量为
2.93%一3.23%,1713一二氢马烯雌酮硫酸钠的含
量为1.04%,1.48%,基本上与原料各组分比例一
致,且17口一雌二醇硫酸钠的含量未检测.由于倍
美力软膏的提取,分离和处理步骤较多,时间长,
获得游离雌激素后,在12h内硅烷化进行检测,
否则17”一=氢马烯雌酮硫酸钠的含量偏低.
8.2在同样色谱条件下,睾丸素可作为内标,与
组分一起参加甲基硅烷化后,在以上色谱条件下,
于雌酮前约1rain出峰,含量测定结果与本法相
同.
8.3雌激素硫酸盐也可通过酸水解得到甾醇,即
倍美力软膏通过多次分离乳酯,提取雌激素硫酸盐
至干品后J,注射用倍美力直接称取(相当于主药
3I唱)加甲醇20mL,水5mL,浓盐酸1mL,沸水
浴10m.m,立即用冰水浴冷却,10%硫酸调pH
1.0,苯提取定容,余下操作同本法.测得各组分
的含量略低于本法,可能是操作步骤长,水解条件
不易控制造成损失,而本法用硫酸酯酶水解具有专
一
,温和,简便,重现性好的优点.
8.4倍美力软膏在用硫酸酯酶水解之前,必须将
乳剂去除,我们分别采用乙醚,石油醚,正己烷作
为提取液,以乙醚的提取去除效果最好.
8.5氢气为载气较氦气分离效果好.
致谢:本文得到侯美琴主任,邱在峰主任的帮助和指导,
在此表示感谢14日修改回)
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andinPn目n日血CreamUsingGC一咖bTH?Iethyllylang
WNGjie,HUJI加一afId?J—hm
(sI:.斑归肺c帕,【咖2(10233)
A船哑0蜘dI:Themethylofthe0nof17”一曲df唧lilin,e~ilininpre~rinforin—
jectionandinpremarinc?usiJ1gGC—FIDbytrimethylsilylatingdeveloped.MeIh0d:Theconjugatedestn~m
Wel3~hydrolyT~dbysulfataseenzymetofreeestrogem,thefreeesm)gemweres1abedbybis(trimethyl
sily1)trifluo-
roacetanfidecontaining1%trimethyl—chlorosilaneincombinationwith3一O—methylestroneas0/1inl~llal$1andard.
thetrimethylsilylderivatiesweIechromatographed.Thegaschromatograph?a8equippedwithaflame—ionizationdetee-
torheldat205?f0r10mil1.andincreasedto230?by2?peramin.aO.251砌x15mfused—silicacapillarycol-
trainbondedwitha0.25tanlayerofRtxR一225O1”OV一225.1~tmtlts:17a—di}Iy出qIlil.m,equilin,estmlle,17a
—
estradiol,17p—eswadioland17p—diIlydloeqI山separatedanddaermlned.1kstandardcurvesforeslrone,
equilinand17a—dihydroequilinarelinearintherangeof帅一280’mL-.,40—280’mL-.,20—170Pg’mL
respectively.Theaveragerecoveriesofestvone,equih,17a—diI州roeqIlilIatdi~erentconcentration100.6%,
100.0%,100.2%respecvdy,theirRsDswe1.20%,0.98%,1.50%(n:8).Csmelmlon:Themethodis
simple,rapid,reliableandcorrect.
Keywords伽pi?afygasdl舶mato目rapby,conjugated髑血qlls,?njug删髓售e岫forinjection,conjugatedes
geminpremarincH?m.trimethylsilylafing
高效液相色谱法测定增效黄连素胶囊中盐酸小檗碱和甲氧苄啶的含量
许波高良美
(贵州省药品检验所贵阳5s}004)
摘要目的:建立吼c法测定增技黄连素腔囊中盐酸小檗碱和甲氧苄畦的含量.方法:采用ODS柱,以0.1%
十二烷基硫酸钠的甲醇一0.2r?L.1酒石酸(80:加)为流动相,流速为1.2mL?mill_..醋酸氢化可的松为内标
物,用紫外检测器于240嗽波长处检测.结果:盐酸小檗碱和甲氧苄畦的线性范围分别为
0.01,0.09mg?mLI1
和0.0晒0.045nag?mL_.,平均回收率分别为99.2%(RSD=0.93%)和100.5%(RsD=O.95%).结
论:本方法
快速,简便,准确.
关键词高技液相色谱法盐酸小檗碱甲氧苄啶醋酸氢化可的松
增效黄连素胶囊系采用中国贵州生长的天然中
药材提取之有效成分,配以抗菌增效剂而制成.其
主要成分盐酸小檗碱是毛莨科植物黄连,三角叶黄
连或云连的干燥根茎的主要成分,祖国医学记载其
具有清热,解毒,止泻的作用;而另一主要成分甲
氧苄啶具有很强的抗菌作用,同时它又能明显增强
盐酸小檗碱的抗菌,消炎和止泻作用.本品已收载
在贵州省药品标准…1995年版中,其中的含量测
定盐酸小檗碱采用剩余滴定法,而甲氧苄啶采用分
光光度法测定,其方法复杂,我们拟定了HPLG法
测定盐酸小檗碱和甲氧苄啶的含量,结果满意.
1仪器与试药
1.1仪器TSP—P4(]O0型高效液相色谱系列:
P4(]O0型泵,UV3000型二极管阵列检测器,TSP—
P4(]O0色谱数据处理工作站.
1.2样品与试剂对照品:盐酸小檗碱,甲氧苄
啶,醋酸氢化可的松(中国药品生物制品检定所),
增效黄连素胶囊(贵州缔谊药业有限公司,每粒含
盐酸小檗碱100nag,甲氧苄啶50嗽,批号:
980301,980701,9906O6,99O7O6),甲醇(眦
级),十二烷基硫酸钠(分析纯),酒石酸(分析
纯),重蒸馏水,乙醇(分析纯).
2色谱条件选择与色谱参数
2.1色谱条件色谱柱为中仪日立维修部Kromasil
一
100ClB(5gm,250lmx4.61nm),流动相为
0.1%十二烷基硫酸钠的甲醇一0.2mol?L-1酒石酸
(80:20),流速为1.2mL?mill-.,检测波长为240
nm,柱温为35?,进样量为1OIlL.
2.2色谱参数盐酸小檗碱,甲氧苄啶和醋酸氢
化可的松在以上色谱条件下的保留时间分别为
9.91,6.44,3.74血,柱效以盐酸小檗碱计算为6
791.
3方法与结果
3.1线性关系精密称取盐酸小檗碱对照品25nag